CN107118997A - 一种饲用丁酸梭菌、促进畜禽生长的微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

一种饲用丁酸梭菌、促进畜禽生长的微生态制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中草药微生态制剂领域，公开一种饲用丁酸梭菌、促进畜禽生长的微生态制剂及其制备方法。本发明丁酸梭菌RCM‑2，保藏编号为CCTCC NO：M2017396。本发明中由丁酸梭菌RCM‑2发酵制备的微生态制剂产品的底物基质质量百分比组成为：粉状太子参须提取物25~30%、山楂15~20%、陈皮15~20%、六神曲15~20%、紫苏叶10~15%、菊苣根5~10%、绿茶10~20%、大蒜素0.05~0.1%。本发明丁酸梭菌RCM‑2具有良好的耐茶多酚和大蒜素的能力，另外，太子参须提取物可显著促进该菌株生长。本发明微生态制剂不仅利于成品有效成分的保存还能显著降低货损率，延长货架时间。

Description

一种饲用丁酸梭菌、促进畜禽生长的微生态制剂及其制备 方法
技术领域
本发明属于中草药微生态制剂领域，具体涉及一种饲用丁酸梭菌、促进畜禽生长的微生态制剂及其制备方法。
背景技术
过去，人们讲究吃饱吃好，如今人们不仅讲究吃饱吃好，更重要的是吃得营养、健康、安全、放心，所以“民以食为天，食以安为先”。保障动物源性食品安全，饲用抗生素禁用是必然趋势，营养、健康、安全的肉蛋奶食品越来越受餐桌上的喜爱。然而，现在畜禽养殖全过程依然还存在饲料长期添加抗生素用于促生长和乱用抗生素进行疾病预防和治疗，严重影响了我们食品安全和食品的品质口感，也影响了产品的进出口，同时畜禽排泄的粪便含有抗生素也造成环境污染。长期使用抗生素和超剂量乱用抗生素也造成畜禽免疫力和生产性能的降低，所以加快研发新型、稳定、高效的抗生素替代品是保障畜牧业健康可持续发展的必要条件，发展绿色畜牧业是实现食品安全的切实需要。中草药是我国特有的中医药理论与实践的产物，其资源丰富，种类多样，历史悠久，兼有营养与药物的双重作用，引起了畜牧业工作者的极大关注。
目前，对于提高畜禽生产性能的途径主要集中在饲养管理、还原剂添加（如维生素、茶多酚等）、增强营养、健脾益胃、补充肠道益生菌。其中，南方畜禽养殖业已有将茶末应用到预防畜禽热应激的工作中，而研究发现廉价的茶末中的茶多酚起到重要的还原性抗氧化剂的作用。然而目前市面上还未有高效发酵型茶叶微生态制剂产品的报道，主要原因是缺少能耐受茶多酚的茶叶发酵益生菌菌株，其次是即使一般性制备了该类产品但因茶多酚溶出度小、茶多酚氧化损失严重而不能达到理想的应用效果。另外，目前发酵型微生态制剂（含水量10~40%）多有货架期内受霉菌的污染等现象，如何解决该问题对提高成品货架期意义重大。
发明内容
为克服现有技术中缺少能耐受茶多酚的茶叶发酵益生菌菌株而难以制备高效发酵型茶叶微生态制剂、微生态制剂成品货架期短的难题，本发明的目的在于提供一种饲用丁酸梭菌、促进畜禽生长的微生态制剂及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种饲用丁酸梭菌（Clostridium butyricum）RCM-2，申请人已将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏日期：2017年6月29日；保藏编号：CCTCCNO：M2017396。
利用所述饲用丁酸梭菌RCM-2制备促进畜禽生长的微生态制剂的方法，步骤如下：
（1）、丁酸梭菌RCM-2的活化：
将丁酸梭菌RCM-2试管斜面菌种在无菌环境下用无菌生理盐水冲洗，然后接种到含太子参须提取物0.2~0.5%的MRS液体培养基中，35~37℃静止培养42~48h；其中，所述太子参须提取物的百分比以质量体积百分比g/mL计（即100mL MRS液体培养基含太子参须提取物0.2~0.5g）；
（2）、制备丁酸梭菌RCM-2发酵种子液：
无菌环境下，将步骤（1）所得菌种活化液按体积百分比3~5%接种到含太子参须提取物0.2~0.5%的MRS液体培养基中，35~37℃下静止发酵42~48h，制得丁酸梭菌RCM-2发酵种子液；其中，所述太子参须提取物的百分比以质量体积百分比g/mL计（即100mL MRS液体培养基含太子参须提取物0.2~0.5g）；
（3）、制备发酵底物基质：
首先，按质量百分比准备原料：粉状太子参须提取物25~30%、山楂15~20%、陈皮15~20%、六神曲15~20%、紫苏叶10~15%、菊苣根5~10%、绿茶10~20%、大蒜素0.05~0.1%；然后，先粉碎除粉状太子参须提取物、六神曲、绿茶和大蒜素之外的原料，接着将粉碎后的物料进行蒸汽爆破处理，条件为：爆破腔装料系数为0.8~0.9，爆破蒸汽压力达0.4~0.6MPa，爆破保压处理时间为2~5min，爆破时间不高于0.00875s；爆破处理后及时干燥，待干燥后将所得干物料与六神曲、绿茶一并进行粉碎，然后再与粉状太子参须提取物、大蒜素混合均匀，制得发酵底物基质；
（4）、发酵：
将步骤（2）所得发酵种子液加入步骤（3）所得发酵底物基质内，搅拌混匀，装入发酵袋并密封，再将发酵袋在避光条件下于30~37℃发酵14~21d，制得微生态制剂；其中，以体积质量百分比L/kg计，发酵种子液占发酵底物基质的百分比为30~40%。
较好地，步骤（3）中，粉碎粒度优选为60~80目。
一种利用所述制备方法制备的促进畜禽生长的微生态制剂。
本发明发酵底物基质组方中各中草药的具体成分、功效解析：
1、太子参须：太子参须的物质基础与太子块根一致，其药效成分几乎相同；
性味归经：归脾、肺二经；
化学成分：太子参须含糖类、皂苷类、环肽类、甾醇类、油脂类、挥发油类、氨基酸类、磷脂类、脂肪酸类，微量元素，太子参须很多成分含量高于太子参；
药物功效：
第一、补益脾肺，益气生津，属于补气药中的亲补之品；既能补脾气，又能养胃阴，可以用来治疗肺气虚弱，胃阴不足引起的食少体倦，口干舌燥等不适；
第二、补脾气、润肺燥，用来治疗肺脏气阴不足；
第三、含有太子参多糖、皂苷、环肽、氨基酸和矿物质，可以抗病毒，提高机体免疫力；
第四、太子参须有营养作用，因为太子参须含有皂甙A、棕榈酸、果糖、多种维生素和微量元素。
2、山楂：
性味归经：酸、甘、微温，归脾、胃、肝经；
化学成分：山楂含有大量的柠檬酸、苹果酸、山楂酸、鞣质、皂甙、果糖、维生素C和脂肪酶；
药物功效：具有健胃助消化、行气散瘀、抗氧化、增免疫、养肝保肝、清除胃肠道有害菌等作用；
A、山楂能够开胃促进消化，山楂所含有的脂肪酶也能够促进脂肪的消化；
B、山楂所含有的黄酮类与维生素c、胡萝卜素等物质能够阻断并减少自由基的生成，可增强机体的免疫力，延缓衰老，利用山楂果实治疗疾病，在中国已有悠久的历史；《唐本草》记：汁服用止水痢；《本草纲目》记：山楂化饮食，消肉滞等；凡脾胃虚弱，食物不消化，中医认为，山楂更具有生津止渴，活血化瘀等功能；
C、山楂含有大量的有机酸、果酸、山楂酸、枸橼酸等，促进胃液分泌和增加胃内酶素，消食化滞，而且还有良好的抗菌、抗炎和抗寄生虫效果。
3、陈皮：
性味归经：归脾、胃、肺经；
化学成分：黄酮类化合物、生物碱类、挥发油、微量元素；
药物功效：本品燥湿而能健脾开胃，适用于脾胃虚弱、饮食减少、消化不良、大便泄泻等症；常与人参配伍应用，既能健脾、又能理气，本发明中将人参改为太子参须，这样养殖用药成本低廉，但效果一样可以达到；陈皮在发明配方中用作太子参须补气之佐使，使得太子参须补而不滞；
A、对消化系统的作用：陈皮所含挥发油可以促进消化液的分泌，可以排除肠管内的积气，显示芳香健胃和驱风下气的作用；
B、挥发油还具有镇咳、平喘、祛痰、抗过敏的作用。
4、六神曲：
性味归经：性温、味甘，归脾、胃经；
化学成分：六神曲为酵母制剂，含酵母菌、淀粉酶、维生素B复合体、麦角甾醇（ergosterol）、蛋白质及脂肪、挥发油等；
药物功效：
A、六神曲中含有的淀粉酶能够帮助促进分解淀粉，改善消化；
B、六神曲中含有的酵母菌、维生素B，能够增进食欲，维持正常消化机能。
5、紫苏叶
性味归经：性辛、微温，无毒、归脾、肺经；
化学成分：含挥发性紫苏油、含紫苏醛约55%、左旋柠檬烯20-30%，还含有精氨酸、5-β—D—葡萄糖甙；
药物功效：
A、理气，和营，治感冒风寒、恶寒发热、咳嗽、气喘；
B、常与陈皮、砂仁配伍，有止呕、安胎的效果；
C、紫苏中含紫苏醛有良好的抗菌效果。
6、菊苣根：
性味归经：气微、味淡，归脾、肝、膀胱经；
化学成分：含山莴苣素、野莴苣甙、蒲公英甾醇、莴苣内脂A、8-脱氧山莴苣素、菊苣多糖等；
药物功效：菊苣根功效很大，很少有人懂得利用菊苣来养生保健，更是少有人会将其用于动物的治疗用药和功能性保健品中。菊苣的养生保健价值极高，菊苣的功效与作用很大，是很多植物所不具备的，尤其是在常见的蔬菜和肉类中，很难找到与菊苣一样可以清热解毒，利尿消肿的了，菊苣是一种兼有食用和药用两种价值的特殊植物，现已被国家卫生部列为“食药同源类”食品，同时被国家营养联盟专家誉为绿色“健康之王”；
A、菊苣具有清肝利胆、健胃消食、利尿消肿、抗菌、抗炎、保肝作用；
B、菊苣适口性好，利用率高，牛、羊、猪、鸡、兔等都喜欢吃；
C、具有很好的保健功效，是家禽高尿酸、痛风的克星。
本发明发酵底物基质组方解析：本发明组方中选用的太子参须、山楂、陈皮、六神曲、紫苏叶、菊苣根均为既可以食用又可以药用的天然植物，基本都是归脾、肺、胃及大肠经，属于消化道和呼吸道两大归经。本发明组方讲究“君臣佐使”，制得的复方中草药制剂进一步强化单一药物的功效，使复方产品具有十分显著的益气生津、健胃消食、抗病增免、补气养肺、调节肠道、清热化痰、止咳平喘、抗菌防腹泻等功效，属于一种安全、绿色、高效的免疫抗病、营养抗病的一款替代抗生素，防病治病，预防兼保健类制剂，是一款益于集约化养殖中提高畜禽生产性能并具有十分广阔未来前景的中草药复方制剂，适于大力推广应用。
本发明中，太子参须提取物均可按现有技术获得，比如可参照但不限于申请人于2016年8月30日申请的名称为“一种太子参须提取物的制备方法”的专利（申请号201610758305.8）中公开的方法获得。
有益效果：
1、本发明饲用丁酸梭菌RCM-2分离于柘荣县下村农户（坐标：119。52′04.1〞E，27。13′32.7〞N）自圈山林地养殖的健康成年公鸡的盲肠黏膜段，所得丁酸梭菌RCM-2安全无毒，37℃ RCM培养基中培养48h菌落表面光滑凸起，周边整齐，菌落颜色乳黄色不透明，略有酸臭味，菌落直径0.5~1.5cm，镜检G+，有芽孢，芽孢卵圆，芽孢端生或次端生，生芽孢的菌体呈梭状，菌体长度约3.5~7.0μm。丁酸梭菌RCM-2在厌氧培养和有氧培养下生长良好，活菌数分别达到3.6×109CFU/mL、6.2×106CFU/mL，该菌株具有良好的耐酸、耐胆盐和耐高温能力，同时该菌株具有良好的耐茶多酚和大蒜素的能力，该菌株可耐受茶多酚和大蒜素的浓度分别为1.0%、0.1%，该浓度下菌体存活率分别为87.3%和85.5%，在茶多酚（1%）和大蒜素（0.05%）联合作用下其存活率可达88.5%，超出50%；另外，太子参须提取物可显著促进该菌株生长；丁酸梭菌RCM-2可显著抑制致病菌金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和大肠埃希氏菌的生长；
2、本发明微生态制剂的制备方法可利于茶多酚有效成分的溶出，保护茶多酚和降低茶多酚损失，能够有效提高发酵成品中游离茶多酚含量，还能延长产品的货架期时间，并能达到很好防止霉菌污染的效果；
3、本发明丁酸梭菌RCM-2利于肠道紊乱的微生态内环境得到修复和再平衡，利用其制备的微生态制剂产品具有益气生津、健胃消食、抗病增免、补气补肺等功效，属于一种安全、绿色、高效的中草药类抗生素替代制剂，是一种益于集约化养殖中提高畜禽生产性能的中草药复方制剂，本发明组方作为功能性保健兼治疗作用的制剂具有十分广阔的市场应用前景，适于推广应用。
附图说明
图1：丁酸梭菌RCM-2的系统进化树。
具体实施方式
以下实施例中，所述太子参须提取物按专利申请号为CN201610758305.8中实施例1公开的方法制备而得；各培养基的配方为：
RCM琼脂平板或RCM斜面培养基（1L）：酵母浸膏3g、牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0.15g、琼脂15g，纯化水1L，pH值6.8±0.2，灭菌备用；
淀粉培养基（1L）：牛肉膏5g、蛋白胨5g、氯化钠0.5g、可溶性淀粉20g、琼脂18g，纯化水1L，pH=7.2±0.1，灭菌备用；
MRS液体培养基(1L)：蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，酵母粉4g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1mL，纯化水1L，pH值6.2±0.2；
MRS琼脂平板（1L）：蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，酵母粉4g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1mL，琼脂15g，纯化水1L，pH值6.2±0.2；
其中，含太子参提取物、茶多酚或大蒜素的MRS液体培养基均是指在上述MRS液体培养基配方基础上，再另外对应添加太子参提取物、茶多酚或大蒜素；含溴甲酚紫指示剂、茶多酚或大蒜素的RCM琼脂平板内均是指在上述RCM琼脂平板配方基础上，再另外对应添加溴甲酚紫指示剂、茶多酚或大蒜素。
实施例1--丁酸梭菌RCM-2的分离与鉴定
1、丁酸梭菌RCM-2的分离、富集、纯化
无菌操作条件下，取福建省宁德市柘荣县下村农户（坐标：119。52′04.1〞E，27。13′32.7〞N）自圈山林地养殖的健康成年公鸡的盲肠黏膜段，用灭菌的载玻片刮取黏膜黏液于EP管，用无菌生理盐水稀释102倍，然后加热至60℃、30min，取0.1mL涂布于含溴甲酚紫指示剂 (0.01%，g/mL )的RCM琼脂平板上，涂布后将RCM琼脂平板放置厌氧培养箱中，37℃培养48h，挑选培养基变黄的菌落划线纯化，选取镜检革兰氏染色阳性、有芽孢的杆状菌株于含溴甲酚紫 (0.01%，g/mL)、茶多酚（0.01%，g/mL）和大蒜素（0.01%，g/mL）的RCM琼脂平板上复筛，最后选取菌落周围黄色颜色明显、菌落表面光滑凸起，乳黄色不透明，有酸臭味的作为预备菌株，然后再将预备菌株涂布于淀粉培养基，37℃培养48h后挑选透明圈最大的作为对象菌株，菌株命名为RCM-2，并以RCM斜面培养基对菌种进行斜面保藏。
2、形态学观察
观察菌株RCM-2的菌落形态特征，可知：RCM琼脂平板上菌落表面光滑凸起，菌落颜乳黄色不透明，略有酸臭味，菌落直径0.5~1.5cm，镜检G+，有芽孢，芽孢卵圆，芽孢端生或次端生，生芽孢的菌体呈梭状，菌体长度约3.5~7.0μm。
3、生理生化特征
参照《伯杰细菌鉴定手册》对菌株进行生理生化鉴定，分别以接触酶、淀粉酶、硝酸盐还原和糖等进行生理生化试验，结果见表1。
将其与《伯杰细菌鉴定手册》和常见细菌系统鉴定手册中丁酸梭菌的生理生化特性进行比较，结果发现菌株RCM-2与丁酸梭菌的生理生化特性基本相符，因此初步鉴定菌株RCM-2为丁酸梭菌。
4、测序及进化树
利用细菌基因组DNA抽提试剂盒（DP302-02，TIANGEN）提取菌株RCM-2的总DNA，以菌株RCM-2的总DNA为模板，在引物P0(5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’)和PC3(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT -3’)的引导下PCR扩增该菌株的16S rDNA序列，PCR反应体系为：10×Buffer 5.0μL，dNTP(10mmol/L)2.0μL，Primer 1(20μmol/L)1.0μL，Primer2(20μmol/L)1.0μL，模板DNA 2.5μL，Taq酶(5.0U/μL)0.5μL，超纯水38μL，总50μL。PCR反应条件为：先94℃5min；然后94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸8min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，比对marker获得目的条带。用购自Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收并纯化该目的条带，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA序列测定，测序结果见SEQ ID No.1。
将所测得的序列与Genbank中的16S rDNA序列进行Blastn相似性分析比较，结果菌株RCM-2与Clostridium butyricum strain 1005-15098的16S rDNA序列的同源性达到了98％，因此RCM-2鉴定为丁酸梭菌，其系统进化树如图1。
结合上述形态学、生理生化特征和测序及进化树结果，将本发明菌株RCM-2鉴定并分类命名为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）RCM-2。
实施例2--丁酸梭菌RCM-2在MRS液体培养基中厌氧和有氧发酵
（1）丁酸梭菌RCM-2的活化：将丁酸梭菌RCM-2试管斜面菌种在无菌环境下用无菌生理盐水冲洗，洗下培养基表面菌苔，然后接种到MRS液体培养基中，37℃静止培养48h；
（2）丁酸梭菌RCM-2在MRS液体培养基中厌氧静止发酵：
按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液于厌氧箱中接种至含MRS液体培养基的厌氧血清瓶中，37℃静止培养48h，待培养终点时测定发酵液活菌数、芽孢率、pH值；
（3）丁酸梭菌RCM-2在MRS液体培养基中有氧发酵：
按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液接入装有100 mL MRS液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃，150rpm下培养48h，待培养终点时测定发酵液活菌数、芽孢率、pH值。
结果见表2。
实施例3--太子参须提取物对丁酸梭菌RCM-2生长、pH的影响
（1）丁酸梭菌RCM-2的活化：同实施例2步骤（1）；
（2）按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液于厌氧箱中接种至含MRS液体培养基的厌氧血清瓶中，其中厌氧血清瓶内的MRS液体培养基内太子参须提取物的梯度依次设置为（g/mL）：0%、0.10%、0.25%、0.5%，37℃静止培养48h，待培养终点时测定发酵液pH值和活菌数，结果见表3；
（3）按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液接入装有100 mL MRS液体培养基的500 mL三角瓶中，其中瓶内的MRS液体培养基内太子参须提取物的梯度依次设置为（g/mL）：0%、0.10%、0.25%、0.5%，37℃，150rpm下培养48h，待培养终点时测定发酵液pH值和活菌数，结果见表4；
由表3-4结果可知：太子参须提取物对丁酸梭菌RCM-2的厌氧和有氧发酵都有促进作用；且在厌氧发酵中，太子参须提取物显著促进丁酸梭菌产气速率，促使菌体提前产气。
实施例4--茶多酚对丁酸梭菌RCM-2生长、pH的影响
（1）丁酸梭菌RCM-2的活化：同实施例2步骤（1）；
（2）按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液于厌氧箱中接种至含MRS液体培养基的厌氧血清瓶中，其中厌氧血清瓶内的MRS液体培养基内茶多酚的梯度依次设置为（g/mL）：0%、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%，待培养终点时测定发酵液pH值和活菌数，结果见表5。
由表5结果可知：本发明丁酸梭菌RCM-2可耐受茶多酚的浓度为1.0%，该浓度下菌体存活率为87.3%。
实施例5--大蒜素对丁酸梭菌RCM-2生长、pH的影响
（1）丁酸梭菌RCM-2的活化：同实施例2步骤（1）；
（2）按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液于厌氧箱中接种至含MRS液体培养基的厌氧血清瓶中，其中厌氧血清瓶内的MRS液体培养基内大蒜素的梯度依次设置为（g/mL）：0%、0.010%、0.025%、0.050%、0.10%，待培养终点时测定发酵液pH值和活菌数，结果见表6；
由表6结果可知：本发明丁酸梭菌RCM-2可耐受大蒜素的浓度为0.1%，该浓度下菌体存活率为85.5%；
（3）丁酸梭菌耐受茶多酚及大蒜素生长对比：
按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2（计为A）的活化液和对照菌B、C、D的活化液于厌氧箱中接种至含MRS液体培养基的厌氧血清瓶中，其中厌氧血清瓶内的MRS液体培养基内①茶多酚的梯度依次设置为（g/mL）：0%、1.00%、2.00%，②大蒜素的梯度依次设置为（g/mL）：0%、0.05%、0.1%，连续培养48h，由0%+0%作为对照（活菌数定义为X0），通过公式：菌体损失率=（X0-X）/ X0*100%来计算丁酸梭菌菌体损失率，结果见表7。
由表7结果可知：在茶多酚（1%）和大蒜素（0.05%）联合作用下本发明丁酸梭菌RCM-2存活率可达88.5%，超出50%，远高于市场同类菌株。
实施例6--丁酸梭菌抑菌实验
（1）丁酸梭菌RCM-2的活化：同实施例2步骤（1）；
（2）按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液于厌氧箱中接种至含MRS液体培养基的厌氧血清瓶中，37℃静止培养48h，待发酵终点时取发酵液利用牛津杯法检测对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和大肠埃希氏菌的抑菌效果，以未接种的MRS液体培养基为对照；抑菌圈直径大小见表8。
由表8结果可知：本发明丁酸梭菌RCM-2可显著抑制致病菌金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和大肠埃希氏菌的生长。
实施例7--丁酸梭菌RCM-2耐酸、耐胆盐、耐高温实验
（1）丁酸梭菌RCM-2的活化：同实施例2步骤（1）；
（2）耐酸试验：按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液于厌氧箱中接种至含MRS液体培养基的厌氧血清瓶中，37℃静止培养32h，作为耐酸性菌种液；然后用1M盐酸溶液调节MRS液体培养基的初始pH值，设定MRS液体培养基的初始pH值梯度分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0， 115℃灭菌20min，冷却室温；然后将耐酸性菌种液按3%（体积比）接种量接种于各梯度的MRS液体培养基内，混匀，于37℃下静止48h，待结束时分别量取各pH梯度的混合液1mL，进行10倍生理盐水稀释，以各梯度的未接种MRS液体培养基用生理盐水稀释10倍为对照，进行测定OD600值。结果见表9；
（3）耐胆盐试验：按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液于厌氧箱中接种至含MRS液体培养基的厌氧血清瓶中，37℃静止培养32h，作为耐胆盐菌种液；然后向MRS液体培养基中添加胆盐，设定MRS液体培养基的初始胆盐梯度（质量分数，%）分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0，然后分取9mL转至试管中，盖试管塞，115℃灭菌20min，冷却室温；然后将耐胆盐菌种液各1mL在无菌环境下加入至9mL MRS液体培养基的试管内，混匀并密封，于37℃下静止2h，同时量取耐酸性菌种液1mL于含9mL无胆盐添加的MRS液体培养基的试管中，方法同上，作为对照；待2h时分别量取各胆盐梯度及对照组的混合液1mL，进行108生理盐水稀释，并涂布于pH6.2±0.2的MRS琼脂平板上，37℃倒置培养48h，分别计数，计算存活率。存活率=（对照组活菌数-试验组活菌数）/对照组活菌数*100%。结果见表10。
（4）耐高温试验：
按接种量3%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液于厌氧箱中接种至含MRS液体培养基的厌氧血清瓶中，37℃静止培养32h，作为耐高温菌种液；然后分取4.5mL转至5mL EP管内，盖盖密封，再分别置入37℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的热水浴中静止0.5h，其中37℃作为对照，最后分别取不同温度处理后的耐高温菌种液1mL，进行108生理盐水稀释，并涂布于pH6.2±0.2的MRS琼脂平板上，37℃倒置培养48h，分别计数，计算存活率。存活率=（对照组活菌数-试验组活菌数）/对照组活菌数*100%。结果见表11。
由表9-11结果可知：本发明丁酸梭菌RCM-2具有良好的耐酸、耐碱、耐胆盐和耐高温能力。
实施例8--安全性试验
试验动物：KM种小白鼠，SPF级，体重18-22g，雌雄各半，购于重庆市中药研究所。
试验：选取健康小鼠10只，雌雄各半，平均体重：雌为（21.90±0.5）g，雄为（22.00±0.5）g；小鼠禁食（不禁水）12h后，用丁酸梭菌RCM-2的悬浮液（约5.0×108CFU/ml）灌胃给药，一日3次等量给药，给药总剂量为1.5mL；其中，丁酸梭菌RCM-2的悬浮液的配制过程为：
（1）丁酸梭菌RCM-2的活化：将丁酸梭菌RCM-2试管斜面菌种在无菌环境下用无菌生理盐水冲洗，然后接种到MRS液体培养基中，37℃静止培养48h；
（2）、扩大培养：按接种量5%（体积比）将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液于厌氧箱中接种至含MRS液体培养基的厌氧血清瓶中，37℃静止培养48h；
（3）稀释：测定步骤（2）所得培养液的总活菌数，根据总活菌数加无菌生理盐水对其进行稀释至要求浓度。
给药后小鼠正常饲养于清洁级饲养室，室温（21±0.5）℃，相对湿度45%~60%，观察动物的活动、皮毛、饮食、粪便有无异常改变，并观察有无中毒症状及死亡，连续观察三周，结果见表12。
由表12结果可知：本发明丁酸梭菌RCM-2安全无毒。
实施例9--微生态制剂的制备
制备步骤如下：
（1）、丁酸梭菌RCM-2的活化：
将丁酸梭菌RCM-2试管斜面菌种在无菌环境下用无菌生理盐水冲洗，洗下培养基表面菌苔，然后接种到装有含太子参须提取物0.25%的MRS液体培养基的500 mL厌氧血清瓶内，37℃静止培养48h；所述太子参须提取物的百分比以质量体积百分比g/mL计（即100mL MRS液体培养基含太子参须提取物0.25g）；
（2）、制备丁酸梭菌RCM-2发酵种子液：
无菌环境下，将步骤（1）所得丁酸梭菌RCM-2的活化液按体积百分比5%接种到装有含太子参须提取物0.25%的MRS液体培养基的发酵罐内，37℃下静止发酵48h，制得丁酸梭菌RCM-2发酵种子液；所述太子参须提取物的百分比以质量体积百分比g/mL计（即100mL MRS液体培养基含太子参须提取物0.25g）；
（3）、制备发酵底物基质：
首先，按质量百分比准备原料：粉状太子参须提取物30%、山楂15%、陈皮15%、六神曲15%、紫苏叶10%、菊苣根5%、绿茶10%、大蒜素0.06%；然后，先粉碎除粉状太子参须提取物、六神曲、绿茶和大蒜素之外的原料，粉碎物颗粒大小为60目，接着将60目物料进行蒸汽爆破处理，条件为：爆破腔装料系数为0.9，爆破蒸汽压力达0.4MPa，爆破保压处理时间为2min，爆破时间不高于0.00875s，爆破处理后及时干燥，待干燥后同时将六神曲、绿茶和处理干物料一并进行粉碎，粉碎物颗粒大小为80目制成原料粉，然后将再利用授权实用新型专利设备(专利号：201620106247.6)将粉碎所得原料粉与粉状太子参须提取物和大蒜素混合均匀，制得发酵底物基质；
（4）、发酵：
首先将步骤（3）制备的发酵底物基质投料至搅拌设备内（设备采用实用新型专利设备，专利号：201620053478.5），再将步骤（2）所得发酵种子液添加至设备内，搅拌，搅拌转速为100 rpm，保持时间为20min，其中，以体积质量百分比L/kg计，发酵种子液占发酵底物基质的百分比为35%；搅拌均匀后迅速将混合料装入发酵袋（发酵袋采用实用新型专利袋，专利号：201620018088.4）内，密封，待分装结束，将发酵袋直接运输至发酵车间，发酵车间要求恒温（35℃）和避光，在发酵车间内发酵袋将排列堆放后，发酵时间为21d，制得微生态制剂。
对照微生态制剂的制备：将市场用同类菌株B、C、D共3种作为对照菌株，采用和本发明丁酸梭菌RCM-2相同方式和条件进行活化和发酵种子液的制备，再以相同发酵底物基质进行发酵21d。
分别检测本发明和对照成品微生态制剂的菌体活菌数、游离茶多酚量、霉菌污染率3项指标；然后再将微生态制剂成品货架存放一年再次检测成品的菌体存活率、游离茶多酚量、霉菌污染率3项指标。结果见表13。
由表13可知：本发明丁酸梭菌RCM-2相比其他市场同类菌株具有活菌数高，且显著增加成品的游离茶多酚的含量和延长产品的货架期时间，并能达到很好防止霉菌污染的效果。
实施例10--本发明微生态制剂产品对肉鸡生长性能的影响
实验方案：将120只1日龄艾维茵肉鸡随机分成2组，每组3个重复，每个重复20只。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮的基础上添加0.2wt%（以占基础日粮的质量百分比计）的实施例9本发明微生态制剂产品，基础日粮为玉米-豆粕型粉状料，参照NRC(1994年)肉仔鸡营养标准和中国饲料营养成分表配制而成。实验肉鸡采用笼养，每个重复单独给料，自由采食、饮水，日常管理与免疫程序按常规进行。养殖时间设定为6周。于4周末和6周末在早饲前进行称重，分别计算日增重和料重比，结果见表14。
实施例11--本发明微生态制剂产品对产蛋鸡生产性能的影响
实验方案：将120只20周龄产蛋鸡随机分成2组，每组3个重复，每个重复20只。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮的基础上添加0.2wt%（以占基础日粮的质量百分比计）的实施例9本发明微生态制剂产品，基础日粮为市售普通蛋鸡饲料，配方为玉米粉64.15wt%、豆粕22.85wt%、贝壳粉8wt%、预混料5wt%（每千克预混料含维生素A 15000IU、维生素D3 8000IU、维生素E 60IU、VK 2.5IU）。实验产蛋鸡采用笼养，每个重复单独给料，自由采食、饮水，日常管理按常规进行。养殖时间设定为5周。每日收集鸡蛋并进行称重，分别计算平均产蛋率、平均蛋重、料蛋比和产蛋破损率，结果见表15。
实施例12--本发明微生态制剂产品对仔猪生长性能的影响
实验方案：将60头21日龄且体重约20kg的杜长大三元断奶仔猪随机分成2组，每组3个重复，每个重复10头。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮的基础上分别添加0.25wt%（以占基础日粮的质量百分比计）的实施例9本发明微生态制剂产品，基础日粮配方：玉米56.00 wt%、豆粕30.00wt%、麸皮10.00wt%、预混料4.00wt%（每千克预混料含维生素A15000IU、维生素D3 8000IU、维生素E 60IU、VK 2.5IU）。试验猪进行群饲，充分饲喂，每天4次，自由饮水，试验期40d，管理正常。试验结束时测定增重及饲料转化率，结果见表16。
综合实施例10-12的试验结果可知：本发明微生态制剂可显著提高畜禽生产性能，适于推广应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建贝迪药业有限公司
<120> 一种饲用丁酸梭菌、促进畜禽生长的微生态制剂及其制备方法
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 1415
<212> DNA
<213> 未知
<400> 1
ggcagtggcg gcatcttacc atgcagtcga gcgatgaagc tccttcggga gtggattagc 60
ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctcatag aggggaatag cctttcgaaa 120
ggaagattaa taccgcataa gattgtagta ccgcatggta cagcaattaa aggagtaatc 180
cgctatgaga tggacccgcg tcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg 240
acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg ggaaaccctg atgcagcaac 360
gccgcgtgag tgatgacggt cttcggattg taaagctctg tctttaggga cgataatgac 420
ggtacctaag gaggaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 480
gcaagcgttg tccggattta ctgggcgtaa agggagcgta ggtggatatt taagtgggat 540
gtgaaatacc cgggcttaac ctgggtgctg cattccaaac tggatatcta gagtgcagga 600
gaggaaagga gaattcctag tgtagcggtg aaatgcgtag agattaggaa gaataccagt 660
ggcgaaggcg cctttctgga ctgtaactga cactgaggct cgaaagcgtg gggagcaaac 720
aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tactaggtgt aggggttgtc 780
atgacctctg tgccgccgct aacgcattaa gtattccgcc tggggagtac ggtcgcaaga 840
ttaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcagc ggagcatgtg gtttaattag 900
aagcaacgag aagcacctta cctagacttg acatctcctg aatttctgtg taatggagga 960
agccatttcg gtcgcaggaa cacaggtggc gcatggttgt tgtcagctcg tgtcgtgaga 1020
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcacc ctttattttt agttgctccc atttagttga 1080
gcactctagc gagactcccg gggttaaccg ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcctc 1140
atccccctta tgtatagggc cacacacgtg ctacaatggt cggtacaatg agacgcaccc 1200
tcgcgagagt gagcaaaact ataaaaccga tctcatttcg gattgtaggc tgaatctcgc 1260
ccacaaaaag ctggagtttc tagtactcgc gactcaaaat gtcgcggaga atacgttccc 1320
gcgccttgca cacacccccc ctcaccccat gagagttcgc aatacccaaa gttcgtgagc 1380
taacctcaag gaggcagcga cctaagtagt agcgt 1415

Claims (4)

1.一种饲用丁酸梭菌（Clostridium butyricum）RCM-2，其特征在于：保藏编号为CCTCCNO：M2017396。
2.利用如权利要求1所述饲用丁酸梭菌RCM-2制备促进畜禽生长的微生态制剂的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）、丁酸梭菌RCM-2的活化：
将丁酸梭菌RCM-2试管斜面菌种在无菌环境下用无菌生理盐水冲洗，然后接种到含太子参须提取物0.2~0.5%的MRS液体培养基中，35~37℃静止培养42~48h；其中，所述太子参须提取物的百分比以质量体积百分比g/mL计；
（2）、制备丁酸梭菌RCM-2发酵种子液：
无菌环境下，将步骤（1）所得菌种活化液按体积百分比3~5%接种到含太子参须提取物0.2~0.5%的MRS液体培养基中，35~37℃下静止发酵42~48h，制得丁酸梭菌RCM-2发酵种子液；其中，所述太子参须提取物的百分比以质量体积百分比g/mL计；
（3）、制备发酵底物基质：
首先，按质量百分比准备原料：粉状太子参须提取物25~30%、山楂15~20%、陈皮15~20%、六神曲15~20%、紫苏叶10~15%、菊苣根5~10%、绿茶10~20%、大蒜素0.05~0.1%；然后，先粉碎除粉状太子参须提取物、六神曲、绿茶和大蒜素之外的原料，接着将粉碎后的物料进行蒸汽爆破处理，条件为：爆破腔装料系数为0.8~0.9，爆破蒸汽压力达0.4~0.6MPa，爆破保压处理时间为2~5min，爆破时间不高于0.00875s；爆破处理后及时干燥，待干燥后将所得干物料与六神曲、绿茶一并进行粉碎，然后再与粉状太子参须提取物、大蒜素混合均匀，制得发酵底物基质；
（4）、发酵：
将步骤（2）所得发酵种子液加入步骤（3）所得发酵底物基质内，搅拌混匀，装入发酵袋并密封，再将发酵袋在避光条件下于30~37℃发酵14~21d，制得微生态制剂；其中，以体积质量百分比L/kg计，发酵种子液占发酵底物基质的百分比为30~40%。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，粉碎粒度为60~80目。
4.一种利用如权利要求2或3所述制备方法制备的促进畜禽生长的微生态制剂。
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Application publication date: 20170901

Assignee: FUJIAN NINGDE BEIDI BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

Assignor: FUJIAN BRADY PHARMACEUTICAL CO.,LTD.

Contract record no.: X2023980051560

Denomination of invention: A microecological preparation for feeding Clostridium butyricum and promoting the growth of livestock and poultry, and its preparation method

Granted publication date: 20191115

License type: Common License

Record date: 20231211