CN102051340B - 一种中度嗜盐的无机解磷功能菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及保藏号为CGMCC No.4212的一种中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8，本发明属微生物技术领域。目前我国滨海盐土种植中缺乏有效的无机解磷菌。本发明涉及的菌株分离自海底沉积物，其能在pH值为4-9、NaCl浓度为0.5-15％(w/v)的环境中生长。本发明涉及的菌株具有溶解磷酸钙的能力，实验室培养结果表明该细菌能使初始pH值为7.8，可溶性磷浓度为0的含磷酸钙的培养基中最终可溶性磷浓度达到280mg/l，pH值降至5。本发明提供的无机解磷菌菌株YH8由于有较广的pH值和NaCl生长适应范围，可适应滨海盐土生存环境，并能明显降低培养环境的pH值，这使本发明十分有意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物。
背景技术
滨海盐土是我国重要土地资源的一部分。我国有长约3000km的海岸线，估计在15米等深线内的浅海与滩涂有2.1亿亩，其中长江口以北的江苏、山东、河北、辽宁诸省滨海盐土面积就达1500万亩，滩涂面积则难估计。另外，由于气候等原因，这些数字每年还在增加，比如仅十几年来，黄河河口年平均推进速度为2.77km，年平均造陆面积为46.33平方公里，即年增6.95万亩土地。与此相对，从1998年到2007年，我国耕地面积从19.45亿亩下降至18.26亿亩，随着人口的不断增长，人口对土地的压力将进一步增大。开发和利用沿海滩涂等盐土对于我们缓解人口对耕地的压力提供了一个可行的方向，也是我国农业生产中十分迫切和重要的任务。滨海盐土的特征是整个土体盐分含量高，盐分组成以氯化物为主，且pH高，可溶性磷酸盐含量低，绝大部分以难溶性磷酸盐的形式存在。而在滨海盐土的改造利用中，虽然耐盐作物可以被引入和培养生长，但由于滨海盐土的高含盐量、高pH值、有效N/P和有机质含量低等特性严重影响作物生长和种子萌发率，最终导致作物产量低，生态改造效果不明显，经济效益不显著。目前提高土壤中磷的有效性促进植物高产的技术主要是施加磷肥，但实践表明施入土壤中的磷有75-90％很快与土壤中的钙等结合，形成难溶性的磷酸盐，积累在土壤中，致使磷肥的利用率较低，而化肥的过度投入又会加重土地板结，对滨海系统造成面源污染，影响整个系统的可持续发展。
事实上，大部分滨海盐土缺磷是“遗传学缺磷”而非“土壤学缺磷”，其中潜在的磷库含量很大，但提供作物生长发育的磷流却很小。如何挖掘滨海盐土潜在磷库资源，发展生态型农业生产，是国家区域农业综合开发的重点和难点，近十年来在这方面的研究受到国家有关部门和农业科技界的高度重视。研究表明，土壤磷素循环是以微生物活动为中心的，微生物的活动对磷的转化和有效性影响很大：在微生物的生命活动将产生有机酸(如柠檬酸、乳酸、苹果酸等)，这些有机酸通过螯合土壤中的钙和降低pH使土壤中的磷酸钙不稳定，释放出磷，这种解磷作用最终能够将土壤中难溶性的磷酸盐转化为水溶性有效磷，从而改善作物磷素营养状况，促进作物的生长，因此开展高效溶磷微生物的研究并加大该类微生物肥料的应用，对滨海盐土农业持续发展有重要的理论意义和实际意义。但在我国滨海盐土农业生产中，微生物肥料使用率不到20％(发达国家达到50％)，究其原因主要是菌种问题。目前市面上磷细菌肥料中的磷细菌多来源于陆源环境，虽然在普通土壤环境中解磷效果好，但不适应滨海盐土的环境条件，在滨海盐土中施用时，菌种存活繁殖力低，存活时间短，解磷效果不稳定。在这样的情况下，本发明提供的菌种可以很好的在较广的pH值和NaCl范围内适应生长，并能明显降低培养环境的pH值，增加有效磷的含量，这使本发明将会有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前滨海盐土农业生产中缺乏有效磷细菌的问题，而提供一种能在高盐、高pH值条件下活跃生长繁殖的无机解磷菌。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
本发明通过以不同的盐度和无机磷培养基为富集条件，从我国黄海近海沉积物中取样，分离筛选得到多株菌，经过多级筛选，获得一株中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8(Kushneria sp.)。该菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.4212，保藏日期为2010年9月30号。中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8(Kushneria sp.)通过16S rDNA基因序列比对分析与其最相近的种属是Kushneria属的Kushneriaaurantia(Genbank AM941746)，同源性为95％，因此该菌为被命名为Kushneria sp.，属于Kushneria属，为好养菌，革兰氏阴性，氧化酶阴性，接触酶阳性；在MA培养基(Difco，货号：212185)上形成淡黄色菌落，菌落为圆形；其DNA基因组的G+C含量是60.1mol％；其16S rDNA的Genbank登陆号为HQ284161。该菌NaCl生长耐受范围为0.5-15％(w/v)；该菌能在pH值为4-9的环境中生长。本发明从斜面挑取中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8(Kushneria sp.)菌落接种于装有100ml A液体培养基的250ml三角瓶中，接种量为105cfu/ml；28℃、150rpm/m震荡培养10天后，将菌液8000rpm/m离心10min，取上清夜，利用钼蓝比色法测定上清夜的有效磷含量，有效磷含量超过280mg/l；对上清夜进行pH值测定，pH值为5；所述的A培养基为：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.036g，MnSO4·7H2O 0.03g，Ca3(PO4)2 12.0g，NaCl 30g，去离子水1000ml，pH值7.8，在115℃灭菌30min。
本发明的优点在于：中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8(Kushneria sp.)，有较广的pH值(4-9)和NaCl(0.5-15％)(w/v)生长适应范围，在生长繁殖中能明显降低培养环境的pH值，增加培养环境有效磷含量。
附图说明
图1为本发明所述菌株在无机磷细菌固体培养基上产生的透明圈
具体实施方式
实施例1菌株的筛选纯化与保藏
样品采集：采样地点为中国黄海近海(36.50N，123.82E)沉积物，样品采集后，装入灭菌的封口聚乙烯袋中，置于冰盒内带回实验室，-20℃保存。
菌株筛选纯化：将上述采集的样品，取1g移入100ml灭菌海水中震荡均匀，稀释成不同的梯度10-3、10-4和10-5，从中取出100μl以涂布法接种于高盐的无机磷细菌固体培养基中，每个梯度三个重复，28℃，72h培养后挑选产生透明圈的阳性菌落进一步筛选和纯化验证。在纯化验证过程中，培养条件为28℃培养7天，选取能稳定产生较大透明圈的菌株进一步纯化验证，经过五次筛选，获得了无机解磷功能菌YH8(Kushneria sp.)(见图1)。
所述无机磷细菌固体培养基配方为：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.036g，MnSO4·7H2O 0.03g，Ca3(PO4)2 12.0g，NaCl 30g，琼脂20g，去离子水1000ml，pH值7.8，在115℃灭菌30min倒平板，冷却后备用。
本实施例分离得到的无机解磷功能菌YH8YH8(Kushneria sp.)，属于Kushneria属。为好养菌，革兰氏阴性，氧化酶阴性，接触酶阳性；在MA 2216培养基(Difco，货号：212185)上培养2天后形成淡黄色菌落，菌落为圆形；其DNA基因组的G+C含量是60.1mol％；其16S rDNA的Genbank登陆号为HQ284161。
菌株保藏：该菌已经于2010年9月30号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.4212。在实验室中，该菌株长期保藏方式为将菌株加入含30％甘油的MB 2216培养基(Difco，货号：279110)培养基中，在-80℃保存；短期保藏方式为将菌株接种在MA 2216培养基斜面上，在4℃保存备用。
实施例2无机解磷功能菌YH8盐度及pH值生长耐受性试验
一、盐度生长耐受性试验
盐度梯度培养基配置：以无盐LB培养基为基础培养基，向其中补充NaCl得到盐度分别为0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0，12.0，15.0，20.0，25.0及30.0％(w/v)的一系列盐度梯度培养基，pH值7.8，在115℃灭菌30min后冷却备用。
所述无盐LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母膏5g，蒸馏水1000ml，pH值7.4-7.8
将无机解磷功能菌YH8以105cfu/ml浓度接种于盐度梯度培养基，每个梯度设三个重复，接种后在28℃条件下振荡培养10d，记录菌株生长情况，菌株YH8在NaCl浓度为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0，12.0，15.0％(w/v)的培养条件下可以生长。
二、pH值生长耐受性试验
pH值梯度培养基配置：以MB 2216培养基为基础培养基，向其中加5M NaOH或2M HCl溶液调整其pH值得到pH值分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的一系列盐度梯度培养基，在115℃灭菌30min后冷却备用
将无机解磷功能菌YH8以105cfu/ml浓度接种于pH值梯度培养基，每个梯度设三个重复，接种后在28℃条件下振荡培养10d，记录菌株生长情况，菌株YH8在pH值为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的培养条件下可以生长。
实验结果表明：无机解磷功能菌YH8有较广的pH值和NaCl生长适应范围，该菌NaCl生长耐受范围为0.5-15％(w/v)；该菌能在pH值为4-9的环境中生长。
实施例3无机解磷功能菌YH8解磷能力测定
一、制备无机解磷功能菌YH8解磷发酵液
本实施案例分实验组和空白对照组。
实验组：将无机解磷功能菌YH8(Kushneria sp.)以105cfu/ml浓度接种于装有100ml无机磷细菌解磷液体培养基的250ml三角瓶中，设三个重复，28℃、150rpm/m震荡培养10天得到解磷发酵液。用奥立龙MODEL818型pH计测定发酵液pH值。
空白对照组：对照中不接种无机解磷功能菌YH8。
无机磷细菌解磷液体培养基配置：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O0.036g，MnSO4·7H2O 0.03g，Ca3(PO4)2 12.0g，NaCl 30g，去离子水1000ml，pH值7.8，在115℃灭菌30min冷却后备用。
二、有效磷测定
有效磷测定采用钼蓝比色法测定
1)标准曲线制作：分别取标准溶液0、1、2、3、5mL，用蒸馏水稀释到10ml，然后加入200uL的抗坏血酸溶液混匀后放置15min，加入200uL的混合溶液混匀，20min后测定OD800nm值。
2)解磷发酵液有效磷测定：将上述解磷发酵液8000rpm/m离心10min，取上清夜20uL稀释到10ml，然后加入200uL的抗坏血酸溶液混匀后放置15min，加入200uL的混合溶液混匀，20min后测定OD800nm值。
标准溶液：配100mmol/L的KH2PO4母液，使用液浓度为100umol/L。
抗坏血酸溶液：10克溶于100mL水中。
混合溶液：22.5mL钼酸铵溶液加2.5mL酒石酸锑钾，然后用6mol/L的硫酸定容至100ml。
钼酸铵溶液：10克溶于100mL水中。
酒石酸锑钾：6克溶于200mL水中。
测定结果表明，实验组发酵液pH从初始7.8下降到5.0，有效磷含量超过280mg/l；空白对照组中pH维持7.8，有效磷含量为1mg/l。
Claims (5)
1.一种中度嗜盐的无机解磷功能菌，其特征在于中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8属于Kushneria属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4212，保藏日期为2010年9月30号。
2.根据权利要求书1所述的一种中度嗜盐的无机解磷功能菌，其特征在于中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阴性，接触酶阳性；在MA培养基上形成淡黄色菌落，菌落为圆形；其DNA基因组的G+C摩尔百分含量是60.1％。
3.根据权利要求书1所述的一种中度嗜盐的无机解磷功能菌，其特征在于中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8 NaCl生长耐受范围为0.5-15％w/v。
4.根据权利要求书1所述的一种中度嗜盐的无机解磷功能菌，其特征在于中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8能在pH值为4-9的环境中生长。
5.根据权利要求书1所述的一种中度嗜盐的无机解磷功能菌，其特征在于：从斜面挑取中度嗜盐的无机解磷功能菌YH8菌落接种于装有100ml A液体培养基的250ml三角瓶中，接种量为105cfu/ml；28℃、150rpm震荡培养10天后，将菌液8000rpm离心10min，取上清夜，利用钼蓝比色法测定上清夜的有效磷含量，有效磷含量超过280mg/l；对上清夜进行pH值测定，pH值为5;
所述的A液体培养基为：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O0.3g，KCl0.3g，FeSO4·7H2O0.036g，MnS04·7H2O0.03g，Ca3(PO4)212.0g，NaCl30g，去离子水1000ml，pH值7.8，在115℃灭菌30min。
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| "一株解磷中度嗜盐菌的分离鉴定及解磷特性分析";向文良 等;《微生物学通报》;20090320;第36卷(第3期);第320-327页 * |
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