CN101899412A

CN101899412A - 一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌

Info

Publication number: CN101899412A
Application number: CN2009100904700A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 杨建明; 郑艳宁; 刘炜; 徐鑫
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2009-08-12
Filing date: 2009-08-12
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2029-08-12
Also published as: CN101899412B

Abstract

一种用于制备中碳脂肪醇的工程大肠杆菌和制备中碳脂肪醇的方法，该方法通过在大肠杆菌中过量表达硫脂酶基因，脂酰-CoA还原酶基因和脂肪醛脱羧酶基因等，使大肠杆菌获得生产生物汽油的能力，结合过量表达乙酰-CoA羧化酶基因并敲除大肠杆菌的脂酰-CoA脱氢酶基因，进一步提高工程大肠杆菌的生物汽油的生产能力。该方法可用于新一代生物汽油的的生产。

Description

一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌

技术领域

本发明涉及一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌。

本发明还涉及利用上述工程大肠杆菌制备生物汽油的方法。

背景技术

随着石油资源的日益减少和环境污染的日益加剧，生物液体燃料作为一种清洁的可再生能源，正受到世界各个国家的关注和重视。目前发展比较成熟的生物液体燃料包括生物乙醇和生物柴油(脂肪酸甲酯)，但乙醇的能量密度低，易吸水，不方便储存和运输，而生物柴油的黏度较大，容易凝固，会导致柴油机过滤器容易堵塞以及低温启动性能不佳(Atsumi etal.，2008；李春梅等，2008)。因此，有必要发展生物丁醇和生物汽油等新一代生物液体燃料以克服现有生物液体燃料的不足。生物汽油和化石汽油的组成成分相同，均为C8-C12的烷烃，因此利用生物汽油替代化石汽油不存在任何技术障碍。所生产的烷烃分泌到菌体细胞外，可以直接从培养液中萃取获得，简化了分离工艺，可以有效地降低生产成本。

利用大肠杆菌生产生物汽油的主要技术路线是将大肠杆菌产生的脂肪酸逐步还原为烷烃。大肠杆菌具有遗传背景清楚，生长速度快，可实现高密度培养的优点，因此可以很好的用于代谢产物的生产。烷烃生产中很关键的一步是脂肪酸的生产，而乙酰-CoA到丙二酰-CoA的转化，是脂肪酸生物合成中的限速酶。在大肠杆菌中过量表达乙酰-CoA羧化酶可以加快其脂肪酸合成的速率，从而使其积累更多的脂肪酸。

硫脂酶催化脂酰-ACP为游离脂肪酸，但是大肠杆菌自身的硫脂酶主要作用于C₁₆和C₁₈的脂酰-ACP，因此它主要积累C₁₆和C₁₈的脂肪酸。而据报道，U.californica，C.calophylla，C.hookeriana以及C.palustvis等生长的种子中积累癸酸和月桂酸等中短链脂肪酸(Voelker et al.，1992，Filichkin et al.，2005，Dehesh et al.，1996，Katayoon et al.，1996)。因此，在大肠杆菌中过量表达U.californica的硫脂酶基因BTE，或C.calophylla的Cc FatB₂，或C.hookeriana的Ch FatB₂，或C.palustvis的Cp FatB₁等便可以获得中短链的脂肪酸。

游离脂肪酸在大肠杆菌脂酰-CoA合成酶(fadD)的作用下活化为脂酰-CoA，它可继续在脂酰-CoA脱氢酶(fadE)的作用下转化为烯酰-CoA，从而进入β-氧化途径。脂酰-CoA是烷烃生物合成途径的一个中间物，有必要阻止脂酰-CoA进入降解代谢途径以积累脂酰-CoA用于短链烷烃的合成。

脂酰-CoA到烷烃的转化是在脂酰-CoA还原酶和脂肪醛脱羧酶的催化下完成的。脂酰-CoA还原酶催化脂酰-CoA生成脂肪醛，反应需要NADP⁺的参与，而脂肪醛脱羧酶催化脂酰醛脱羧生成烷烃，伴随CO的产生。但大肠杆菌自身并不存在这两个酶，需要表达外源的脂酰-CoA还原酶基因(acr1)和脂肪醛脱羧酶基因(CER1)才能在大肠杆菌内完成脂酰-CoA到烷烃的转化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌。

本发明的又一目的在于提供一种利用上述工程大肠杆菌制备中短链烷烃即生物汽油的方法。

为实现上述目的，本发明提供的用于制备生物汽油的工程大肠杆菌，通过下述方法得到：

通过PCR(聚合酶链式反应)扩增乙酰-CoA羧化酶基因、硫脂酶基因、脂酰-CoA还原酶基因和脂肪醛脱羧酶基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和原核表达载体pET-30a(+)或pACYCDuet-1，载体片断胶回收后，将载体∶基因片段按摩尔比为1-2∶4-5的比例混合，加入T4 DNA连接酶后4-7℃连接15-30小时，连接产物38-42℃热击转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布平板培养过夜，PCR筛选阳性克隆；阳性克隆提取质粒DNA，酶切和测序鉴定后，热击转化E.coliBL21(DE3)，最后敲除该工程大肠杆菌的fadE基因后即得目标工程大肠杆菌。

硫脂酶基因为来源于Umbellularia californica的BTE基因，或来源于Cuphea calophylla的Cc FatB₂基因，或来源于Cuphea hookeriana的Ch FatB₂基因，或来源于Cuphea palustvis的Cp FatB₁基因，或同BTE，Cc FatB₂，Ch FatB₂和Cp FatB_l同源性超过70％的DNA序列。

脂酰-CoA还原酶基因为来源于Acinetobacter calcoaceticus的acr1基因，或同acr1基因同源性超过70％的DNA序列。

脂肪醛脱羧酶基因为来源于Arabidopsis thaliana的CER1基因，或同CER1基因同源性超过70％的DNA序列。

乙酰-CoA羧化酶基因为来源于A.calcoaceticus的accABCD基因，或来源于E.coli的accABCD基因，或来源于Corynebacterium glutamicum的dtsR1-accBC基因，或同这些基因同源性超过70％的DNA序列。

脂酰-CoA脱氢酶基因为大肠杆菌的fadE基因。

本发明提供的利用上述工程大肠杆菌制备中短链烷烃即生物汽油的方法，是将构建好的工程大肠杆菌以1-2∶100-130的比例接种内含卡那霉素和氯霉素的M9液体培养液中，35-37℃，225rpm条件下培养至OD_600nm为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-0.2mmol·L^-1，诱导目的蛋白的过量表达，然后转入28-30℃，225rpm继续培养18-24小时；培养后的菌液离心取上清液，用等体积的正己烷萃取，减压蒸发除去正己烷后制得生物汽油。

与公知技术相比，本发明具有以下优点：

1)所生产的生物汽油为C₈-C₁₂的烷烃，和化石汽油组分相同。

2)烷烃分泌到胞外，并达到了较高的浓度，便于分离。

3)所获工程大肠杆菌能高效利用半纤维素和纤维素水解得到所有碳水化合物，对解决生物质经济中“全糖转化利用”很有价值。

附图说明

图1是在实施例1中构建pA-accABCD表达载体过程的示意图；

图2是在实施例1中构建pET-acr1/BTE/CER1表达载体过程的示意图。

具体实施方式

本发明是通过在大肠杆菌中过量表达乙酰-CoA羧化酶，硫脂酶，脂酰-CoA还原酶和脂肪醛脱羧酶，并失活大肠杆菌的脂酰-CoA脱氢酶，使大肠杆菌能够高效地将糖类转化为C₈-C₁₂的中短链烷烃。

本发明中具有烷烃生产能力的工程大肠杆菌，通过以下方法构建而成：通过PCR扩增乙酰-CoA羧化酶基因，硫脂酶基因，脂酰-CoA还原酶基因和脂肪醛脱羧酶基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和原核表达载体pET-30a(+)或pACYCDuet-1，载体片断胶回收后，将载体：基因片段按摩尔比为1∶5的比例混合，加入T4 DNA连接酶后4℃连接过夜，连接产物42℃热击转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布平板培养过夜，PCR筛选阳性克隆。阳性克隆提取质粒DNA，酶切和测序鉴定后，热击转化E.coli BL21(DE3)，最后敲除该工程大肠杆菌的fadE基因后即得目标工程大肠杆菌。

构建好的工程大肠杆菌以1∶100的比例接种内含卡那霉素和氯霉素的M9液体培养液中，37℃，225rpm条件下培养至OD_600nm为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol·L^-1，诱导目的蛋白的过量表达，然后转入30℃，225rpm继续培养18-24小时。培养后的菌液12000g离心10分钟，取上清液，用等体积的正己烷萃取2-3次，减压蒸发除去正己烷后，制得中短链烷烃，所得烷烃通过GC-MS分析其组成及含量。正己烷减压蒸馏后回收使用。

本发明提供的方法，是在大肠杆菌中表达了调控脂肪酸生物合成以及控制脂肪酸链长以及还原脂肪酸的一系列关键酶基因。所获得的工程大肠杆菌可高密度培养，生长速度快，可很好的用于生物汽油的生产。

以下将以实施例方式，并以实施例1为例附图详细描述本发明：

实施例1

通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，U.californica的BTE基因，A.calcoaceticus的acr1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中短链烷烃。

1.1)外源基因的克隆和表达载体的构建

1.1.1)外源基因的克隆

1.1.1.1)A.calcoaceticus乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆

提取A.calcoaceticus基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增下列基因：

accA：acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alpha subunit)GeneID(NCBI)：2878570；

accBC(含accB和accC基因)：accB：biotin carboxyl carrier protein ofacetyl-CoA，GeneID(NCBI)：2878571；accC：acetyl-CoA carboxylase，GeneID(NCBI)：2878572；

accD：acetyl-CoA carboxylase，beta subunit，GeneID(NCBI)：2878573。

再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。

1.1.1.2)硫脂酶基因的克隆

提取U.californica的总mRNA，然后反转录为cDNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增克隆其硫脂酶基因BTE，GI(NCBI)：170555，再利用胶回收试剂盒回收目的基因。

1.1.1.3)脂酰-CoA还原酶基因的克隆

提取A.calcoaceticus基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脂酰-CoA还原酶基因acr1，GI(NCBI)：1684885，再利用胶回收试剂盒回收目的基因。

1.1.1.4)脂肪醛脱羧酶基因的克隆

提取A.thaliana的总mRNA，然后反转录为cDNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脂肪醛脱羧酶基因CER1，GI (NCBI)：145334982，再利用胶回收试剂盒回收目的基因。

1.1.2)表达载体的构建

1.1.2.1)pA-accABCD表达载体的构建(请参阅图1)

1.1.2.1.1)pA-accA载体的构建

将胶回收后的accA基因与pACYCDuet-1载体(Novagen)用BamH I和Sac I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-accA后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

1.1.2.1.2)pA-accABC载体的构建

将胶回收后的accBC基因与pA-accA载体用Nde I和Xho I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-accABC后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

1.1.2.1.3)pA-accD载体的构建

将胶回收后的accD基因与pACYCDuet-1载体(Novagen)用BamH I和Sac I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-accD后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

1.1.2.1.4)pA-accABCD表达载体的构建

以pA-accD重组质粒为模板，扩增含有T7启动子的accD基因即T7-accD，用Sal I和Afl II分别双酶切T7-accD和pA-accABC，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-accABCD后，再通过限制性酶切和测序鉴定pA-accABCD。

1.1.2.2)pET-acr1/BTE/CER1表达载体的构建(请参阅图2)

1.1.2.2.1)pET-acr1表达载体的构建

分别将胶回收后的acr1基因与pET-30a(+)载体用BamH I和EcoR I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-acr1后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-acr1。

1.1.2.2.2)pET-BTE表达载体的构建

分别将胶回收后的BTE基因与pET-30a(+)载体用Nde I和Not I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-BTE后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-BTE。

1.1.2.2.3)pET-CER1表达载体的构建

分别将胶回收后的CER1基因与pET-30a(+)载体用Not I和Xho I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-CER1后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-CER1。

1.1.2.2.4)pET-acr1/BTE表达载体的构建

以pET-BTE为模板，PCR扩增含有T7启动子的BTE基因T7-BTE，再分别和载体pET-acr1用Sal I和Not I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-acr1/BTE后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-acr1/BTE。

1.1.2.2.5)pET-acr1/BTE/CER1表达载体的构建

以pET-CER1为模板，PCR扩增含有T7启动子的CER1基因T7-CER1，再分别和载体pET-acr1/BTE用Not I和Xho I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-acr1/BTE/CER1后，再通过限制性酶切和测序鉴定pET-acr1/BTE/CER1。

1.2)pA-accABCD和pET-acr1/BTE/CER1共同转化大肠杆菌

pET-acr1/BTE/CER1热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆的质粒后再通过酶切和测序鉴定；然后将pA-accABCD重组质粒热击转化含有pET-acr1/BTE/CER1的大肠杆菌感受态细胞，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆的质粒后再通过酶切和测序鉴定。由此获得了含有pA-accABCD和pET-acr1/BTE/CER1两个表达载体的工程大肠杆菌。

1.3)大肠杆菌fadE基因的敲除

采用TargeTron^TM基因敲除系统(Sigma-Aldrich)对大肠杆菌的fadE基因进行敲除。

1.4)SDS-PAGE鉴定目标蛋白的表达

将活化后的工程大肠杆菌按1∶100的接种量接种到10mL LB液体培养液中(内含50μg·mL^-1的卡那霉素和34μg·mL^-1氯霉素)，37℃，225rpm振荡培养2h，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L^-1，然后转入30℃，225rpm继续培养3-4h，诱导表达目的蛋白。取出诱导后的培养物，12000g离心2min，收集菌体，菌体细胞用0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤一次，按1∶10的比例再用此缓冲液重悬细胞，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min，瞬时高速离心，10％SDS-PAGE电泳检测，即可检测到目标蛋白的表达。

1.5)工程大肠杆菌的培养

将活化后工程大肠杆菌按1∶100的比例接种到M9液体培养液中(内含50μg·mL^-1的卡那霉素和34μg·mL^-1氯霉素)，37℃，225rpm条件下振荡培养，当OD_600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L^-1，然后转入在30℃，225rpm条件下，继续培养18-24h。

1.6)烷烃的提取

诱导培养后的菌液在12000g条件下，离心10min，收集上清液，并用等体积的正己烷萃取2-3次，旋转蒸发除去正己烷后即得中短链烷烃。正己烷回收利用。

1.7)烷烃组成及含量的测定

得到的烷烃通过GC-MS测定其组成及含量。

实施例2

通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.calophylla的Cc FatB₂基因，A.calcoaceticus的acr1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中短链烷烃。方法过程同实施例1。

实施例3

通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.hookeriana的Ch FatB₂基因，A.calcoaceticus的acr1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中短链烷烃。方法过程同实施例1。

实施例4

通过在大肠杆菌中共同过量表达A.calcoaceticus的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.palustvis的Cp FatB₁基因，A.calcoaceticus的acr1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中短链烷烃。方法过程同实施例1。

实施例5

通过在大肠杆菌中共同过量表达E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，U.californica的BTE基因，A.calcoaceticus的acr1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中短链烷烃。方法过程同实施例1。

实施例6

通过在大肠杆菌中共同过量表达E.coli的乙酰-CoA羧化酶基因(accABCD)，C.calophylla的Cc FatB₂基因，A.calcoaceticus的acr1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中短链烷烃。方法过程同实施例1。

实施例7

实施例8

实施例9

通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，U.californica的BTE基因，A.calcoaceticus的acr1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中短链烷烃。

9.1)外源基因的克隆和表达载体的构建

9.1.1)外源基因的克隆

9.1.1.1)C.glutamicum乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆

提取C.glutamicum基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增下列基因：

dtsR1：acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyltransferase(alphasubunit)，GeneID(NCBI)：3345446；

accBC：biotin carboxylase和biotin carboxyl carrier protein，GeneID(NCBI)：3343021。

再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。

9.1.1.2)硫脂酶基因的克隆

9.1.1.3)脂酰-CoA还原酶基因的克隆

9.1.1.4)脂肪醛脱羧酶基因的克隆

9.1.2)表达载体的构建

9.1.2.1)pA-dtsR1/accBC表达载体的构建

9.1.2.1.1)pA-dtsR1载体的构建

将胶回收后的dtsR1基因用Pag I和BamH I进行双酶切，载体pACYCDuet-1(Novagen)用Nco I和BamH I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-dtsR1后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

9.1.2.1.2)pA-dtsR1/accBC载体的构建

分别将胶回收后的accBC基因与pA-dtsR1载体用Mun I和Pac I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-dtsR1/accBC后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

9.1.2.2)pET-acr1/BTE/CER1表达载体的构建(请参阅图2)

9.1.2.2.1)pET-acr1表达载体的构建

9.1.2.2.2)pET-BTE表达载体的构建

9.1.2.2.3)pET-CER1表达载体的构建

9.1.2.2.4)pET-acr1/BTE表达载体的构建

9.1.2.2.5)pET-acr1/BTE/CER1表达载体的构建

9.2)pA-dtsR1/accBC和pET-acr1/BTE/CER1共同转化大肠杆菌

pET-acr1/BTE/CER1热击转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆的质粒后再通过酶切和测序鉴定；然后将pA-dtsR1/accBC重组质粒热击转化含有pET-acr1/BTE/CER1的大肠杆菌感受态细胞，通过PCR筛选获得阳性克隆，提取阳性克隆的质粒后再通过酶切和测序鉴定。由此获得了含有pA-dtsR1/accBC和pET-acr1/BTE/CER1两个表达载体的工程大肠杆菌。

9.3)大肠杆菌fadE基因的敲除

9.4)SDS-PAGE鉴定目标蛋白的表达

9.5)工程大肠杆菌的培养

将工程大肠杆菌按1∶100的比例接种到M9液体培养液中(内含50μg·mL^-1的卡那霉素和34μg·mL^-1氯霉素)，37℃，225rpm条件下振荡培养，当OD_600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L^-1，然后转入在30℃，225rpm条件下，继续培养18-24h。

9.6)烷烃的提取

9.7)烷烃组成及含量的测定

得到的烷烃通过GC-MS测定其组成及含量。

实施例10

通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，C.calophylla的Cc FatB₂基因，A.calcoaceticus的acr1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中短链烷烃。方法过程实施例9。

实施例11

通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，C.hookeriana的Ch FatB₂基因，A.calcoaceticus的acr1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中短链烷烃。方法过程同实施例9。

实施例12

通过在大肠杆菌中共同过量表达C.glutamicum的乙酰-CoA羧化酶基因(dtsR1-accBC)，C.palustvis的Cp FatB₁基因，A.calcoaceticus的acr1基因和A.thaliana的CER1基因，并敲除大肠杆菌的fadE基因以用于生物合成中短链烷烃。方法过程同实施例9。

Claims

1.一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌，通过下述方法得到

通过聚合酶链式反应扩增乙酰-CoA羧化酶基因、硫脂酶基因、脂酰-CoA还原酶基因和脂肪醛脱羧酶基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和原核表达载体pET-30a(+)或pACYCDuet-1，载体片断胶回收后，将载体∶基因片段按摩尔比为1-2∶4-5的比例混合，加入T4DNA连接酶后4-7℃连接15-30小时，连接产物38-42℃热击转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布平板培养过夜，PCR筛选阳性克隆；阳性克隆提取质粒DNA，酶切和测序鉴定后，热击转化E.coli BL21(DE3)，最后敲除该工程大肠杆菌的fadE基因后即得目标工程大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的工程大肠杆菌，其中，该工程大肠杆菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后过量表达硫脂酶。

3.根据权利要求1所述的工程大肠杆菌，其中，该工程大肠杆菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后过量表达脂酰-CoA还原酶。

4.根据权利要求1所述的工程大肠杆菌，其中，该工程大肠杆菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后过量表达脂肪醛脱羧酶。

5.根据权利要求1所述的工程大肠杆菌，其中，该工程大肠杆菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后过量表达乙酰-CoA羧化酶。

6.根据权利要求1所述的工程大肠杆菌，其中，工程大肠杆菌通过摇瓶或发酵罐进行培养。

7.一种利用权利要求1所述工程大肠杆菌制备生物汽油的方法，将构建好的工程大肠杆菌以1-2∶100-130的比例接种内含卡那霉素和氯霉素的M9液体培养液中，35-37℃，225rpm条件下培养至OD_600nm为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-0.2mmol·L^-1，诱导目的蛋白的过量表达，然后转入28-30℃，225rpm继续培养18-24小时；培养后的菌液离心取上清液，用等体积的正己烷萃取，减压蒸发除去正己烷后制得生物汽油。

8.根据权利要求7所述制备生物汽油的方法，其中，生物汽油为C₈-C₁₂的烷烃

9.根据权利要求7所述制备生物汽油的方法，其中，正己烷经过减压蒸馏后回收使用。

10.根据权利要求7所述的制备生物汽油的方法，其中，所得脂肪醇通过GC-MS分析其组成及含量。