CN106754845B - 一种panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用，高产L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶(PanD)的系列重组大肠杆菌是通过易错PCR的随机突变改变panD基因的密码子碱基而获得。利用高产PanD的基因工程菌可以高效转化L‑天冬氨酸来生物法制备β‑丙氨酸，其中，编号为6‑85的重组大肠杆菌的PanD酶活达到250U/L、β‑Ala的产量达8.5g/L左右，比亲株分别提高了近4倍和3倍。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种β-丙氨酸的制备，特别涉及一种利用随机突变获得系列panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用。
(二)背景技术
β-丙氨酸，又称β-氨基丙酸，由Ross和Monroe于1972年首次发现，是自然界中唯一的β型氨基酸。β-丙氨酸是一种重要的化工原料和医药中间体，用于泛酸钙、肌肽、甜味剂等的合成，还被用作水的净化絮凝剂、电镀缓蚀剂等。目前，β-丙氨酸的工业化生产主要通过化学法合成，根据合成原料的不同可分为丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亚胺降解法、β-氨基丙腈法等。化学合成成本高、工艺要求严苛、产生大量腈类等有毒副产物，既不利于产品的分离纯化，又会导致严重的环境污染。
L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,简称PanD)能催化脱去L-天冬氨酸的α-羧基，产生β-丙氨酸和二氧化碳，因此，PanD能被用来生物法制备β-丙氨酸。上世纪七八十年代，Nakano、Williamson、Cronan等研究团队先后发现大肠杆菌能利用细胞内PanD合成β-丙氨酸，并对该酶的晶体结构和作用机理进行了研究。鉴于天然PanD的活性比较低，直接从自然界中获得产酶活力高的菌株比较困难，美国NSC技术有限公司在1996年首次通过基因重组技术，对大肠杆菌来源的panD基因进行了克隆表达，用于拆分DL-天冬氨酸。1999年，德国Dusch等人首次将谷氨酸棒杆菌来源的panD基因分别克隆到大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达。发明专利(裘娟萍、高丽娟；一种产β-丙氨酸的基因工程菌及其制备与应用；申请号：200610155551.0；申请日：2006-12-28)也公开了一株大肠杆菌panD基因在大肠杆菌中重组表达的菌株(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M206114)，并用于生物法制备β-丙氨酸。
尽管panD基因的重组表达在一定程度上提高了其在生物法制备β-丙氨酸中的能力，但天然序列和结构的PanD的重组表达量和活力目前还不够高，这限制了PanD在生物法制备β-丙氨酸中的应用。针对这个问题，国内外研究人员对panD基因进行了定点突变，以期研究PanD序列与功能的关系，为提高PanD的活力提供理论基础。定点突变是一种基于理性设计的分子改造。理性设计改善酶蛋白的酶学性质需要基于对蛋白的结构、功能和催化机制的掌握，根据蛋白的空间结构知识确定关键氨基酸位点进行取代、插入和缺失突变。因此，有效的理性设计需要大量的酶蛋白的信息、丰富的生物、物理和化学等学科知识储备及开阔的思维方式，往往难度较大；而且定点突变每次只有少数位点发生突变，对酶学性质的改造有限。相对而言，基于易错PCR的随机突变可在特定编码序列的多个位点产生随机突变，事先不需要对所改造蛋白的结构、功能和催化机制有深入了解，故其是一种较为理想的蛋白质定向进化方法。到目前为止，还未见用易错PCR的随机突变对PanD进行分子改造获得高活力PanD酶应用于β-丙氨酸的制备。
(三)发明内容
本发明目的是用易错PCR的随机突变改变panD基因的密码子碱基，从而提高重组大肠杆菌PanD的表达量，提供一系列panD突变基因和编码蛋白及提供一种高产PanD、制备β-丙氨酸的方法。
为了达到本发明的目的采用的技术方案是：
本发明提供一种panD突变基因，所述panD突变基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6之一所示，对应的panD突变基因所编码蛋白的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
本发明还涉及一种所述panD突变基因构建的重组载体及重组载体转化制备的重组基因工程菌。
此外，本发明还提供一种所述panD突变基因编码蛋白在生物法制备β-丙氨酸中的应用，所述应用以含panD突变基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以L-天冬氨酸为底物，以pH值为6～8(优选为7.0)的水为反应介质构成反应体系，于25～80℃，50～250rpm摇床转化12～72h(优选37℃、200rpm摇床转化48h)，使L-天冬氨酸脱羧，产生β-丙氨酸，转化结束，转化液分离纯化，获得β-丙氨酸。
进一步，所述湿菌体用量以反应体系体积计为2～50g/L，优选2g/L；所述底物终浓度以反应体系体积计为0.01～5mol/L，优选0.2mol/L。
进一步，所述酶源按如下步骤制备：(1)斜面培养：将含panD突变基因的重组大肠杆菌接种于斜面培养基，20～37℃培养12～24h(优选37℃培养12h)，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，琼脂15～25g/L，pH6～8，溶剂为水；优选所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，pH7，溶剂为水；(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基，20～37℃、100～250rpm摇床培养12～36h(优选37℃、200rpm摇床培养16h)，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，pH6～8，溶剂为水；优选所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH 7，溶剂为水；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1～10％(优选2％)的接种量接种至发酵培养基，20～37℃、100～250rpm摇床培养至OD600为0.2～1.0(优选37℃、200rpm摇床培养至OD600为0.6)，加乳糖至终浓度2～5g/L(优选3.5g/L)，继续培养4～48h(优选12h)，获得发酵液，将发酵液在5000～12000rpm离心2～10min(优选8000rpm离心5min)后，弃去上清，收集细胞，获得所述酶源；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，pH6～8，溶剂为水；优选所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏6g/L，蛋白胨12g/L，pH7，溶剂为水。
本发明所述panD突变基因是以大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-panD中panD基因为亲株A进行易错PCR反应，随机突变改变L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)基因的密码子碱基，筛选出PanD酶活和β-Ala产量与亲株A相比明显提高的突变株。易错PCR随机突变改变panD基因的密码子碱基的位置包含但不限于第10、90、114、212、253、286、306和321位。最终筛选获得突变株1-20、2-30、2-36、3-48、4-133、6-83和6-85，抽提质粒，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序确定突变的panD基因序列，分别发现突变株1-20第10位碱基A变成G(SEQ ID NO.1)，相应的氨基酸由苏氨酸变成丙氨酸(SEQ ID NO.7)；突变株2-30第212位碱基T变成C(SEQ ID NO.2)，相应的氨基酸由缬氨酸变成丙氨酸(SEQ ID NO.8)；突变株2-36第306位碱基A变成T(SEQ ID NO.3)，尽管氨基酸没变(SEQ ID NO.9)，但密码子稀有度发生了变化；突变株3-48第254位碱基T变成了C及第286位碱基G变成了A(SEQ ID NO.4)，相应的氨基酸分别由缬氨酸变成了丙氨酸、谷氨酸变成了赖氨酸(SEQ ID NO.10)；突变株4-133第90位碱基G变成了A及第321碱基T变成了C，尽管相应的氨基酸没变，但密码子稀有度发生了变化，另外，第253位碱基G还变成了T(SEQ ID NO.5)，相应的氨基酸由缬氨酸变成了异亮氨酸(SEQ ID NO.11)；突变株6-83和6-85都是第114位碱基T变成了A(SEQ ID NO.6)，尽管氨基酸没变(SEQ ID NO.12)，但通过RNA结构预测网站RNA Structure Webservers分别对亲株A和PanD表达最高突变株6-85的panD基因的mRNA进行二级结构预测，发现亲株A的panD基因的mRNA在114位碱基未形成发卡结构，而突变株6-85的panD基因mRNA的114位碱基形成了发卡结构。发夹结构会引起mRNA自由能的增加，从而提高mRNA的稳定性，由此提高目的蛋白的表达量。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一系列新的高产PanD的panD突变基因、编码蛋白及工程菌，利用所获工程菌高效转化L-Asp来制备β-Ala；初步的研究发现，其中活力最高的重组大肠杆菌6-85所产PanD的酶活近250U/L、β-Ala的产量达8.5g/L左右，而亲株A所产PanD的酶活仅为50U/L、β-Ala的产量为2.5g/L左右，分别提高了4倍和3倍。应用易错PCR技术对panD基因进行随机突变改造，获得了一系列PanD酶活明显提高的重组大肠杆菌，育种目标明确、效率高。
(四)附图说明
图1为亲株A(A)和代表性高产株大肠杆菌6-85(B)的panD基因在114位碱基附近mRNA二级结构预测结果；
图2为亲株A和PanD高产株所产PanD酶活和L-Asp转化率的比较。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：大肠杆菌panD基因突变体库的构建
(1)含大肠杆菌panD基因的pET28b(+)-panD质粒的获得：将大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-panD即亲株A(保藏号CCTCC NO：M206114，已在专利申请CN101210230A中公开)接种于LB液体培养基中，于37℃、200rpm转速下摇床培养12h，8000rpm离心5min，收集菌体细胞，用质粒抽提试剂盒(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)抽提质粒pET28b(+)-panD；取2μL质粒DNA用ND5000超微量紫外可见分光光度计(美国Bioteke公司)测定样品的浓度和纯度；LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0，卡那霉素50μg/mL，以水为溶剂。
(2)易错PCR反应的建立：(a)设计含有限制性酶切位点的正向引物(YCpanD-F:5’GACAGCAAATGGGTCGGGATCCTATGAT3’，下划线为BamH I酶切位点)和反向引物(YCpanD-R：5’GCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTAGCAAC3’，下划线为Hind III酶切位点)；(b)配制50μL的PCR反应混合液，内含(终浓度)：1×Taq DNA聚合酶缓冲液，1.0mmol/L Mn2+，0.12mmol/L dGTP，0.12mmol/L dATP，1.0mmol/L dCTP，1.0mmol/L dTTP，0.2μmol/L上游引物YCpanD-F，0.2μmol/L下游引物YCpanD-R，2ng/μL模板pET28b(+)-panD和0.1U/μL Taq DNA聚合酶，其余为无菌水；(c)将PCR反应混合液置于PCR仪上进行易错PCR扩增panD基因，扩增程序为：95℃变性10min，然后是35个循环，每个循环包括95℃变性60s，62℃退火45s，72℃延伸60s，循环结束后，72℃再延伸5min，然后保存在4℃下。扩增结束后，用浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳确证PCR产物大小；
(3)panD基因突变体库的构建：(a)用DNA纯化试剂盒纯化PCR扩增产物；取2μL纯化后PCR产物用ND5000超微量紫外可见分光光度计测定样品的浓度和纯度；(b)配制100μL的酶切反应混合液，用限制性内切酶BamH I和Hind III对步骤(a)的易错PCR产物和pET28b(+)载体分别进行双酶切，内含(终浓度)：1×Buffer K，50ng/μL易错PCR产物DNA或pET28b(+)，1U/μL BamH I和1U/μL Hind III，其余为无菌水；于37℃水浴中酶切4h；(c)将酶切产物在浓度为1.5％琼脂糖凝胶上电泳，验证酶切效果，并将目的片段切胶，分别用DNA凝胶回收试剂盒回收；取2μL回收产物用ND5000超微量紫外可见分光光度计测定样品的浓度和纯度；(d)用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)对酶切后线性化pET28b(+)载体进行去磷酸化处理，防止载体自连。配置50μL线性化pET28b(+)载体去磷酸化反应混合液，内含(终浓度)：1×Alkalin Phosphatase Buffer，0.05pmol/μL pET28b(+)双酶切纯化产物，1U/μL CIAP，其余为无菌水；于37℃水浴中反应4h。用DNA纯化试剂盒纯化去磷酸化的产物，并取2μL纯化后产物用ND5000超微量紫外可见分光光度计测定样品的浓度和纯度；(e)配置10μL的连接反应混合液，内含(终浓度)：1×T4Ligation Buffer，2ng/μL步骤(d)获得的双酶切后pET28b(+)，6ng/μL步骤(c)获得的双酶切易错PCR产物，10U/μL T4 DNA Ligase，其余为无菌水；于16℃水浴中反应12h。按TaKaRa公司高效感受态细胞制备试剂盒说明书手册制备感受态大肠杆菌BL21(DE3)；按《分子克隆实验指南》将连接产物转化至100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB固体培养基平板(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0，卡那霉素50μg/mL，以水为溶剂)，在37℃下正向放置1h以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜；(f)将转化平板上长出的所有转化子单菌落挑至含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上并划线，于37℃恒温培养箱倒置培养过夜。将长出的所有转化子用引物对YCpanD-F和YCpanD-R进行普通菌落PCR(《分子克隆实验指南》)鉴定，获得panD基因突变体库。
实施例2：高产PanD的基因工程菌的获得
将实施例1构建的突变体库中的转化子和亲株A分别接入3mL LB液体培养基中，加乳糖至终浓度3g/L，于37℃、200rpm转速下摇床培养1d。培养结束后，取1.5mL培养液至EP管中，8000r/min、4℃离心10min，收集细胞。加入300μL L-Asp使其终浓度为0.2mol/L，混匀后，于37℃，200rpm摇床转化12h。取50μL转化液按专利申请CN101210230A中所述的HPLC方法检测β-Ala和L-Asp含量，计算转化率，筛选出PanD酶活和β-Ala产量与亲株A相比明显提高的突变株。PanD酶活定义为在pH7.0、37℃的条件下，每升发酵液所得菌体每1h转化生成1μmol产物β-Ala所需酶量定义为一个酶活力单位(μmol·L-1·h-1)，简称为U。
式中，N为转化液β-Ala浓度(g/L)；V为转化液体积(L)；T为转化时间(h)，V’为发酵液体积(L)；M为β-Ala分子量(g/mol)。
结果如表1所示，共有7株突变株(1-20、2-30、2-36、3-48、4-133、6-83和6-85)的β-Ala产量和PanD酶活相较于亲株A有明显提高(提高30％以上)，其中，突变株6-85提高的最多。
表1突变株HPLC检测结果
注：菌株编号亲株A-1～亲株A-6表示不同批次发酵结果；加粗为筛选得到的高产菌
实施例3：PanD高产突变株panD基因序列的分析
将实施例2筛选的突变株1-20、2-30、2-36、3-48、4-133、6-83和6-85所含质粒按实施例1所述抽提方法获得，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序确定突变的panD基因序列，并用DNAman软件进行序列比对；突变位点密码子对应tRNA丰度通过Codon UsageDatabase查询获得，结果见表2。突变株1-20panD基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示；突变株2-30panD基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示；突变株2-36panD基因的核苷酸序列为SEQID NO.3所示，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示；突变株3-48panD基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示；突变株4-133panD基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示；突变株6-83和突变株6-85panD基因的核苷酸一样，序列为SEQ ID NO.6所示，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。
表2突变株panD突变位点分析
由表可见，突变株1-20第10位碱基A变成G，相应的氨基酸由苏氨酸变成丙氨酸；突变株2-30第212位碱基T变成C，相应的氨基酸由缬氨酸变成丙氨酸；突变株2-36第306位碱基A变成T，尽管氨基酸没变，但密码子稀有度发生了明显变化；突变株3-48第254位碱基T变成了C及第286位碱基G变成了A，相应的氨基酸分别由缬氨酸变成了丙氨酸、谷氨酸变成了赖氨酸；突变株4-133第90位碱基G变成了A及第321碱基T变成了C，尽管相应的氨基酸没变，但密码子稀有度发生了变化，另外，第253位碱基G还变成了T，相应的氨基酸由缬氨酸变成了异亮氨酸；突变株6-83和6-85都是第114位碱基T变成了A，尽管氨基酸没变，但通过RNA结构预测网站RNA Structure Webservers分别对亲株A和PanD表达最高突变株6-85的panD基因的mRNA进行二级结构预测，结果(图1)发现，亲株A的panD基因的mRNA在114位碱基未形成发卡结构，而突变株6-85的panD基因mRNA的114位碱基形成了发卡结构。发夹结构会引起mRNA自由能的增加，从而提高mRNA的稳定性，由此提高突变株6-83和6-85中PanD蛋白的表达量。
实施例4：PanD重组大肠杆菌在制备β-Ala中的应用
(1)酶源的制备：(a)斜面培养：将实施例2构建的重组大肠杆菌6-85接种于斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，pH7，溶剂为水；(b)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基，37℃、200rpm摇床培养16h，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH 7，溶剂为水；(c)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵培养基，37℃、200rpm摇床培养至OD600为0.6，加乳糖至终浓度3.5g/L，继续培养12h，获得PanD重组大肠杆菌发酵液；将1.5mL发酵液在8000rpm离心5min后，弃去上清，收集湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏6g/L，蛋白胨12g/L，pH7，溶剂为水。同样条件下，接种亲株A、重组大肠杆菌1-20、重组大肠杆菌2-30、重组大肠杆菌2-36、重组大肠杆菌3-48、重组大肠杆菌4-133和重组大肠杆菌6-83，分别获得发酵液。
(2)L-Asp的转化：6mg湿菌体中加入300μL L-Asp(用水配置，NaOH调pH至7.0)重悬细胞，并使L-Asp终浓度为0.2mol/L，混匀后，于37℃，200rpm摇床转化12h。取50μL转化液用HPLC方法检测β-Ala和L-Asp含量，计算PanD酶活和L-Asp的转化率，结果如图2所示。
由图2可知，亲株A的PanD酶活和L-Asp的转化率分别为27U/L和5.3％，而重组大肠杆菌1-20、2-30、2-36、3-48、4-133、6-83和6-85的PanD酶活和L-Asp的转化率都比亲株A高，尤其是重组大肠杆菌6-85，其PanD酶活和L-Asp的转化率分别为120U/L和20.6％，比亲株A提高了近4倍和3倍。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 一种panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (7)
1.一种panD突变基因，其特征在于所述panD突变基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6之一所示。
2.一种权利要求1所述panD突变基因构建的重组载体。
3.一种权利要求2所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
4.一种权利要求1所述panD突变基因在生物法制备β-丙氨酸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用以含panD突变基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以L-天冬氨酸为底物，以pH值为6～8的水为反应介质构成反应体系，于25～80℃，50～250rpm摇床转化12～72h，转化液分离纯化，获得β-丙氨酸。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于所述湿菌体用量以反应体系体积计为2～50g/L，所述底物终浓度以反应体系体积计为0.01～5mol/L。
7.如权利要求5所述应用，其特征在于所述酶源按如下步骤制备：(1)斜面培养：将含panD突变基因的重组基因工程菌接种于斜面培养基，20～37℃培养12～24h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，琼脂15～25g/L，pH6～8，溶剂为水；(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基，20～37℃、100～250rpm摇床培养12～36h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，pH6～8，溶剂为水；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至发酵培养基，20～37℃、100～250rpm摇床培养至OD600为0.2～1.0，加乳糖至终浓度2～5g/L，继续培养4～48h，获得发酵液，将发酵液在5000～12000rpm离心2～10min后，弃去上清，收集湿菌体，获得所述酶源；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，pH6～8，溶剂为水。
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