CN117025691A

CN117025691A - 热丁酸梭菌在制备氢气中的用途和方法

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Publication number: CN117025691A
Application number: CN202311097183.9A
Authority: CN
Inventors: 刘莉; 张斯颖; 陈奕妃; 王娜; 史吉平
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2023-08-29
Filing date: 2023-08-29
Publication date: 2023-11-10
Anticipated expiration: 2043-08-29
Also published as: CN117025691B

Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，特别是涉及热丁酸梭菌在制备氢气中的用途和方法，所述热丁酸梭菌为热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1，保藏编号为CCTCC NO：M2022030，本发明的热丁酸梭菌可以有效强化有机固废厌氧发酵产氢过程，提高氢气产量，对氢气产量的提高率最高达28.57％，处理效率高、经济效益好、操作方便、无污染，提升底物利用率，实现有机固废的资源化和无害化，具有较高的应用价值。

Description

热丁酸梭菌在制备氢气中的用途和方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，特别是涉及热丁酸梭菌在制备氢气中的用途和方法。

背景技术

随着人口的持续增长、经济的快速发展和城市化进程的逐步加快，有机固废的产生量逐年增加。有机固废具有高有机物含量的特点，如果不及时处理，易腐烂变质，产生恶臭气味并滋生细菌和蚊虫，不仅会造成严重的环境污染，还会危害人类健康。妥善、科学、有效地处理有机固废，不仅能够变废为宝,还可以减轻环境压力、生产具有更高价值的能源产品，真正实现有机固废的无害化和资源化，适应循环经济的发展。

近年来厌氧发酵技术逐渐成为有机固废处理的主流技术，其在处理有机固废的同时还可以生产清洁能源，例如氢气和甲烷，是实现碳中和的有效途径之一。氢气是一种很有前景的清洁能源，它比化石燃料等传统能源具有更高的能量，因此利用有机固废厌氧发酵产氢技术引起了广泛的关注。该技术在密闭的厌氧发酵设备中，通过兼性和厌氧微生物的分解代谢作用将大分子有机物转化为氢气，由于发酵环境密闭，不会对大气环境产生污染，是一种环境友好型的处理方式。有机固废厌氧发酵产氢过程依靠一系列不同功能微生物的协同作用来完成，微生物的数量和活性决定了产氢能力。但是由于有机固废的组成成分复杂且功能微生物活性低、数量少，导致产氢的效率较低。所以亟需针对功能微生物缺失的问题对厌氧发酵产氢技术进行改进，提高产氢效率。

除了优化发酵系统的工艺参数外，生物强化也被应用在厌氧发酵产氢技术中，其可以通过在厌氧消化系统中加入经过筛选、优化的优势功能微生物的纯培养物，缩短发酵系统的启动时间，提高底物的降解效率，提升厌氧发酵系统的性能，从而实现提高氢气产量的目的。微生物强化技术的作用效果明显，操作简单，具有良好的应用前景。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供热丁酸梭菌在制备氢气中的用途和方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供热丁酸梭菌Clostridiumthermobutyricum HK1或其菌剂在制备氢气中的用途，所述热丁酸梭菌Clostridiumthermobutyricum HK1保藏编号为CCTCC NO：M 2022030。

优选的，所述用途为热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1利用有机固废发酵制备氢气中的用途。

优选的，所述有机固废选自餐厨垃圾、秸秆或粪便。

本发明还提供一种有机固废发酵制备氢气的方法，包括如下步骤：将保藏编号为CCTCCNO：M 2022030的热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1或其菌剂与有机固废和厌氧活性污泥混合得到厌氧发酵体系进行厌氧发酵，收集发酵产生的气体即获得氢气。

优选的，所述厌氧发酵温度为30～60℃；发酵时厌氧发酵体系中pH值为4～7；发酵的时间为36小时以上。

如上所述，本发明的热丁酸梭菌在制备氢气中的用途和方法，具有以下有益效果：

(1)热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1可以有效强化有机固废厌氧发酵产氢过程，提高氢气产量，提升底物利用率，实现有机固废的资源化和无害化，具有较高的应用价值。

(2)利用热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1强化有机固废厌氧发酵产氢，对氢气产量的提高率最高达28.57％，处理效率高、经济效益好、操作方便、无污染。

附图说明

图1为菌株HK1强化餐厨垃圾厌氧发酵的累积氢气产量；

图2为菌株HK1对餐厨垃圾厌氧发酵产氢的变化情况；

图3为菌株HK1对厨余垃圾厌氧发酵产氢的变化情况；

图4为菌株HK1对秸秆和畜禽粪污厌氧发酵产氢的变化情况。

具体实施方式

本发明提供热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1或其菌剂在制备氢气中的用途，所述热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1保藏编号为CCTCC NO：M2022030。

所述热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，菌种名称为Clostridium thermobutyricum HK1，保藏日期为2022年1月6日，保藏编号为CCTCC NO：M 2022030，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

所述热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

所述热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1为革兰氏阳性菌，厌氧菌，菌落形态为白色不规则圆形，表面光滑湿润无光泽，边缘整齐无褶皱。

在本发明的某些实施方式中，所述菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂中热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1的浓度至少为1×10⁸CFU/mL。

在本发明的某些实施方式中，所述液体菌剂可以通过如下制备方法获得：将热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1的纯菌种接种于液体培养基中培养，培养结束后即得到菌剂。

在一种实施方式中，将所述热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1的纯菌种接种至液体培养基中培养后，再将培养液接种至另一液体培养基扩大培养，经过多次扩大培养结束后获得菌剂。

在一种实施方式中，所述培养为厌氧培养。

在一种实施方式中，培养的温度为30～60℃。具体的，培养温度例如为30～35℃、35～40℃、40～45℃、45～50℃、50～55℃、55～60℃。

在一种实施方式中，将所述热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1的纯菌种接种至液体培养基中培养20～28h后再接种至另一液体培养基中扩大培养。

在一种实施方式中，经过2～6次扩大培养即可得到该菌株的菌剂。

在一种实施方式中，以液体培养基的总体积为基准，液体培养基的配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨3g/L，牛肉粉2g/L，酵母粉3g/L，NaCl 4g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，K₂HPO₄ 0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，半胱氨酸0.25g/L。

在本发明的某些实施方式中，所述菌剂为固体菌剂。所述固体菌剂为液体菌剂经干燥后得到的菌粉。

在本发明的某些实施方式中，所述热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricumHK1或其菌剂在制备氢气中的用途具体为利用有机固废发酵制备氢气中的用途。

本发明中，所述有机固废选自餐厨垃圾、秸秆或粪便。

在一种实施方式中，所述餐厨垃圾选自餐饮垃圾、厨余垃圾。

在一种实施方式中，所述秸秆选自小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆、棉花秸秆、甘蔗秸秆中的任一种或多种。

在一种实施方式中，所述粪便选自畜禽粪便。所述畜禽粪便选自猪粪、牛粪、羊粪、鸡粪或鸭粪中的一种或多种。

在本发明的某些实施方式中，所述用途为利用有机固废厌氧发酵制备氢气中的用途。

在一种实施方式中，所述厌氧发酵温度为30～60℃。所述厌氧发酵温度选自以下任一范围30～35℃、35～40℃、40～45℃、45～50℃、50～55℃、55～60℃。

在一种实施方式中，发酵时厌氧发酵体系中pH值为4～7。例如pH值为4～5、5～6或6～7。所述pH值优选为5～6.5。

在一种实施方式中，所述厌氧发酵的发酵时间可根据物料的不同具体确定。

在一种实施方式中，发酵的时间为36小时以上。发酵时间例如为36～72小时、72～96小时或96小时以上。

所述厌氧发酵体系中包括有机固废、厌氧活性污泥、热丁酸梭菌Clostridiumthermobutyricum HK1或其菌剂。

所述菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂的接种质量为有机固废和厌氧活性污泥总质量的0.5～10％。所述液体菌剂的接种质量为有机固废和厌氧活性污泥总质量0.5～2％、2～4％、4～6％、6～8％、8～10％。

所述有机固废和厌氧活性污泥中挥发性固体的质量比为(2～10):1。例如，所述有机固废和厌氧活性污泥中挥发性固体的质量比选自以下任一范围：(2～4):1、(4～6):1、(6～8):1、(8～10):1。优选的，质量比为(3～6)：1。

所述厌氧活性污泥由兼性厌氧菌和专性厌氧菌与有机物形成的污泥颗粒，呈灰色至黑色。厌氧活性污泥中微生物菌群主要包括水解菌、产酸菌、产氢菌等。

在一种实施方式中，所述厌氧活性污泥为取自餐厨垃圾处理厂厌氧发酵罐中的厌氧活性污泥。所述厌氧活性污泥的总固体(TS)含量为10～20％，挥发性固体(VS)含量为5～15％，pH值为7～9。

在一种实施方式中，所述厌氧发酵为干式厌氧发酵。所述干式厌氧发酵为发酵体系中有机固体废弃物的总固体浓度(TS)为15％以上。

本发明还提供一种有机固废发酵制备氢气的方法，包括如下步骤：将所述热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricum HK1或其菌剂与有机固废和厌氧活性污泥混合得到厌氧发酵体系进行厌氧发酵，收集发酵产生的气体即获得氢气。

在一种实施方式中，所述菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂的接种质量为有机固废和厌氧活性污泥总质量的0.5～10％。

在一种实施方式中，所述有机固废和厌氧活性污泥按照挥发性固体的质量比为(2～10)：1混合。

在一种实施方式中，所述厌氧活性污泥的总固体(TS)含量为10～20％，挥发性固体(VS)含量为5～15％，pH值为7～9。

在一种实施方式中，所述厌氧发酵温度为30～60℃。

在一种实施方式中，厌氧发酵产氢气为在厌氧发酵容器中发酵。发酵时间可根据物料的不同具体确定。

在一种实施方式中，发酵的时间为36小时以上。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明的菌株为申请号2022112879438发明专利中的菌株。

实施例1：厌氧发酵产氢菌的分离筛选及性能验证

以培养基的总体积为基准计算，所用到的各培养基及成分如下：

液体培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨3g/L，牛肉粉2g/L，酵母粉3g/L，NaCl 4g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，K₂HPO₄ 0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，半胱氨酸0.25g/L，自然pH值。

固体培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨3g/L，牛肉粉2g/L，酵母粉3g/L，NaCl 4g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄ 0.75g/L，K₂HPO₄ 0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，半胱氨酸0.25g/L，琼脂粉15g/L，自然pH值。

以上培养基配制好后，均在115℃下高压蒸汽灭菌20min，备用。

所用到的餐厨垃圾取自上海某单位食堂的剩饭、剩菜，该餐厨垃圾的总固体(TS)含量23.72％，挥发性固体(VS)含量为21.76％，pH值为5.26。总固体含量是指将样品在105℃烘干至恒重时残留的物质质量与样品质量的比值；挥发性固体含量是指样品总固体中能在550℃高温下挥发的物质质量与样品质量的比值。

所用到的厌氧活性污泥取自上海某餐厨垃圾处理厂厌氧发酵罐中。该厌氧活性污泥的TS含量12.9％，VS含量为8.10％，pH值为7.8。

菌种的分离筛选：取5mL厌氧活性污泥，置于装有45mL无菌水的厌氧瓶中，于55℃、150r/min摇床中放置1h，使菌种均匀分散于液体中。对液体进行稀释，依次制成一系列稀释液。适当选取3-4个稀释浓度，用移液枪分取100μL稀释液接种于固体培养基上，用灭菌的涂布棒将稀释液涂布均匀，倒置放在55℃厌氧培养箱中培养48h。根据平板上的菌落形态，挑取形态大小不同的菌落，划线纯化后编号保藏。经分离纯化共得到7个菌株。

菌种强化厌氧发酵产氢性能测定：将分离纯化得到的菌株接种至液体培养基中，在55℃培养箱中厌氧静置培养24h，菌液备用。将餐厨垃圾与厌氧活性污泥按照VS的质量比为3：1混合均匀后，置于厌氧发酵瓶中。按照餐厨垃圾与厌氧活性污泥总体积的10％取各菌株的菌液，离心，将菌体沉淀用菌液1/10体积的无菌水重悬，菌悬液接种至前述厌氧发酵瓶中。厌氧发酵瓶中厌氧发酵体系的工作体积为400mL。实验设置实验组、对照组和空白组。实验组厌氧发酵体系包括分离纯化得到的菌株、厌氧活性污泥、餐厨垃圾，对照组包括与实验组中菌株同体积的无菌水、厌氧活性污泥、餐厨垃圾，空白组为不含餐厨垃圾和菌液的单一厌氧活性污泥发酵体系，剩余体积用无菌水补齐，于55℃厌氧发酵。发酵过程中用气袋收集产生的气体，每6h测量气体体积，并利用气相色谱仪测量气体中的氢气含量(％)，利用产生的气体总量乘以氢气含量计算得到氢气产量。气相色谱条件为：日本岛津TDX-01不锈钢色谱柱(2m×2mm)，TCD检测器，进样口和检测器温度为150℃，柱温120℃，载气为氩气。计算各菌株的累积氢气产量，与不加菌的对照组相比，评价各个菌株强化餐厨垃圾厌氧发酵产氢气的性能。

由图1可以看出，厌氧发酵72h后菌株热丁酸梭菌Clostridium thermobutyricumHK1的累积氢气产量最高，达到106.30NmL g^-1VS，与对照组累积氢气产量84.61NmL g^-1VS相比，提高了25.63％，说明菌株HK1具有显著的强化餐厨垃圾厌氧发酵产氢气的效果。

实施例2：菌株HK1的液体菌剂的制备

液体菌剂的制备：将HK1纯菌种接种于10mL液体培养基中，在55℃培养箱中厌氧培养24h，然后以液体培养基体积的2％接种量接入下一级扩大培养的液体培养基中，相同条件下进行二级厌氧扩大培养，即可得到该菌株的液体菌剂。

实施例3：菌株HK1对餐厨垃圾高温干式厌氧发酵产氢的强化效果

餐厨垃圾取自上海某食堂回收的剩饭、剩菜，该餐厨垃圾的TS含量23.72％，VS含量为21.76％，pH值为5.26。

将餐厨垃圾与厌氧活性污泥按照VS比为3:1的比例混合均匀，置于5L厌氧发酵罐中。实验组按照餐厨垃圾与厌氧活性污泥总质量的5％接种菌株HK1的液体菌剂，对照组接入相同体积的无菌水代替菌剂，空白组为单一厌氧活性污泥发酵体系，剩余体积用无菌水补齐。控制温度为55℃，自然pH。发酵过程中用气袋收集产生的气体，每天测量气体体积，并利用气相色谱仪测量气体中的氢气含量，计算氢气产量。气相色谱条件为：日本岛津TDX-01不锈钢色谱柱(2m×2mm)，TCD检测器，进样口和检测器温度为150℃，柱温120℃，载气为氩气。图2为菌株HK1在72h内对餐厨垃圾高温干式厌氧发酵产氢的强化情况，结果显示添加了菌株HK1的实验组累积氢气产量达104.94NmL g^-1VS，与对照组的累积氢气产量85.40NmL g^-1VS相比，提高了22.88％。说明菌株HK1高温厌氧条件下对餐厨垃圾的厌氧产氢发酵具有显著的强化效果。

实施例4：菌株HK1对厨余垃圾中温干式厌氧发酵产氢的强化效果

厨余垃圾取自上海某食堂后厨丢弃的果皮、菜梗、生肉加工前的下脚料等，该厨余垃圾均质化并沥水后的TS含量22.39％，VS含量为19.79％，pH值为5.59。

将厨余垃圾与厌氧活性污泥按照VS比为6:1的比例混合均匀，置于5L厌氧发酵罐中。实验组按照厨余垃圾与厌氧活性污泥总质量的10％接种菌株HK1的液体菌剂，对照组接入相同体积的无菌水代替菌剂，空白组为单一厌氧活性污泥发酵体系，剩余体积用无菌水补齐。控制温度为37℃，自然pH。发酵过程中用气袋收集产生的气体，每天测量气体产量，并利用气相色谱仪测量气体中的氢气含量，计算氢气产量。图3为菌株HK1在72h内对厨余垃圾中温干式厌氧发酵产氢的强化情况，结果显示添加了菌株HK1的实验组累积氢气产量达115.21NmL g^-1VS，与对照组的累积氢气产量95.45NmL g^-1VS相比，提高了20.70％。说明菌株HK1中温厌氧条件下对厨余垃圾的厌氧产氢发酵具有显著的强化效果。

实施例5：菌株HK1对作物秸秆和畜禽粪污混合物中温干式厌氧发酵产氢的强化效果

作物秸秆和畜禽粪污取自江苏某农场，该混合物包含水稻秸秆和猪粪，水稻秸秆和猪粪基于TS按3:7的比例混合，均质化后的TS含量43.92％，VS含量为37.78％。

将水稻秸秆与猪粪的混合物与厌氧活性污泥按照VS比为4:1的比例混合均匀，置于5L厌氧发酵罐中。实验组按照秸秆、猪粪、厌氧活性污泥三者总质量的1％接种菌株HK1的液体菌剂，对照组接入相同体积的无菌水代替菌剂，空白组为单一厌氧活性污泥发酵体系，剩余体积用无菌水补齐。控制温度为37℃，自然pH。发酵过程中用气袋收集产生的气体，每天测量气体产量，并利用气相色谱仪测量气体中的氢气含量，计算氢气产量。图4为菌株HK1在72h内对秸秆与猪粪混合物中温干式厌氧发酵产氢的强化情况，结果显示添加了菌株HK1的实验组累积氢气产量达65.30NmL g^-1VS，与对照组的累积氢气产量50.79NmL g^-1VS相比，提高了28.57％。说明菌株HK1中温厌氧条件下对秸秆和畜禽粪污混合物的厌氧产氢发酵具有显著的强化效果。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims

1.热丁酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)HK1或其菌剂在制备氢气中的用途，所述热丁酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)HK1保藏编号为CCTCC NO：M 2022030。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂中热丁酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)HK1的浓度至少为1×10⁸CFU/mL。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途为热丁酸梭菌(Clostridiumthermobutyricum)HK1利用有机固废发酵制备氢气中的用途；优选的，所述用途为利用有机固废厌氧发酵制备氢气中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述有机固废选自餐厨垃圾、秸秆或粪便；优选的，所述餐厨垃圾选自餐饮垃圾、厨余垃圾；优选的，所述秸秆选自小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆、棉花秸秆、甘蔗秸秆中的任一种或多种；优选的，所述粪便选自畜禽粪便；更优选的，所述畜禽粪便选自猪粪、牛粪、羊粪、鸡粪或鸭粪中的一种或多种。

5.一种有机固废发酵制备氢气的方法，其特征在于，包括如下步骤：将保藏编号为CCTCCNO：M 2022030的热丁酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)HK1或其菌剂与有机固废和厌氧活性污泥混合得到厌氧发酵体系进行厌氧发酵，收集发酵产生的气体即获得氢气。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂的接种质量为有机固废和厌氧活性污泥总质量的0.5～10％。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述有机固废选自餐厨垃圾、秸秆或粪便。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述有机固废和厌氧活性污泥按照挥发性固体的质量比为(2～10)：1混合。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述厌氧活性污泥的总固体含量为10～20％，挥发性固体含量为5～15％，pH值为7～9。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括如下特征中的一项或多项：

1)所述厌氧发酵温度为30～60℃；

2)发酵时厌氧发酵体系中pH值为4～7。

3)发酵的时间为36小时以上。