WO2008113873A1 - Un cultivo puro de la cepa ah2 de la especie bacillus velezensis y producto para el control biológico de hongos fitopatógenos. - Google Patents

Un cultivo puro de la cepa ah2 de la especie bacillus velezensis y producto para el control biológico de hongos fitopatógenos. Download PDF

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phytopathogenic fungi
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biological control
plant growth
strain
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Ana Isabel Fernandez Martinez
Mario Jorge Villaverde Fernandez
Juan Antonio Casanova Roca
Jorge Malo Lopez-Roman
José Antonio NICOLAS MARTINEZ
Isidro BLANCA PICÓ
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Probelte, Sa
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    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the object of the present invention is a product for the biological control of phytopathogenic fungi, consisting of viable cells of a new isolate of Bacillus velezensis (Ruiz-Garc ⁇ a et al., 2005) strain AH2, which has a high activity antifungal, particularly against different phytopathogenic fungi, as well as a good ability to stimulate plant growth through different mechanisms.
  • the product has been formulated from a fermented broth, obtained by means of a shaken submerged culture, which is used directly in the formulation. This formulation maintains a high activity for at least six months at room temperature.
  • the Bacillus velezensis AH2 strain used in obtaining the formulation is also a reason for the present invention.
  • rhizosphere due to the relationships established here between plants and other organisms (Warrior, 2000). Since the 1980s, rhizosphere microorganisms have been studied as possible substitutes for chemical pesticides to control a wide range of diseases. Due to their abundant distribution in soil, their ability to colonize the roots of plants, and to produce a wide variety of beneficial compounds, as well as antagonists of a high number of pathogens, these organisms are very suitable for the biological control of pests and diseases. (Anjaiah et al., 1998; HiII et al., 1994; Maurhofer et al., 1991; Rodr ⁇ guez, and Pfender. 1997; Ross et al., 2000 and Thomashow et al., 1997).
  • fungi constituted by fungi. It has been used successfully in the control of pathogenic fungi belonging to the genera Botrytis, Fusarium, Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotinia, Penicillium, and Macrophomina and others (Whipps and Lumsden, 2001, McQuilken et al., 2001, Jones and Whipps, 2002, among others). Given its diverse metabolism, this microbial group is capable of producing a wide variety of substances useful for biological control.
  • the biocontrol can also result from a direct interaction between the pathogen and the biocontrol agent (parasitism), by hydrolytic enzymes such as chitinases and glucanases, or the joint action of these and toxic metabolites (Benitez, et al., 2004).
  • hydrolytic enzymes such as chitinases and glucanases
  • PGPR plant growth promoting rhizobacteria
  • the fundamental particularity of this type of agents is that in addition to their protective effect, they have a wide capacity to colonize the roots of plants and a great stimulating power of plant growth, which unites the overall effect of the health of the plants. crops and in this way, the plant is also more resistant to attack by pathogens.
  • the genus Pseudomonas has been the subject of numerous studies over the years because it is one of the most active and dominant agents in the rhizosphere (Geels and Schippers, 1983, of Freitas and Germida 1991, of Ia Cruz et al., 1992, Ligón , et al., 2000, US Pat 7,087,424).
  • Members of the genus produce different antibiotics that are closely related to the reduction and suppression of plant diseases.
  • Another factor that plays a fundamental role in this phenomenon is the production of siderophores, which also contributes to the growth of plants by means of iron supply. This ability is widespread in members of the genus Pseudomonas.
  • the inability of the genus to produce resistance structures during its growth limits the stability and effectiveness of the biopreparations obtained with strains of this genus to some extent.
  • the genus Bacillus has also been widely studied, for presenting great potential in this regard. This has as its main characteristics the fact of being practically omnipresent in all types of soils, which unites a high thermal tolerance, a rapid growth in liquid media and the formation of resistance spores that allows it to survive for long periods of time. All this gives the strains of the genus a great potential as biocontrol agents.
  • the North American Environmental Protection Agency (EPA) has registered more than ten strains of different species of this genus as biopesticides and in particular biofungicides (EPA 2006).
  • the main mechanisms associated with the biocontrol of phytopathogenic fungi through strains of this genus also include the production of antibiotics, siderophores, surfactants and hydrolytic enzymes such as chitinases among others (Utkhede, 1984, Acea et al., 1988, Stanghellini and Miller 1996, Shoda 2000, Banat et al., 2000, Zhang, et al., 2001, Ruiz-Garc ⁇ a et al., 2005, US Pat 7,087,424 and EP1647188).
  • chitinases among others (Utkhede, 1984, Acea et al., 1988, Stanghellini and Miller 1996, Shoda 2000, Banat et al., 2000, Zhang, et al., 2001, Ruiz-Garc ⁇ a et al., 2005, US Pat 7,087,424 and EP1647188).
  • the object of the present invention is a product for the biological control of phytopathogenic fungi, consisting of viable cells of a new isolate of Bacillus velezensis (Ruiz-Garc ⁇ a et al., 2005) strain AH2. Said strain was isolated from soils of Ia
  • Murcia region The fundamental characteristic of this isolate is that it presents a high antifungal activity against different agents that cause diseases of crops of economic interest, such as fungi of the genus Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Alternaria, Fusar ⁇ um, Phytophthora, Thielaviopsis and Botryosphaeria, among others. On the other hand, it has the ability to stimulate plant growth by different mechanisms. Said microorganism has been deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) that has assigned the CECT-7221 deposit numbers. The strain was identified by the authors and the identification in the CECT was also requested.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • the product for the biological control of phytopathogenic fungi and the stimulation of plant growth, consists of a liquid formulation that contains viable spores of the crop as the main active material.
  • the microorganism Bacillus velezensis strain AH2 CECT-7221, as well as its mutants are also the subject of this invention. It was obtained through a procedure that combines isolation in Nutritive Agar medium (Oxoid), prior elimination of vegetative cells, and the selection through its antagonistic ability against different phytopathogenic fungi, also taking into account the ability to stimulate growth vegetable (Fernández 2004). The ability to inhibit fungal growth was determined in in vitro bioassays in Potato Dextrose Agar (PDA) medium (Oxoid).
  • PDA Potato Dextrose Agar
  • the strain AH2 was selected among all the isolates tested, for its wide capacity to inhibit the growth of different phytopathogenic fungi, such as species of the genera Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Alternaria, Fusar ⁇ um, Phytophthora, Thielaviopsis and Botryosphaeria .
  • the plant growth stimulating power was verified by laboratory bioassays, according to the methods described by Bashan et al., 1986, Fernández 1995 and Bashan 1998. Their capacity to stimulate plant growth by greenhouse bioassays (Villaverde et al. 2004).
  • the object of this invention is the method of obtaining the product for the treatment of diseases caused by phytopathogenic fungi, which consists of the following steps: a) Growth and sporulation of Bacillus velezensis strain AH2 in a suitable culture medium by submerged fermentation. In this step, cell count values of the order of 10 9 colony forming units per milliliter (UFCmL "1 ) are reached b) Preparation of the formulated by adding, to the fermented broth with the cells, of the other components.
  • This product has good stability and preserves the cell viability, without significant losses, for at least six months, at temperatures not exceeding 30 0 C.
  • the antifungal and plant growth stimulating activities of the formulation have been tested for more than six months, preserving its initial properties. In its application in greenhouse trials, it has demonstrated effectiveness in the treatment of diseases caused by different phytopathogenic fungi and for the stimulation of plant growth.In the field trials it has also demonstrated effectiveness in the treatment of phytopathogenic fungi and particularly of cinematic Botrytis.
  • a blister isolated Bacillus velezensis strain AH2 of retained was taken, seeded in PDA medium plates and incubated at 30 0 C for 72 hours for activation. From this plate an inoculum was prepared for the fermenter, taking a portion of the culture with a handle, with which a 1000 mL Erlenmeyer flask was inoculated, with 100 mL of Dextrose Potato Broth (PD) medium and incubated with stirring at 30 0 C for 16 h. After this time the contents of the flask were inoculated in a 3 L Braun Biotech BIOSTAT ® B fermenter with PD medium, reaching a final volume of 2 L.
  • PD Dextrose Potato Broth
  • the fermentation was carried out for 24 h at a stirring speed of 600 rpm , aeration of 1 vvm (2 L.min '1 ) and a temperature of 30 0 C.
  • the pH was allowed to vary freely and in the end it had a value ⁇ 5.5.
  • a final concentration of 2 x 10 9 cells was reached.
  • the specific rate of growth in exponential phase ( ⁇ ) was 0.40 h " 1 .
  • the different growth phases were developed during the first 14 h of cultivation and then the sporulation process took place until 24 h.
  • the 2 L of fermented broth were taken and 0.5, 0.1 and 0.2% propionic, sorbic and ascorbic acids were added respectively.
  • Figure 1 shows the in vitro antagonism tests against some of the pathogens tested. As can be seen, there is a strong fungal growth inhibitory activity in each of the phytopathogenic fungi tested.
  • Planting frame 1 m x 0.6 m
  • Planting density Approx. 16600 plants / ha
  • Foliar spray Target pathogen of the test Botrytis cinerea Reference product: Karbel (Registered in ROPMF N 0 23506/14
  • a trial with a block design was performed, completely randomized with four repetitions.
  • the size of the elementary plot was 15 m 2 and 60 m 2 of total area for each treatment.
  • Two applications were made during the test by foliar spray, T 1 and T 2 , in a broth volume of 1200 L / ha. The first, 2.5 months after planting and the second after 17 days of performing the first.
  • V 0 rating No symptoms of the disease were observed.
  • First assessment V 1 (One week after the second treatment)
  • AFS has had a very good activity regarding the witness who has not received any treatment.
  • AFS at a dosage of 15 mL / L is a formulation suitable for the control of cinematic Botrytis in tomato.

Abstract

Un cultivo puro de Ia cepa AH2 de Ia especie Bacillus velezensis y producto para el control biológico de hongos fitopatógenos. La invención se refiere a un nuevo producto fungicida para el control biológico de hongos fitopatógenos que contiene un nuevo aislado de Bacillus velezensis cepa AH2, depositada en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con Ia denominación CECT-7221, Ia cual posee una elevada capacidad antagonista frente a este tipo de patógenos, así como Ia propiedad de estimular el crecimiento vegetal por diferentes mecanismos. Se describe también un formulado líquido que posee una buena estabilidad a temperatura ambiente y que resulta efectivo en el tratamiento de enfermedades producidas por hongos fitopatógenos y para Ia estimulación del crecimiento de plantas.

Description

UN CULTIVO PURO DE LA CEPA AH2 DE LA ESPECIE BACILLUS VELEZENSIS Y PRODUCTO PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE HONGOS FITOPATÓGENOS.
OBJETO DE LA INVENCIÓN El objeto de Ia presente invención es un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos, constituido por células viables de un nuevo aislado de Bacillus velezensis (Ruiz-García y col., 2005) cepa AH2, que presenta una elevada actividad antifúngica, particularmente frente a diferentes hongos fitopatógenos, así como una buena capacidad para estimular el crecimiento vegetal mediante diferentes mecanismos. El producto ha sido formulado a partir de un caldo fermentado, obtenido mediante un cultivo sumergido agitado, el cual es utilizado directamente en Ia formulación. Este formulado mantiene una elevada actividad por al menos seis meses a temperatura ambiente. Constituye además motivo de Ia presente invención Ia cepa de Bacillus velezensis AH2 empleada en Ia obtención del formulado.
ESTADO DE LA TÉCNICA.
Desde hace años, ha sido reconocida Ia necesidad e importancia de desarrollar y ampliar los procedimientos de Producción Integrada y de Agricultura Ecológica, como alternativa al uso indiscriminado de productos químicos en Ia agricultura, para reducir los efectos nocivos de estos últimos. El uso de biopreparados a partir de microorganismos para el control biológico de plagas y enfermedades, así como para Ia fertilización de cultivos de interés comercial, se presenta como una de las alternativas más prometedoras dentro de este contexto. Además, estos biopreparados desempeñan un importante papel en los modelos de agricultura sostenible debido a Ia posibilidad de producirse a partir de recursos renovables (Altieri, 1997).
La ventaja fundamental que tiene esta vía es que por basarse en mecanismos naturales, se trata de una alternativa ecológica, respetuosa con el medio ambiente, no contaminante, y que reduce notablemente los riesgos de adquisición de resistencia por parte de los patógenos. También, al ser selectivos en su modo de acción, en general es poco probable que dañen a otros organismos beneficiosos y en muchos casos benefician al ecosistema y estimulan el crecimiento vegetal, haciendo más sostenible Ia producción agrícola, a Ia vez que los efectos sobre Ia salud humana son mínimos o nulos. Prácticamente todas las plagas y enfermedades son afectadas en alguna medida por organismos antagonistas. En muchos casos estos entes biológicos representan el factor más importante en Ia regulación de las poblaciones de organismos patógenos en Ia naturaleza. Uno de los grupos más importantes entre los organismos causantes de enfermedades de las plantas son los hongos fitopatógenos, que incluye especies de los géneros Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Alternaría, Fusarium, Phytophthora,
Thielaviopsis y Botryosphaeria entre muchos otros, los cuales pueden sobrevivir durante muchos años en el suelo.
En Ia búsqueda de agentes para el control biológico que puedan llegar a tener un interés comercial, hay que tener en cuenta una serie de factores que estudiados en su conjunto pueden conducir a un resultado exitoso. Entre estos se podría mencionar, los entes biológicos a utilizar ya sea independientemente o en inóculos mixtos, Ia actividad biológica específica, los mecanismos de acción frente al patógeno, el sistema de producción empleado, así como el tipo de formulación y su estabilidad (Warrior, 2000).
Diversos mecanismos han sido descritos para explicar el fenómeno de control biológico de estos patógenos, tales como parasitismo, protección cruzada, antibiosis, competición e inducción de resistencia, entre otros (Shoda, 2000, Walsh y col.. 2001).
Uno de los nichos ecológicos más estudiados ha sido Ia rizosfera, por las relaciones que aquí se establecen entre plantas y otros organismos (Warrior, 2000). Desde Ia década de los 80 se ha venido estudiando los microorganismos de Ia rizosfera, como posibles sustitutos de los plaguicidas químicos para controlar una amplia gama de enfermedades. Debido a su abundante distribución en suelo, su capacidad de colonizar las raíces de las plantas, y de producir una gran variedad de compuestos beneficiosos, así como antagonistas de un elevado número de patógenos, estos organismos resultan muy adecuados para el control biológico de plagas y enfermedades. (Anjaiah y col., 1998; HiII y col., 1994; Maurhofer y col., 1991 ; Rodríguez, y Pfender. 1997; Ross y col., 2000 y Thomashow y col., 1997).
Entre los grupos microbianos de Ia rizosfera, que han sido ampliamente estudiados como agentes de control biológico de plagas y enfermedades producidas por los microorganismos, se encuentra el constituido por los hongos. El mismo ha sido empleado con éxito en el control de hongos patógenos pertenecientes a los géneros Botrytis, Fusarium, Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotinia, Penicillium, y Macrophomina y otros (Whipps y Lumsden, 2001 , McQuilken y col., 2001 , Jones y Whipps, 2002, entre otros). Dado su metabolismo tan diverso, este grupo microbiano es capaz de producir una gran variedad de sustancias útiles para el control biológico. Por estas razones, el número de cepas y productos a base de hongos para este fin es cada vez más amplio y variado (Cook y col., 1996, Whipps, 1997, Fravel y col., 1998, EPA USA 2006. US Pat 6,306,386 y US Pat 6,890,530 entre otros). Los mecanismos mediante los cuales se ejerce el control biológico de las enfermedades son complejos y se sabe que puede ser el resultado de Ia adición o sinergia entre varios de ellos. Entre estos se encuentra Ia competición por los nutrientes y el espacio, Ia capacidad de producir sustancias que impiden Ia germinación de Ia espora (fungistasis) o de producir muerte celular (antibiosis) y Ia modificación de Ia rizosfera acidificando el suelo, Io que impide Ia proliferación del patógeno. El biocontrol también puede resultar de una interacción directa entre el patógeno y el agente de biocontrol (parasitismo), mediante enzimas hidrolíticos tales como quitinasas y glucanasas, o Ia acción conjunta de éstas y los metabolitos tóxicos (Benitez, y col., 2004). El empleo de las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) para el control biológico de plagas y enfermedades ha sido también ampliamente estudiado. La particularidad fundamental de este tipo de agentes es que además de su efecto protector, poseen una amplia capacidad de colonizar las raíces de las plantas y un gran poder estimulador del crecimiento vegetal, Io que une al efecto protector una mejora general de Ia sanidad de los cultivos y de esta forma, Ia planta es también más resistente al ataque de los patógenos. Este grupo de agentes ha sido empleado en enfermedades producidas por hongos fitopatógenos pertenecientes a los géneros Rhizoctonia, Fusarium, Pythium, Thielaviopsis, Penicillium, Alternaría y Botrytis entre otros (Emmert y handelsman, 1999, Ligón, y col., 2000, Cavaglieri, y col., 2004 y Roberts, y col., 2005, US Pat 7,118,739, entre otros).
El género Pseudomonas ha sido objeto de numerosos estudios a Io largo de años por ser uno de los agentes más activos y dominantes en Ia rizosfera (Geels y Schippers, 1983, de Freitas y Germida 1991 , de Ia Cruz y col., 1992, Ligón, y col., 2000, US Pat 7,087,424 ). Miembros del género producen diferentes antibióticos que están íntimamente relacionados con Ia reducción y supresión de enfermedades de plantas. Otro factor que juega un papel fundamental en este fenómeno es Ia producción de sideróforos, Io cual contribuye además, al crecimiento de las plantas por Ia vía del suministro de hierro. Esta habilidad está muy extendida en miembros del género Pseudomonas. Sin embargo, Ia incapacidad del género para producir estructuras de resistencia durante su crecimiento, limita en alguna medida Ia estabilidad y efectividad de los biopreparados obtenidos con cepas de este género.
El género Bacillus también ha sido ampliamente estudiado, por presentar grandes potencialidades en este sentido. Éste tiene como características principales el hecho de estar prácticamente omnipresente en todo tipo de suelos, a Io cual une una elevada tolerancia térmica, un rápido crecimiento en medios líquidos y Ia formación de esporas de resistencia que Ie permite sobrevivir durante largos periodos de tiempo. Todo esto le confiere a las cepas del género un gran potencial como agentes de biocontrol. La Agencia Norteamericana de Protección del Medioambiente (EPA) tiene registradas más de diez cepas de diferentes especies de este género como bioplaguicidas y en particular biofungicidas (EPA 2006). Los principales mecanismos asociados al biocontrol de hongos fitopatógenos mediante cepas de este género, también incluyen Ia producción de antibióticos, sideróforos, surfactantes y enzimas hidrolíticos tales como quitinasas entre otros (Utkhede, 1984, Acea y col., 1988, Stanghellini y Miller 1996, Shoda 2000, Banat y col., 2000, Zhang, y col., 2001, Ruiz- García y col., 2005, US Pat 7,087,424 y EP1647188). Otros géneros bacterianos han sido también estudiados como agentes para el biocontrol, entre los que se encuentran los géneros, Enterobacter, Alcaligenes, Stenotrophomonas y Streptomyces (McCIure, y col., 1998, Brewster y col., 1997, Sabaratnam and Traquair, 2002, Cavaglieri y col., 2004 y otros).
La forma física de un producto biopreparado es también un factor de gran importancia y que es necesario tener en cuenta. Lo que se busca, es que los microorganismos permanezcan viables en estado inactivo o metabólicamente activos (Fernández, 1995). Este último es uno de los problemas más importantes de Ia Biotecnología Agrícola, pues se trata no solamente de que las células microbianas se mantengan viables durante largos periodos de tiempo, sino que sean capaces de sobrevivir en el ambiente y realizar Ia función para Ia que fueron destinados.
Cuando se trata de microorganismos esporógenos, generalmente existe una flexibilidad mayor en cuanto a Ia formulación, pues estos organismos pueden sobrevivir durante largos periodos de tiempo, siendo capaces de germinar y multiplicarse una vez restablecidas las condiciones favorables. Las técnicas de inmovilización celular ofrecen toda una serie de ventajas con respecto a las células libres que las hacen muy atractivas para su aplicación práctica (Fernández, 1995, Vassileva y col., 1998a y 1998b, entre otros) y muy particularmente para Ia biotecnología ambiental. El empleo de células inmovilizadas puede potenciar los efectos de los microorganismos sin crear problemas de contaminación, dando lugar a productos muy activos y novedosos (Bellota y col., 1994, Núñez, 1998, Fonseca, 1998, Pat Esp. ES2234417).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El objeto de Ia presente invención, es un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos, constituido por células viables de un nuevo aislado de Bacillus velezensis (Ruiz-García y col., 2005) cepa AH2. Dicha cepa fue aislada de suelos de Ia
Región de Murcia. La característica fundamental de este aislado, es que presenta una elevada actividad antifúngica frente a diferentes agentes causantes de enfermedades de cultivos de interés económico, tales como hongos de los géneros Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Alternaría, Fusaríum, Phytophthora, Thielaviopsis y Botryosphaeria, entre otros. Por otra parte, posee Ia capacidad de estimular el crecimiento de las plantas por diferentes mecanismos. Dicho microorganismo ha sido depositados en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) que Ie ha asignado los números de depósito CECT- 7221 La cepa fue identificada por los autores y se solicitó además Ia identificación en Ia CECT. La identificación dé especie en Ia CECT se llevó a cabo mediante amplificación directa por PCR del gen del 16S rRNA, secuenciación parcial del mismo (con lecturas en las dos direcciones) y análisis de las secuencias, concluyéndose finalmente que se trata de Bacillus velezensis. El producto, para el control biológico de hongos fitopatógenos y Ia estimulación del crecimiento vegetal, consiste en una formulación líquida que contiene como materia activa principal, esporas viables del cultivo.
El microorganismo Bacillus velezensis cepa AH2 CECT-7221 , así como sus mutantes constituyen igualmente objeto de esta invención. El mismo fue obtenido mediante un procedimiento que combina el aislamiento en medio Agar Nutritivo (Oxoid), previa eliminación de células vegetativas, y Ia selección a través de su facultad antagonista frente a diferentes hongos fitopatógenos, teniendo en cuenta además Ia capacidad para estimular el crecimiento vegetal (Fernández 2004). La capacidad para inhibir el crecimiento fúngico fue determinada en bioensayos in vitro en medio Patata Dextrosa Agar (PDA) (Oxoid). Se seleccionó, mediante estos bioensayos, Ia cepa AH2 entre todos los aislados probados, por su amplia capacidad para inhibir el crecimiento de diferentes hongos fitopatógenos, tales como especies de los géneros Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Alternaría, Fusaríum, Phytophthora, Thielaviopsis y Botryosphaeria. El poder estimulador del crecimiento vegetal fue comprobado mediante bioensayos de laboratorio, según los métodos descritos por Bashan y col., 1986, Fernández 1995 y Bashan 1998. A continuación se comprobó su capacidad para estimular el crecimiento vegetal mediante bioensayos en invernadero (Villaverde y col 2004). Por otra parte se comprobó que es capaz de solubilizar fosfatos, de producir ácido indol-3-acético y otras sustancias promotoras del crecimiento vegetal, así como sideróforos. Se determinó también Ia presencia del enzima 1-aminociclopropano 1- carboxilato desaminasa, a través del crecimiento en medios con ácido 1- aminociclopropano 1-carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno. Todas estas actividades corroboran su capacidad de estimular el crecimiento vegetal. Villaverde y col., 2004). De igual manera, es objeto de esta invención, el procedimiento de obtención del producto para el tratamiento de enfermedades producidas por hongos fitopatógenos, el cual consta de los siguientes pasos: a) Crecimiento y esporulación de Bacillus velezensis cepa AH2 en un medio de cultivo adecuado mediante fermentación sumergida. En este paso se alcanzan valores de conteos celulares del orden de 109 unidades formadoras de colonias por mililitro (UFCmL"1) b) Elaboración del formulado mediante Ia adición, al caldo fermentado con las células, de los otros componentes. Este producto tiene buena estabilidad y conserva Ia viabilidad celular, sin pérdidas significativas, por al menos seis meses, a temperaturas no mayores de 30 0C. Las actividades antifúngica y estimuladora del crecimiento vegetal del formulado han sido comprobadas durante más de seis meses, conservando sus propiedades iniciales. En su aplicación en ensayos de invernadero ha demostrado efectividad en el tratamiento de enfermedades producidas por diferentes hongos fitopatógenos y para Ia estimulación del crecimiento vegetal. En los ensayos de campo también ha demostrado efectividad para el tratamiento de hongos fitopatógenos y particularmente de Botrytis cinérea.
MODO DE REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN. Propagación de Ia cepa Bacillus velezensis AH2
Se tomó una ampolla del aislado de Bacillus velezensis cepa AH2 conservado, se sembró en placas de medio PDA y se incubó a 30 0C durante 72 horas, para su activación. De esta placa se preparó un inoculo para el fermentador, tomándose una porción del cultivo con un asa, con Ia que se inoculó un matraz Erlenmeyer de 1000 mL, con 100 mL de medio Caldo Patata Dextrosa (PD) y se incubó en agitación a 30 0C durante 16 h. Al cabo de este tiempo se inoculó el contenido del matraz en un fermentador Braun Biotech BIOSTAT® B de 3 L con medio PD, alcanzándose un volumen final de 2 L. Se llevó a cabo Ia fermentación durante 24 h a una velocidad de agitación de 600 r.p.m., una aireación de 1 v.v.m. (2 L.min'1) y una temperatura de 30 0C. El pH se dejó variar libremente y al final tuvo un valor ≤ 5,5. Se alcanzó una concentración final de 2 x 109 células. mL"1 y aproximadamente un 80% de esporulación. La velocidad específica de crecimiento en fase exponencial (μ) fue de 0,40 h"1. La diferentes fases de crecimiento se desarrollaron durante las primeras 14 h de cultivo y a continuación se produjo el proceso de esporulación hasta las 24 h. Una vez terminada Ia fermentación, se tomaron los 2 L de caldo fermentado y se procedió a añadir ácidos propiónico, sórbico y ascórbico al 0,5, 0,1 y 0,2 % respectivamente.
A este producto se Ie determinó periódicamente Ia viabilidad celular en medio Agar Nutritivo, comprobándose que mantiene más del 80% de viabilidad al cabo de seis meses de conservación a temperaturas no mayores de 30 0C
Con el producto elaborado siguiendo este esquema de fabricación, se llevaron a cabo todos los ensayos sobre Ia capacidad antifúngica y estimuladora del crecimiento vegetal con resultados muy satisfactorios.
ENSAYOS DE ANTAGONISMO IN VITRO.
Estos ensayos fueron realizados en placas de Petri. Se cultivaron los patógenos en placas de PDA por 48-72 horas a una temperatura de 25 0C. A continuación se tomó una porción de aproximadamente 1 cm diámetro, Ia cual fue colocada en el centro de una placa con medio PDA. Dicha placa fue inoculada en los extremos con Bacillus velezensis cepa AH2 mediante un asa. Posteriormente se incubó por 48-72 horas a 28
0C hasta observar Ia inhibición. En el caso del ensayo con Botryosphaeria sp., además se cultivó también en medio PD agitado, se centrifugó y se añadió el sobrenadante en pocilios de 1 cm2 en Ia misma placa para determinar Ia capacidad antifúngica del caldo fermentado libre de células.
En Ia figura 1 se presentan los ensayos de antagonismo in vitro frente a algunos de los patógenos probados. Como puede observarse, existe una fuerte actividad inhibitoria del crecimiento fúngico en cada uno de los hongos fitopatógenos ensayados.
Por otra parte, el ensayo realizado con el sobrenadante del cultivo en el caso de Botryosphaeria sp. demuestra que Ia bacteria posee actividad antifúngica de carácter exocelular, tal como ocurre con otras muchas cepas del género Bacillus.
ENSAYOS DE ESTIMULACIÓN DEL CRECIMIENTO DE PLANTAS
Para comprobar Ia capacidad de estimular el crecimiento vegetal, se llevó a cabo un ensayo en plantas de pepino en condiciones de invernadero experimental en macetas. Como control positivo se utilizó el producto Bioprón PMC3 de Probelte S.A. dada su reconocida capacidad de estimular el crecimiento vegetal de diferentes cultivos.
Los resultados de este ensayo se presentan en Ia figura 2. Como puede observarse en esta figura 2, hubo un notable incremento tanto en el Peso fresco total, como en el de Ia parte verde y el de Ia raíz. Estos valores aunque menores, no se diferenciaron estadísticamente con un 95% de confiabilidad con los obtenidos cuando se usó el Bioprón PMC3, mientras que sí fueron diferentes, como se observa en Ia gráfica, de los valores del control. Estos ensayos fueron realizados en otros cultivos tales como tomate y lechuga, obteniéndose resultados similares, Io que permitió comprobar Ia capacidad estimuladora de crecimiento vegetal de Bacillus velezensis cepa AH2 aislada en los laboratorios de investigación de Probelte S.A.
ENSAYO DE EFICACIA EN CONDICIONES DE PRODUCCIÓN
Referencia del ensayo: AFS Tomate Mazarrón 2006
Nombre producto comercial: AFS
Cultivo: Tomate Amadeo {Licopersicon esc. M)
Condiciones: Invernadero de producción, riego localizado
Marco de plantación: 1 m x 0.6 m
Densidad de plantación Aprox. 16600 plantas/ha
Tipo de suelo: Franco arenoso
Materia activa: Bacillus velezensis cepa AH2, 108 UFC/mL
Uso genérico del producto: Fungicida
Tipo de formulación: Líquido soluble
Modo de aplicación: Pulverización foliar Patógeno objetivo del ensayo: Botrytis cinérea Producto de referencia: Karbel (Inscrito en el R.O.P.M.F. N0 23506 /14
(Carbendazima 25% + Dietofencarb 25%.
1 g/L de Probelte S.A.)
Tesis a ensayar
Tesis Nombre Dosis Materia o materias activas
N 0 1 TESTIGO
N 0 2 AFS 15 (mL/L) Bacillus velezensis 108 UFC/mL
N 0 3 TRL 5 (mL/L) Tríchoderma harzianum + T. viride 108 UFC/mL
N0 4 AFS 5 (L/ha) Bacillus velezensis 108 UFC/mL
N0 5 KARBEL 1 (9/L) Carbendazima 25% + Dietofencarb 25%
Se realizó un ensayo con un diseño en bloques, completamente aleatorizado con cuatro repeticiones. El tamaño de Ia parcela elemental fue de 15 m2 y 60 m2 de área total por cada tratamiento. Se realizaron 2 aplicaciones durante el ensayo mediante pulverización foliar, T1 y T2, en un volumen de caldo de 1200 L/ha. EI primero, 2,5 meses después de plantado y el segundo a los 17 días de realizar el primero.
Para realizar Ia evaluación del ensayo, en Ia parcela elemental se contaron el número total de tomates que tiene cada planta, se anotaron los tomates con Botrytis y se Ie dio un valor de 1 a 4 dependiendo de Ia intensidad del ataque del patógeno y a partir de aquí se realizó el cálculo de Ia infestación. Durante el ensayo se llevaron a cabo 3 valoraciones, una valoración inicial V0 y dos valoraciones una vez terminados los tratamientos, V1 a los 7 días de realizado el segundo tratamiento y V2 a los 15 días.
Resultados del ensayo.
Valoración V0. No se observó síntoma alguno de Ia enfermedad Primera valoración V1 (Una semana después del segundo tratamiento)
Figure imgf000011_0001
Eficacia ABBOT
Figure imgf000011_0002
Test de Rangos Múltiples de Duncan
Figure imgf000011_0003
Figure imgf000012_0001
Segunda valoración V2 (Quince días después del segundo tratamiento)
Eficacia ABBOT
Figure imgf000012_0003
Test de Rangos Múltiples de Duncan
Figure imgf000012_0004
Como puede observarse, en ambas valoraciones el tratamiento de AFS a 15 mL/L, produce una protección efectiva y superior al producto químico comercial usado como control. En todo momento Ia infestación se mantuvo bajo control y Ia efectividad del producto ensayado ha sido muy elevada. El análisis estadístico realizado arrojó que no existen diferencias significativas entre los productos biológicos ensayados y el producto químico control.
Conclusiones:
• En el ensayo realizado en Mazarrón (Murcia), en pulverización foliar para el control de Botrytis cinérea y observar el comportamiento del mismo en el futuro,
AFS ha tenido una muy buena actividad respecto al testigo que no ha recibido ningún tratamiento.
• En Ia valoración V1 se obtuvieron eficacias para Ia dosis de 15 mL/L del orden del 90%, • En Ia valoración V2 las eficacias fueron altas por, encima del 70% y en particular, en el caso de AFS por encima del 80%.
• Destacar que el nivel de incidencia del patógeno en el cultivo se mantiene bajo control con los tratamientos realizados.
• Al realizar el análisis de varianza en ambas valoraciones, sobre los parámetros medidos, al realizar el test de rangos múltiples de Duncan, se ha encontrado que no hay diferencias con un 99% de confiabilidad entre las dosificaciones en estudio y sí con respecto al testigo sin tratar.
• No se observó ningún síntoma de toxicidad en el cultivo a Ia dosis más alta.
• Se concluye por tanto que AFS a dosificación de 15 mL/L es una formulación adecuada para el control de Botrytis cinérea en tomate.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un cultivo puro de Ia cepa denominada AH2 de Ia especie Bacillus velezensis, así como sus mutantes caracterizada por presentar una elevada actividad antifúngica y particularmente frente a hongos fitopatógenos dada su capacidad de producir sustancias antagonistas, así como una buena capacidad para estimular el crecimiento vegetal, siendo Ia cepa capaz de solubilizar fosfatos, producir ácido indol-3-acético y sideróforos, así como capaz de crecer en ácido 1- aminociclopropano 1-carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno, habiendo sido depositada dicha cepa en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número CECT-7221
2. Un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos y estimulador del crecimiento vegetal caracterizado por contener células viables de Bacillus velezensis cepa AH2 (CECT-7221).
3. Un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos y estimulador del crecimiento vegetal según Ia reivindicación 2, caracterizado porque las citadas células viables se encuentran en forma de esporas.
4. Un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos y estimulador del crecimiento vegetal según las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque las células microbianas son obtenidas mediante un proceso de fermentación sumergida en Ia cual se alcanzan concentraciones de esporas mayores de 109 UFC/mL.
5. Un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos y estimulador del crecimiento vegetal según las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado por contener una concentración de esporas total mayor de 109 UFC/mL.
6. Un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos y estimulador del crecimiento vegetal según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por contener, además de las células bacterianas, el sobrenadante del cultivo con materia orgánica y sustancias con actividad antifúngica entre otras.
7. Un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos y estimulador del crecimiento vegetal según Ia reivindicación 2, caracterizado por tener una estabilidad a temperatura ambiente no menor de 6 meses.
8. Un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos y estimulador del crecimiento vegetal según Ia reivindicación 6, caracterizado porque Ia estabilidad es garantizada mediante el empleo de sustancias inhibidoras del crecimiento microbiano.
9. Un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos y estimulador del crecimiento vegetal según las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque Ia sustancia inhibidora del crecimiento microbiano es seleccionada entre uno o varios ácidos orgánicos utilizados como conservantes.
10. Un producto para el control biológico de hongos fitopatógenos y estimulador del crecimiento vegetal según las reivindicaciones 2 a 9 caracterizado porque presenta una elevada actividad al ser aplicado mediante pulverización foliar.
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