CN103333832A

CN103333832A - 一株盐沼鳞质霉菌及其发酵产酸方法和应用

Info

Publication number: CN103333832A
Application number: CN2013102708655A
Authority: CN
Inventors: 钦佩; 李思宇; 张焕仕
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2013-10-02

Abstract

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种盐沼鳞质霉菌及其发酵产酸方法和应用。本发明所述盐沼鳞质霉菌SM-1（ApophysomycesspartinaSM-1）是从海滨盐沼中分离纯化获得，通过形态学和18SrDNA、28SrDNA、ITS等分子生物学鉴定，确定为毛霉科鳞质霉菌属的一个新种，定名为盐沼鳞质霉菌（Apophysomycesspartina），于2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7717。本发明所述盐沼鳞质霉菌可用于盐土改良和盐生植物的培养种植。

Description

一株盐沼鳞质霉菌及其发酵产酸方法和应用

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种盐沼鳞质霉菌及其发酵产酸方法和应用。

背景技术

土壤中具有解磷作用的微生物种类很多，包括细菌、放线菌和真菌。目前报道的解磷微生物中，细菌的种类最多，解磷真菌在数量和种类上远不及解磷细菌，主要是青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergilhu)和根霉属(Rhizopus)。然而前人报道解磷真菌的解能力一般要比细菌强，且细菌在进一步分离纯化时解磷能力减弱，真菌仍然能保持较高的解磷活力。现在，解磷微生物对难溶无机磷酸盐的解磷机制一般认为是菌体在生命活动中分泌出各种有机酸，将难溶性磷溶解出来，也称为“酸解作用”。据研究，青霉、曲霉、肠杆菌和欧文氏杆菌等之所以能溶解无机磷酸盐，主要是由于分泌有机酸溶解磷矿粉。有的微生物不产生有机酸也具有解磷能力，它们可能与呼吸作用放出CO₂溶于水形成的碳酸和NH⁴⁺/H⁺交换机制相关。而当土壤有效磷低于一定值时，微生物和植物受到低磷胁迫，通常在碱性环境中便会分泌胞外磷酸酶、核酸酶、脱氢酶和植酸酶等物质，将卵磷脂、核蛋白、植素等有机磷酶解，释放无机磷供给植物利用。本发明旨在从我国苏北滩涂土壤中分离获得到一种安全可靠的耐盐真菌类解磷菌，利用其很好的解磷效果，用于盐土改良和盐生植物的培养种植。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是针对盐土缺磷（特别是有效磷）的现状，从我国苏北互花米草滩涂土壤中分离得到一种解磷真菌，盐沼鳞质霉菌及其发酵产酸方法和应用。

本发明的技术方案：

本发明所述菌株是来自盐城国家级珍禽自然保护区互花米草滩涂土壤，命名为盐沼鳞质霉菌（Apophysomyces spartina），2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院北京微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.7717。

本发明还公开了上述盐沼鳞质霉发酵产酸的方法：以5%接种量接种到改良马丁液体培养基中，培养基中NaCl含量为1.26%，装液量150mL/250mL，pH 6.0-7.0，28℃摇床培养，转速160rpm，2－4天后，发酵液pH值急速下降，此时菌液含菌量为6.7 × 10⁸个菌落ml^-1，至第7天，pH值平均下降至2.27。

与现有技术相比，本发明有益效果

（1）盐沼鳞质霉具有很好的解磷效果，不仅对盐土改良有益，而且对植物和土壤动物（蚯蚓）是安全的，有利于植物的生长。可应用于盐土改良和盐生植物的培养和种植。

（2）利用改良马丁培养基（NaCl含量为1.26%）做基质发酵，7天即可达产酸高峰，发酵液可用于盐土改良。

（3）通过简单接种发酵培养，3天为一培养周期可大规模生产解磷菌(此时菌液含菌量为6.7 × 10⁸个菌落ml^-1)，节省大量动力和人工费用；

（4）盐沼鳞质霉具有耐盐、高效解磷、对植物和土壤动物（蚯蚓）无害、安全性高的特点。

附图说明

图1 马丁固体培养基培养3天后盐沼鳞质霉菌SM-1菌落形态

图2 马丁液体培养基中的盐沼鳞质霉菌SM-1菌球

图3盐沼鳞质霉菌SM-1的不规则网状菌丝（A）和膨大结构（B）

图4盐沼鳞质霉菌SM-1的孢子（A和B为囊状分生孢子；C和D为畸变菌丝分生孢子）

图5 盐沼鳞质霉菌SM-1基因组18S rDNA ,28S rDNA(D1/D2区), ITS区PCR扩增电泳图谱

图6使用引物1构建的系统发育进化树

系统进化树运用MEGA4.0软件中的邻接近法（Neighbor-Joining）对测序结果与GenBank数据库的相似序列进行同源性分析。删除缺口和缺失的数据后共有1369bp的长度，进化距离运用最大似然方法（maximum Composite Likelihood）方法，显示出最优树分枝长度之和为0.80662650）

图7 使用引物2构建的系统发育进化树

系统进化树运用MEGA4.0软件中的邻接近法（Neighbor-Joining）对测序结果与GenBank数据库的相似序列进行同源性分析。删除缺口和缺失的数据后共有389bp的长度，进化距离运用最大似然方法(maximum Composite Likelihood）方法，显示出最优树分枝长度之和为5.19011349）

图8 使用引物3构建的系统发育进化树

系统进化树运用MEGA4.0软件中的邻接近法（Neighbor-Joining）对测序结果与GenBank数据库的相似序列进行同源性分析。删除缺口和缺失的数据后共有512bp的长度，进化距离运用最大似然方法（maximum Composite Likelihood）方法，显示出最优树分枝长度之和为2.04458796)

图9 玉米拌种法接种盐沼鳞质霉菌SM-1安全性实验（其中，A接菌液；B对照）。

具体实施方式

1 实验材料，仪器，药品，培养基

1）实验材料：盐城国家级珍禽自然保护区互花米草滩涂(33°36′E, 120°36′N)不同的三个采样点表层土壤分离得到的同种真菌，由南京大学盐生植物实验室分离保存，编号为SM-1。

2）药品：

形态学观察试剂：磷酸氢二钾、硫酸镁、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、琼脂、硫酸、甲醇、草酸丁二酸、苯甲酸、苹果酸、二氯乙烷硫酸二钠。

ITS序列测定实验试剂：NaCl、Tris-HCl pH8.0、EDTA、PVP、CTAB、β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、NaAC、乙醇、琼脂糖、PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP 、ITS1(10μM) 、ITS4(10μM) 、ddH2O、Takara Taq酶(5U/μl) 、Takara 胶回收试剂盒、pMD®8-T Vector*1、JM109 感受态细胞、SOC培养基、 X-Gal、IPTG、Amp。

扩增18SrDNA引物1为：正向NS1：5＇- GTAGTCATATGCTTGTCTC-3＇

反向NS8：5＇- TCCGCAGGTTCACCTACGGA -3＇

扩增ITS片段引物2为：正向ITS1:5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇

反向ITS4:5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇

扩增28SrDNA引物3为：正向NL-1：5＇-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG -3＇

反向 NL-4：5＇-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3＇

3）主要仪器

扫描电子显微镜 (JSM一840) 日本电子公司

光学显微镜日本公司

PCR仪(2400型) 美国公司 PerkinElmer

微量移液器芬兰公司 Dragon

恒温摇床上海市平仪器设备有限公司

微型电泳槽(DYCP一33A型) 北京市六一仪器厂

电热恒温水浴锅(H.H.sll一6b型) 上海医疗器械五厂

微波炉格兰仕公司

高速冷冻离心机 (3K3O) 德国公司 Sigma

隔热式电热恒温培养箱 (PHO30A型) 上海一恒科学仪器有限公司

一20℃低温冰柜/4℃冰箱 Haier公司

生化培养箱(LRH一250A型) 广东省医疗器械厂

精密电子天平 (BPZIID型) 美国公司Sartorius

压力蒸汽灭菌器(LD2X-50K BS) 上海申安仪器厂

旋转蒸发仪N-1000 日本Eyela

飞行时间质谱仪英国Micromass公司

气相色谱仪美国Agileue

4）选用的培养基：

改良马丁培养基：磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，氯化钠13g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，自然pH。

2盐沼鳞质霉菌筛选

1)菌落培养特征观察

将盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）接种在改良马丁培养基上，且为固体琼脂平面培养基，培养皿直径为9cm,接种后放入28℃恒温培养箱培养7d,记录相关形态特征，包括：菌落表面特征，菌落颜色，菌落边缘，铺满时间。

2)菌株个体形态特征的观察

将菌株接入含有改良马丁培养基的培养皿中，再取已灭菌处理的盖玻片呈45°角插入接种的培养基中，且盖玻片与接种线垂直，盖玻片插入的深度为培养基厚度的1/3。将处理好的培养皿置入28℃恒温培养箱内培养，定期观察并做记录，待盖玻片上的菌丝长势良好，取出并用光学显微镜观察并拍照，待盖玻片上的菌丝开始变黄，取出处理后用扫描电镜观察并拍照。

3 )ITS序列的提取、测序及分析

(1)总DNA的提取

菌株用马丁液体培养基摇床培养3天后提取总DNA。

试剂：2×CTAB法提取液（1000ml）：0.7molNaCl,100mmolTris-HCl pH8.0, 20mmolEDTA,10gPVP混匀121℃30min高压灭菌，冷却后加1ml的β-巯基乙醇。

TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl,1mmol/L EDTA pH8.0。

步骤：

将新鲜菌丝用无菌吸水纸吸干后称量,按照50mg左右菌丝加600ul2×CTAB提取缓冲液，少许灭菌石英砂，在钵体中将菌丝充分研磨。

充分研磨后移入1.5m1的Eppendorf管中，在超级微量恒温器65℃下水浴30min。

加等体积的氯仿：异戊醇[体积比为24：1]，充分混匀，4℃下8000rpm离心5min。

将上清液移到一新Eppendorf管中，加10%体积的3mol/L的NaAc溶液，pH为6.0。

加2.5倍体积的冰冻乙醇，沉淀。4℃下10000rpm离心5min，弃上清。

70%的酒精洗涤2次，晾干，加TE缓冲液充分溶解后，1%的琼脂糖凝胶电泳检测(130V,17min)。提取到的总DNA于4℃冰箱保存，或置于-20℃下长期保存备用。

2) PCR扩增及产物回收

PCR反应

体系为50μl，包括3μl DNA模板，5μl 10×PCR 缓冲液，4μl MgCl2(25mM)，4μl dNTP混合物(各2.5mM)，2μl ITS1(10μM)，2ul ITS4(10μM)，0.5μl Takara Taq酶(5U/μl)，用ddH2O标定到50μl。

反应所用程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1，共28个循环，最后72℃延伸5min。用1-1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。Takara胶回收试剂盒回收PCR产物。

(2) AT克隆

a) 在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。

试剂使用量：pMD®18-T Vector*1 1μl，模版1μl，dH2O 3μl

b) 加入5μl（等量）的Solution I，16℃反应 30 分钟。(注:室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低;5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低)。

c) 全量（10μl）加入至 100μlJM109 感受态细胞中，冰中放置30分钟。

d) 42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置1分钟。

e) 加入 890μl SOC培养基，37℃振荡培养 60分钟。

f) 在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

g) 挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。

h) 将挑取的菌落送到上海华大生物公司测序。

(3)进化分析

将测序结果在Genbank数据库和EMBL数据库进行比对，在运用BioEdit、ClustalX、Tree View X、MEGA4.0等生物软件进行处理,建立系统进化树。

3.发酵液产酸及安全性检测

1）发酵液的制备及pH值的测量

改良马丁液体培养基：磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，氯化钠13g，加1000ml水。培养条件为：接种量5%，装液量150mL/250mL，温度28℃，转速160rpm。实验组和阴性对照组各三个重复，每隔24小时测一次pH值。

2 ）有机酸定性定量

溶液的配置

10%硫酸甲醇溶液：将硫酸和甲醇至冰箱1小时，在冰冷和搅拌条件下，将50ml浓硫酸缓慢加入450ml的甲醇中摇匀。

苯甲酸内标溶液：精确称量2g苯甲酸加入20ml甲醇。

标准溶液：精确称量草酸2g，丁二酸0.1g，苹果酸0.1g，加入250ml容量品中，用甲醇定容。

样品处理：马丁液体培养基培养7天，用滤纸过滤，量筒量取100ml的滤液置250ml容量瓶中备用。

甲酯化和萃取：上述标准溶液和样品中各加入1ml苯甲酸内标溶液和50ml10%硫酸甲醇溶液，30℃160mpr震荡过夜24h，用CH₂CL₂萃取3次，30ml/次，合并有机相。50ml饱和NaCl溶液洗涤2次。加入25g无水Na₂SO₄ 静置过夜，过滤，样品滤液置旋转蒸发仪中蒸干，5mlCH₂Cl₂溶解即稀释20倍，取1ml做GC分析。

工作曲线绘制，对各个酸的测量，估算出标准溶液的浓度梯度：

草酸标准溶液浓度梯度为：20mg/ml,10mg/ml,5mg/ml，丁二酸，苹果酸，苯甲酸浓度梯度为：1mg/ml,0.2mg/ml,0.1mg/ml，做GC分析，每个浓度梯度进3次样。根据分析结果分别绘制草酸，苹果酸，丁二酸的工作曲线。

GC和飞行时间质谱分析条件：

质谱条件：EI源电子能量70eV，电子倍增器电压1976V，质量扫描范围：30~550arftu，离子源温度210℃，四极杆温度150℃，将采集到的质谱图用Nist02谱库检索。

色谱条件：色谱柱：HP-5C(30m×0.25mm×0.25um)；进样量：1ul，分流（10：1）；进样口温度：250℃;载气：N2；程序升温40℃下保持2min，然后以5℃／min的速率升至240℃，保持2min，检测器：FID；检测器温度：300℃。

4. 植物安全性试验

1 ）仪器与材料

试验仪器：人工气候箱、恒温培养箱、电子分析天平、电子秤、喷雾器、烧杯1L等。

试验基质：人工土壤：蛭石；10%;黄棕壤（南京市紫金山采取）；90%无菌水

植物材料：

小麦种子：烟农21 山东省烟台市农业科学研究院

水稻种子：郑旱2号河南省农科院粮食作物研究所

玉米种子：郑单958 河南省农科院粮食作物研究所

蓖麻种子：淄蓖麻7号山东省淄博市农业科学研究院

海滨锦葵种子：南京大学盐生植物实验室从美国引种

2 ）菌液的制备

改良马丁液体培养基：磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，氯化钠13g，加1000ml水。

种子液制备：接种量5%，装液量150mL/250mL，转速160rpm，3d。

应用菌液培养条件为：接种量5%，装液量150mL/250mL，温度28℃，转速160rpm，7d，过滤，弃菌丝，滤液备用。

3）试验方法

（1）剪叶法

此方法常用于叶斑细菌病、稻白叶枯病等，病原菌发病率可达100%。将水稻、小麦、蓖麻、海滨锦葵和玉米播种在灭菌的人工土壤中，光照培养箱25℃，光照强度30000lx，光培养对暗培养为13/12小时，湿度为60%。选择生长良好植株生长均一的小麦、蓖麻、水稻和玉米植株；将剪刀煮沸、酒精消毒，蘸取菌悬液，剪去叶尖，继续光照培养7d，灭活菌悬液作对照。

（2）喷雾法

主要用于通过检测农作物植株自然伤口侵入的细菌病害，如水稻细菌性条斑病等。选取生长良好的水稻、小麦、蓖麻、海滨锦葵和玉米植株，用无菌喷雾器正反面喷雾，保湿48h，继续光照培养7d，灭活菌液为对照。

（3）拌种法

主要用于检测土传病害，适用于小麦等作物。用无菌水浸泡玉米和小麦种子，24h后放在铺有无菌滤纸的培养皿上，光照培养待其萌发。人工土壤一灭菌后盛入塑料杯。分别将10ml菌液、10ml灭活菌液、10ml无菌水以及已经萌发的小麦种子混匀，装入塑料杯子，用无菌水定时定量浇灌，20d光照培养。

5. 蚯蚓毒理学试验

1）仪器与材料

试验仪器：人工气候箱、恒温培养箱、电子分析天平、电子秤、喷雾器、吹风机、烘箱、移液器、96孔板、培养皿（直径9cm）、烧杯1L、滤纸（直径12cm）和报纸等。

试验基质：人工土壤：草炭10%(pH值约为5. 5~6.0,无明显植物残体)；高岭黏土20%(高岭石含量在30%)；石英砂68%(50～200μm粒径的细砂含量在50%以上)；碳酸钙2%(分析纯)。

配置人工土壤前，分别取一定量各个组分的物质，在105℃条件下烘干称重，测定其各自的含水量，然后按比例混合人工土壤，加入去离子水,充分混合均匀。在试验开始前，添加一系列的高浓度受试物储备液与人工土壤相混合，配置成不同暴露浓度的试验介质。每个高颈烧杯中装入750g(湿重)的试验介质和10条蚯蚓。这些受试蚯蚓在试验前需冲洗干净，装瓶时放在人工土壤表面，待其自行爬入试验介质中。用具孔的保鲜膜封好容器以防试验介质变干。

动物材料：蚯蚓赤子爱胜蚓(Eisenia foetida) 国际标准(OECD 207)实验蚯蚓之一，购于白蒲太平洋养殖厂,实验用蚯蚓在温度为22℃、湿度为70%的培养室内预养14d,不做疾病处理。在与实验时相同的环境条件下驯养了7d。供试蚯蚓驯养期间，,用专门的蚯蚓食物进行喂养，至实验开始前24h为止,驯养期间该批蚯蚓健康。选取生殖环带明显，体重为400mg左右的蚯蚓进行实验。

2）试验方法

人工土壤试验

在正式实验之前,先进行较大范围浓度系列的预实验，为正式实验设置受试物的浓度提供依据。每个测试浓度设置3个平行样，每一系列设一组对照。预实验周期为7d，于20±2℃、湿度80%、连续光照的条件下进行。第7d时检查蚯蚓死亡情况。根据预实验的结果，进行正式实验的浓度如表4-1所示，正式实验中对照组和处理组各设置3个平行处理，每个处理10个重复。具体实验步骤和条件与预实验相同,实验周期为14d，第7d和14d时检查蚯蚓死亡情况。第7d检查结束后,将实验介质和蚯蚓重新置于瓶中，第14d时再进行相同的检查，记录死亡情况。

6.实验结果与分析

1）盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）的培养特征

经观察，盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）在改良马丁培养基中，复苏能力和长势快，铺满培养皿的时间仅5天，菌丝较密，菌落边缘为全缘。培养皿中的菌落颜色正面白色，反面浅褐色，菌落中间凹陷，边缘长势茂盛，菌落可长至培养皿盖，菌丝体没有气味（图1）。接种在马丁液体培养基上,形成白色菌球，直径18mm±3mm，培养基黄色清澈（图2）。

2）菌株的形态特征

个体特征：菌丝在距离分枝基部(10-)12(-20)um有一横隔，气生菌丝体直立，有分支, 菌丝直径粗细不均匀，同一枝菌丝有粗细也不一致，直径大小为(2.5-)7 (-9)um，杂乱无定向生长，相互连接成不规则网状，节点上常有4-7个囊状小泡；菌丝中间形成直径为(14-)15(-18)×(20-)28(-30)um的膨大部分并分出3-7枝次级菌丝，如图3～4所示；孢子有两种形成方式：孢子梗白色直立，长度为(10-)20(-40)um，顶端形成近球形囊状直径为（10-)15(-17)um，当营养缺乏时产生(2–)5(–10)个孢子，而营养充足时则长出(1-)2(-5)根新菌丝，有时同时形成分生孢子和菌丝；另一种形成方式是孢子形成于褶皱畸形的孢子丝，由一层膜包裹，膜遇水容易溶解，孢子为椭球形(4-)4.5(-5)×(6-)6.5(-7)um diam，表面有白色凸起，一部分孢子基部常常塌陷。接合孢子白色，近球形(18–)20(–25)×（25-）27（-29）µm，如图4。

3）分子鉴定

（1）测序结果

基因组DNA扩增结果：盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）基因组中18S rDNA, 28S rDNA(D1/D2区), ITS PCR扩增结果：以盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）基因组DNA为模板，通过引物1，引物2和引物3进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明：该菌DNA扩增产物分别为清晰特异的DNA条带，其中18S rDNA条带大小为1900bp-2000bp; 28S rDNA(D1/D2区)条带大小为750bp左右；ITS条带大小为800bp-850bp（图5）。

（2）进化树的构建与分析

测序结果在 www.ncbi.nlm.nih.gov上于Genbank数据库进行BLAST同源性比对分析后与三个片段均相近两个属的种，其名称，来源和相应基因片段在数据库中的编号由表1所示。

表1 相近种的种名，来源和GenBank数据库编号

A,使用引物1扩增18S rDNA片段构建系统进化树

由图6可知，使用引物1获得的序列构建系统发育进化树结果为：盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）与Apophysomyces elegans和 Saksenaea vasiformis亲缘关系较近且以高自展率为一枝，并与登录号为AF113412.1 Apophysomyces elegans同源性为99%,即该菌为Apophysomyces属的一种。

B.使用引物2扩增的TIS片段构建系统进化树

由图7可知，选取毛霉科中两个相似属Apophysomyces和Saksenaea的所有种，科内相关菌株以及科外Coemansia reversa共同构建系统进化树。可以看出盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）与Apophysomyces elegans, Apophysomyces variabilis, Apophysomyces ossiformis 和Apophysomyces trapeziformis高自展率为一枝。

C.使用引物3扩增28S rDNA（D1/D2区）片段构建系统进化树

由图8可知，使用引物3获得的序列构建系统发育进化树与引物1和引物2结果一致，盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）与Apophysomyces elegans, Apophysomyces variabilis, Apophysomyces ossiformis和Apophysomyces trapeziformis高自展率为一枝，并与Apophysomyces elegans同源性最近为96%，覆盖率为100%。

结合形态学的观察，宏观上盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）显示出与Misra et.al.描述的Apophysomyces属基本特征基本一致，在普通培养基难以形成孢子，有假根，菌丝为絮状，白色后转灰黄色，有少量隔等。但是微观上有明显的差异：Apophysomyces属孢囊有钟形或漏斗状的骨凸，孢子在顶端形成，而盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）孢囊无骨凸，孢子在孢囊顶端或畸变菌丝上形成。

在生理方面，Apophysomyces属已知种均有致病性，往往从破损的皮肤侵入并进入血管生长，从而引发多种炎症。而盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）至今并无致病性案例，它适应盐生环境，能分泌大量有机酸，并有很强的解磷能力。

综合上述分子生物学、形态特征及生理特征，推测该毛霉菌为Apophysomyces属的一个新菌种，命名为：Apophysomyces spartina Li et Qin。

7. 发酵液产酸及安全性检测结果

1) 发酵液pH值动态变化

如表2所示实验组pH值随时间的推迟而下降，在培养第2天到第4天间，pH值大幅度下降。到第7d时，实验组平均下降到2.27。而对照组pH值平均为6.45。统计学上P<0.0l，该菌对培养基pH值影响极显著。

表2 培养7d内菌液pH动态变化

时间（d）	0	1	2	3	4	5	6	7
									样品pH	6.68	6.62	5.54	3.31	3.28	2.84	2.37	2.28
对照组pH	6.68	6.63	6.63	6.34	6.34	6.33	6.32	6.31

2 )发酵液有机酸定性定量

飞行时间质谱法测得有机酸种类为：草酸、丁二酸、苹果酸和微量的柠檬酸。根据标准工作曲线得到各个酸的回归方程，将测量所得面积带入回归方程，经过使用Excel软件分析得到样品溶液的有机酸分别为：草酸：652.50mg/L，丁二酸：9.14mg/L，苹果酸：3.16mg/L。将测得有机酸的标准样品放入没有接菌的培养基中，测得pH值平均为2.88。

8.植物安全性试验结果

观察各个植株有无病害和生长状况，记录并拍照。经过观察，喷雾法、剪叶法、拌种法接种盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）均没有病斑出现。五种植株在喷雾法中，叶片均出现一定的烧苗现象（酸度过大所致）；在剪叶法中，五种植株均没有病斑，并且蓖麻和海滨锦葵叶子均有自动愈合现象；在拌种法中，接菌处理和灭活菌处理的小麦和玉米植株比对照的长势好，发酵液在一定程度上刺激了作物的生长（图9）。试验证明，盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）的使用对上述植物是安全的，而且由于其解磷作用，提高了土壤中的有效磷水平，有利于植物对土壤养份的吸收，促进了植物的生长。

9.蚯蚓毒理学试验结果

人工土壤法蚯蚓毒理学试验结果见表3。菌液对蚯蚓的毒害随着培养时间的增加而增加，随着菌液浓度增加而增加，呈现明显的剂量-效应关系。菌液浓度为100ml/kg和125ml/kg时,蚯蚓放入土壤表面，随后钻入土中，14d后长得粗壮，死亡率分别为0和6.67%；菌液浓度为150ml/kg和175ml/kg时，蚯蚓接触到土壤几分钟后钻入土中，死亡率为30%和43.3%；菌液浓度为200ml/kg和225ml/kg时，蚯蚓死亡率达到73.3%和96.67%，蚯蚓接触到土壤后向烧杯边缘爬去，有明显的逃逸现象，14d后存活的蚯蚓个体变小，尾部脱节。

表3 人工土壤法蚯蚓死亡情况

Figure 2013102708655100002DEST_PATH_IMAGE002

以菌液浓度为横坐标，蚯蚓死亡率为纵坐标作标准曲线得人工土壤法7d时蚯蚓死亡率与菌液浓度的回归方程：y=0.0049x2-0.8736x+36.548，由此方程算出，解磷菌液使用后7天蚯蚓的LC₅₀为192.58ml/kg。而人工土壤法14d时蚯蚓死亡率与菌液浓度的回归方程：y=0.0031x2-0.2252x-10.452，由此方程得出，解磷菌液使用后14天蚯蚓的LC₅₀为187.42ml/kg。

蚯蚓作为检验菌肥安全性的生物标志之一，毒性等级用投毒系数的大小表示，即投毒系数=实际用量/ LC50值，投毒系数大于50的为高毒级，在5～50的为中毒级，小于5的为低毒级。而人工土壤法培养蚯蚓7d和14d的投毒系数分别为0.34和0.36，远小于低毒级。据我们南京大学盐生植物实验室研究施用该菌作为菌肥的最佳剂量66.7ml/kg，远低于本试验设计的最低用菌量100ml/kg，所以实际施用盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomyces spartina SM-1）最佳剂量对于检验菌肥安全性的模式土壤动物赤子爱胜蚓来说，完全在安全范围以内。

Claims

1.一种盐沼鳞质霉菌，其特征是从海滨盐沼中分离纯化获得的一株盐沼鳞质霉菌SM-1（Apophysomycesspartina SM-1），通过形态学和18SrDNA、28SrDNA、ITS分子鉴定，命名为盐沼鳞质霉菌（Apophysomycesspartina），2013年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7717。

2.根据权利要求1所述的盐沼鳞质霉菌的发酵产酸方法，其特征是以5%接种量接种到改良马丁液体培养基中，培养基中NaCl含量为1.26%，装液量150mL/250mL，pH 6.0-7.0，28℃摇床培养，转速160rpm，2－4天后，发酵液pH值急速下降，此时菌液含菌量为6.7 × 10⁸个菌落ml^-1，至第7天，pH值平均下降至2.27。

3.根据权利要求1所述的盐沼鳞质霉菌在盐土改良或盐生植物的培养种植中的应用。