CN101851596A - 高效解磷的丁酸梭菌a5-4及应用 - Google Patents

高效解磷的丁酸梭菌a5-4及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业微生物技术领域，公开了一株高效解磷的丁酸梭菌，其制备方法及应用。本发明通过分离得到一株该菌株高效解磷的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)A5-4，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2010052。该细菌分离自化粪池底泥中，在厌氧条件下具有高效溶解磷酸钙和植酸钙的能力。该菌营养需求范围广、易培养、成本低、耐储存，重新施入环境中也不会导致环境污染。本发明的菌株能够开发成一种新型的应用于水生作物栽培或水产养殖的微生物菌剂。

Description

高效解磷的丁酸梭菌A5-4及应用
技术领域
本发明属农业微生物技术领域，具体涉及一株丁酸梭菌，尤其是涉及一株可在厌氧条件下高效溶解磷酸钙和植酸钙的丁酸梭菌的分离筛选，其制备方法与用途。
背景技术
磷对植物的生长发育至关重要，而磷供给不足已逐渐成为限制农业产出的最重要因素之一。土壤中总磷含量大约为0.04～0.1％，但是只有其中的1.0～2.5％能够被植物吸收利用，绝大多数为无效态(难溶态)在土壤中积累，很难被植物直接吸收利用。为解决磷素缺乏获得高产，全球每年施用将近3000万吨磷素化肥，但是其中的80％由于吸附、沉积或固定为植物难以吸收利用的无效磷，磷肥的低利用率使得农田中施用的磷肥越来越多，不仅提高了农业成本，还造成了严重的环境及生态问题。
解磷微生物是土壤中能够将无效磷转化为植物可以吸收利用的有效磷的一类特殊微生物功能群体，在自然及农业生态的磷素生物地化循环中起到了关键作用；它们通过酸解、螯合、置换及分泌磷酸酶等方式将无效磷转化为能被植物利用的有效磷(主要是HPO4 2-和H2PO4-形式)。大量研究表明，施用含有解磷菌的微生物肥料对促进植物生长、改善土壤结构效果显著。因此研究新型、高效的解磷微生物，以保持农业生态环境的平衡，对发展持续高效农业具有深远的战略意义。
土壤中的无效磷包括无机磷和有机磷，而有机磷又主要以植酸盐的形式存在于动物粪便、农业副产物、生活垃圾中。农业中施入的磷肥和有机磷源有很大部分随雨水、灌溉进入厌氧环境，成为难被作物利用的无效磷。目前研究的解磷菌主要是好氧菌，而对厌氧解磷菌的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可以在厌氧条件下溶解磷酸钙和植酸钙的细菌，该菌株能够有效提高土壤中的有效磷含量，促进植物生长，从而提高磷肥的利用率，节约磷矿资源，改善生态环境，确保农业生产的可持续发展。
本发明的技术方案如下
本发明通过分离筛选得到一株一株该菌株高效解磷的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)A5-4，该菌株已于2010年3月12日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为：CCTCC NO：M2010052。该细菌分离自化粪池底泥中，在厌氧条件下具有高效溶解磷酸钙和植酸钙的能力。该菌营养需求范围广、易培养、成本低、耐储存，重新施入环境中也不会导致环境污染。本发明的菌株能够开发成一种新型的应用于水生作物栽培或水产养殖的微生物菌剂。
本发明分离的丁酸梭菌A5-4的生物学特征：
本发明分离的丁酸梭菌A5-4，为革兰阳性厌氧菌，菌体初期杆状，产芽胞，芽胞中生，菌体中部膨大而呈梭状；RCM培养基上菌落呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑。本发明的丁酸梭菌A5-4株与丁酸梭菌标准株(Clostridium butyricum)主要生物学特征对比见表1。丁酸梭菌A5-4的16SrDNA序列在NCBI GenBank中的序列号为：GU227149。其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：1所示。
申请人提供了一种丁酸梭菌的制备方法，其步骤如下所述：
制备丁酸梭菌A5-4一级种子液：取甘油管保藏的保藏号为CCTCC NO：M2010052的丁酸梭菌菌种A5-4200μL，接种于装有15ml RCM液体培养基的试管中，于35～45℃下静置培养8～12小时，得到丁酸梭菌A5-4一级种子液，一级种子液的活菌数≥3×108个/mL；
制备丁酸梭菌A5-4二级种子液：将丁酸梭菌A5-4一级种子液按体积份3～5％接种量接入装有丁酸梭菌A5-4二级种子培养基的培养瓶中，于35～45℃下静置培养8～12小时，制成丁酸梭菌A5-4二级种子液，二级种子液的活菌数≥2.5×108个/mL；
丁酸梭菌A5-4发酵培养：将丁酸梭菌A5-4二级种子液按体积份3～5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中于35～45℃下静置培养48～72小时，发酵液中的丁酸梭菌A5-4的活菌数≥1×109个/mL；
其中
丁酸梭菌A5-4RCM液体培养基的组分及其配比如下：
葡萄糖5.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉3.0g，胰蛋白胨10.0g，可溶性淀粉1.0g，醋酸钠3.0g，NaCl 3.0g，补充蒸馏水至1L，调pH至7.0～7.5。
丁酸梭菌A5-4二级种子培养基的组分及其配比如下：
葡萄糖20.0～25.0g，酵母粉3.0～5.0g，蛋白胨4～6g，K2HPO4 2.0～4.0g，NaCl 0.3～0.5g，MgSO4·7H2O 0.5～0.6g，KCl 0.2～0.3g，FeSO4·7H2O 0.02～0.03g，MnSO4·H2O 0.02～0.03g，补充蒸馏水至1L，调pH至7.0～7.5；
为降低生产成本，本发明中的丁酸梭菌A5-4发酵培养基采用更为经济的原料，例如如豆粕、玉米淀粉、玉米浆等，发酵培养基组分及其配比如下：
葡萄糖15.0～25.0g，玉米淀粉5.0～10.0，豆粕30.0～40.0g，酵母粉3.0～5.0g，玉米浆5.0～10.0g，蛋白胨4.0～8.0g，K2HPO4 2.0～4.0g，NaCl 0.3～0.5g，MgSO4·7H2O 0.5～0.6g，FeSO4·7H2O 0.02～0.03g，MnSO4·H2O 0.02～0.03g，补充蒸馏水至1L，调pH至7.0～7.5。
作为优选方案之一，上述丁酸梭菌A5-4发酵培养基的组分及其配比为：葡萄糖19.0g，玉米淀粉8.0g，豆粕35.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨6.0g，K2HPO4 3.0g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.02g，补充蒸馏水至水1L，调pH至7.0～7.5。
作为优选之方案二，上述丁酸梭菌A5-4发酵培养基的组分及其配比为：葡萄糖24.0g，玉米淀粉5.0g豆粕38.0g，玉米浆8.0g，蛋白胨4.0g，K2HPO4 4.0g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O 0.02g，MnSO4·H2O 0.02g，补充蒸馏水至水1L，调pH至7.0～7.5。
上述所有的培养基均按照常规方法灭菌(即在115℃下高温蒸汽灭菌30min)。
本发明所述的丁酸梭菌A5-4能够在厌氧条件下高效溶解磷酸钙和植酸钙等无机磷和有机磷。施用该菌发酵液可提高土壤中的有效磷含量，从而促进植物生长。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是丁酸梭菌A5-4的16s rDNA序列，序列号是GU227149(参见：NCBI genbank链接http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/281484423)。
图1：本发明的技术流程图。
图2：在以植酸钙为唯一磷源的改良PVK培养基中接种丁酸梭菌A5-4，发酵液中植酸酶、磷酸酶酶活变化曲线。图中：○为植酸酶；★为碱性磷酸酶；■为酸性磷酸酶。
图3：在以磷酸钙为唯一磷源的改良PVK培养基中接种丁酸梭菌A5-4，发酵液中气相色谱检测有机酸谱图。图中：(I)毛细管柱Thermo TR-WAX分离有机酸谱图；(II)毛细管柱Thermo TR-5分离有机酸谱图。a为乙酸；b为丁酸；l为乳酸；f为富马酸；s为丁二酸；α为α-酮戊二酸；g为葡萄糖醛酸；u为未能鉴定物质。
具体实施方式
实施例1：丁酸梭菌A5-4的分离筛选及鉴定
从湖北省武汉市洪山区狮子山地区华中农业大学养猪场的化粪池底泥中采集样品，经LB液体培养基，37℃静置、富集培养12小时后，将所得的丁酸梭菌A5-4菌液稀释后涂布于改良PVK固体培养基平板(见后所述)，于37℃厌氧培养7天，挑取溶磷圈直径与菌落直径比值较大的菌株，并对其解磷能力进行定量分析。采用改良PVK液体培养基(液体培养基中不添加琼脂)37℃下静置培养7天，用钼锑抗比色法(张祥胜，钼锑抗比色法测定磷细菌发酵液中有效磷含量测定值影响的因素分析，安徽农业科学，2008，36(12)4822-4823；赵小蓉等，细菌解磷能力测定方法的研究，微生物通报，2001，28(1)1-3)检测发酵液中可溶性磷的含量。根据溶解磷酸钙和植酸钙能力的高低，筛选高效厌氧解磷菌，即获得A5-4候选菌株(该候选菌株的解磷能力见表2所述)。
上述分离筛选的丁酸梭菌A5-4的LB培养基组分及配比：牛肉膏3g(单位)，蛋白胨10g(单位)，NaCl 5g(单位)，补充蒸馏水至1L，调pH至7.2。
上述改良PVK培养基组及配比为：葡萄糖5g，酵母粉3g，(NH4)2SO4 2g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，KCl 0.2g，MnSO4·H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.03g，Ca3(PO4)2或植酸钙5g，补充蒸馏水至1L，调培养基的pH至7.3，即得到改良PVK培养基的液体培养基。其中添加18g/L琼脂粉的即为改良PVK固体培养基。
上述所有的培养基均按照常规方法灭菌(即在121℃下高温蒸汽灭菌20min，下同)。
本发明利用形态学、生理生化实验检测和16SrDNA序列分析，对本发明制备的丁酸梭菌A5-4的分类进行分子生物学辅助鉴定，具体结果如表1所示：
16SrDNA序列PCR扩增采用通用引物27FP1(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反应体系为：10mM的dNTP 0.5μL，模板DNA 1μL，10×PCR buffer 5μL，25mM Mgcl23μL，引物各1μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，ddH2O 37.5μL；预变性：95℃ 3分钟，循环1次；变性：95℃ 1分钟，退火55℃ 1分钟，延伸72℃ 2分钟，循环35次；终延伸：72℃ 5分钟。琼脂糖凝胶电泳分离、提取目标条带，送华大基因公司(武汉)测序，序列见SEQ ID NO：1所示，
申请人将该候选菌株鉴定为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，见表1.保藏该菌株，备用。
表1丁酸梭菌A5-4菌株与丁酸梭菌标准株(Clostridium butyricum)主要生物学特征鉴定对比
Figure GSA00000096140400041
注明：丁酸梭菌生物学特征描述参照第八版《伯杰氏细菌学鉴定手册》，科学出版社，1984，761-766页。
实施例2：丁酸梭菌A5-4的种子培养及发酵生产试验1
(1)制备丁酸梭菌A5-4一级种子液：取甘油管保藏的丁酸梭菌菌种A5-4200μL，接种于装有15mLRCM液体培养基的试管(18×180mm)中，37℃静置培养10小时，制成丁酸梭菌A5-4一级种子液，一级种子液的活菌数达到3×108个/mL；
(2)制备二级种子液：将步骤(1)的一级种子液按体积份3％接种量接入装有二级种子培养基的培养瓶中，于37℃下静置培养10小时，制成二级种子液，二级种子液的活菌数达到2.5×108个/mL；
丁酸梭菌A5-4二级种子培养基的组分及其配比如下：
葡萄糖22.0g，酵母粉4g，蛋白胨6g，K2HPO4 3g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，水1L，pH7.3。
(3)发酵培养：将步骤(2)的丁酸梭菌A5-4二级种子液按体积份的3％接种量接入装有发酵培养基培养瓶中，37℃静置培养60小时。获得的发酵液中丁酸梭菌A5-4活菌数≥1.0×109个/mL。
发酵培养基配方为：葡萄糖19.0g，玉米淀粉8.0g，豆粕35.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨6.0g，K2HPO4 3.0g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.02g，水1L，pH7.0。
上述所有的培养基均按照常规方法灭菌(即在115℃下高温蒸汽灭菌30min，下同)
实施例3：丁酸梭菌A5-4的扩大培养和发酵生产试验2
根据实施例1和实施例2的方法，本实施例中的二级种子培养和发酵生产的培养基配方如下：
二级培养培养基：
葡萄糖20.0g，玉米淀粉3g，酵母粉4.0g，蛋白胨4.5g，K2HPO4 3g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，水1L，pH7.3。于37℃下静置培养12小时，所得二级种子液中的活菌数达到2.8×108个/mL；
发酵培养基：
葡萄糖24.0g，玉米淀粉5.0g豆粕38.0g，玉米浆8.0g，蛋白胨4.0g，K2HPO4 4.0g，NaCl0.3g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.02g，MnSO4·H2O 0.02g，水1L，pH7.5。37℃静置培养60小时，获得的发酵液中丁酸梭菌A5-4菌数≥1.2×109个/ml。
实施例4：丁酸梭菌A5-4在水稻盆栽试验的应用
在盆栽土壤中按每克土107个活菌的接种量接入丁酸梭菌A5-4菌液，对照接入等体积不含菌体的发酵培养基；混匀后播种“汕优63”稻种(一个中国大面积推广应用的水稻品种)，于温室中培养。
温室培养条件为：培养室昼夜循环为16h光照/8h黑暗，室温昼夜控制在26±2℃-20±2℃，相对湿度控制在70±5％。盆栽试验结束后(历时49d)，收获植株，测量株高、根长、鲜重，70℃烘干至恒重后测干重，消化、检测叶片含磷量。取根际士样检测其可溶性磷含量，试验结果见表3。试验结果表明，本发明分离的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)A5-4能显著促进水稻生长，鲜重、干重、株高、根长及含磷量与对照相比分别提高了48.4％、70％、99.4％、106％，52.6％。而根际土壤有效磷含量比对照组提高了53.2％，。
表2丁酸梭菌A5-4在固体平板和液体培养基上的解磷指数和解磷能力
Figure GSA00000096140400061
*解磷指数：HD/CD＝溶磷圈直径/菌落直径
解磷能力：发酵液中可溶性磷含量
表3丁酸梭菌A5-4发酵液对水稻促生长效果(盆栽试验)
Figure GSA00000096140400062
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>华中农业大学
 
<120>高效解磷的丁酸梭菌A5-4及应用
 
<130>
 
<141>2010-04-20
 
<160>1
 
<170>PatentIn version 3.1
 
<210>1
<211>1426
<212>DNA
<213>丁酸梭菌(Clostridium butyricum)
 
<220>
<221>gene
<222>(1)..(1426)
<223>
 
<400>1
cgccggacct acttacgtcg aacgctggcg gcgtgcttaa cacatgcaag tcgagcgatg   60
aagctcttcg ggagtggatt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctca  120
tagaggggaa tagcctttcg aaaggaagat taataccgca taagattgta gtaccgcatg  180
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tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca  300
ttgggactga gacacggccc agactctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg  360
gggaaaccct gatgcagcaa cgccgcgtga gtgatgactg tcttcggatt gtaaagctct  420
gtctttaggg acgataatga cggtacctaa ggaggaagcc acggctaact acgtgccagc  480
agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggatat actgggcgta aagggagcgt  540
aggtggatat ttaagtggga tgtgaaatac ccgggcttaa cctgggtgct gcattccaaa  600
ctggatatct agagtgcagg agaggaaagg agaattccta gtgtagcggt gaaatgcgta     660
gagattagga agaataccag tggcgaaggc gcgtttctgg actgtaactg acactgaggc     720
tcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga     780
atactaggtg taggggttgt catgacctct gtgccgccgc taacgcatta agtattccgc     840
ctggggagta cggtcgcaag aattaaaact caaggaattg acgggggccc gcacaagcmg     900
cggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt acctagactt gacatctcct     960
gaattactct gtaatggagg aagccacttc ggtggcagga agacaggtgg tgcatggttg    1020
tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttattgt    1080
tagttgctac catttagttg agcactctag cgagactgcc cgggttaacc gggaggaagg    1140
tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgtctagcg ctacacacgt gctacaatgg    1200
tcggtacaat gagatgcaac ctcgccagag tgagcaaaac tataaaaccg atctcagttc    1260
ggattgtagg ctgaaactcg cctacatgaa gctggagttg ctagtaatcg cgaatcagaa    1320
tgtcgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagttgg    1380
caataccaca agttcgtgag ctaacatggc agcacaccgc gggtca                   1426

Claims (4)

1.一株能在厌氧条件下溶解磷酸钙和植酸钙的丁酸梭菌，其特征在于，该菌株为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)A5-4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2010052。
2.包含权利要求1所述菌株的微生物菌剂
Figure FSA00000096140300011
3.权利要求1所述的丁酸梭菌A5-4在溶解磷酸钙和植酸钙中的应用。
4.权利要求2所述的菌剂在溶解磷酸钙和植酸钙中的应用。
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Assignee: Wuhan Chopper Lvya Biotechnology Co., Ltd.

Assignor: Wuhan Huazhong Agricultural University Assets Management Co., Ltd.

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Denomination of invention: High-efficiency phosphate-solubilizing Clostridium butyricum A5-4 and applications

Granted publication date: 20110831

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Record date: 20130425

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