CN102212497B

CN102212497B - 一株根瘤菌及其应用

Info

Publication number: CN102212497B
Application number: CN 201110127362
Authority: CN
Inventors: 张晓霞; 马晓彤; 顾金刚; 曹卫东; 姜瑞波
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2031-05-17
Also published as: CN102212497A

Abstract

本发明公开了一株根瘤菌及其应用。该根瘤菌是木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60 CGMCC No.4647。木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60CGMCCNo.4647可促进不同品种毛叶苕子生长，且与每个品种共生结瘤能力较好，可确定该菌为苕子的广谱结瘤菌株，可用于制备绿肥，具有较高的实用性和可推广性，在苕子的种植中具有广阔的应用前景。

Description

一株根瘤菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株根瘤菌及其应用。

背景技术

据估算，生物固氮每年为全球提供大约2.0亿吨氮，其中75％由共生固氮生物所固定，而根瘤菌与豆科植物共生是固氮生物中作用最强的体系，所固定的氮约占生物固氮总量的65％。几乎所有的豆科绿肥，都有相适应的根瘤菌与其共生，在根系上形成大量的根瘤。一般情况下根瘤菌与豆科绿肥建立了良好的共生关系后，就有强烈的固氮作用，为农作物提供了丰富而廉价的氮素营养，对培肥土壤，提高农作物生产起着重大的作用。而根瘤菌的多少与固氮能力的高低，会直接影响绿肥的产量。研究表明，在土壤氮素相同的条件下，所有根瘤菌株并不能使相应豆科植物的不同品种获得同样的接种效果，对一个品种可以产生优异表现的菌株，对另一品种也许只能起诱导次级反应作用。这两种生物之间的交互作用说明根瘤菌与寄主之间需要很好搭配，才能获得最佳固氮效果。陈文新院士根据20多年的研究提出有关根瘤菌与豆科植物共生关系的新见解：同一种植物在不同生态环境中可与不同根瘤菌结瘤固氮；同一生态环境条件下不同植物可与同一根瘤菌共生固氮。因此进行根瘤菌选种时必须针对种植的生态环境及寄主植物两方面因素来选择根瘤菌的最佳匹配，而不是只考虑与寄主的匹配，并认为过去只考虑与寄主关系很可能是接种效果不稳定的原因。

另一方面，由于根瘤菌菌株在人工培养条件容易退化，其固氮性能、侵染豆科植物形成根瘤的能力由于各种氨基酸、金属离子、酚类、噬菌体和抗生素等抗性的影响而逐渐丧失。同时根瘤菌营养缺陷型的变异也常常失掉共生能力。根瘤菌的退化现象表现在不结瘤或者结瘤而不固氮、结瘤能力或者固氮能力降低等，因此需要菌种不断的进行筛选更新。同时大量的研究表明，接种根瘤菌，可提高绿肥单株的结瘤数，增强固氮效率，但其存活时间不一定很长，侵染能力次年会降低，因而根瘤菌接种作为绿肥的一项增产措施，需要连续进行，才能保持结瘤的优势。

综上所述，在绿肥的培育过程中，接种于品种相匹配的根瘤菌尤为重要，同时，结合环境因素，对根瘤菌类型不断地进行筛选更新，以保证其增产作用。

苕子为豆科巢菜属植物，一年生或越生草本植物，适应性广，抗逆性强，是主要绿肥品种。

发明内容

本发明的目的是提供一株木兰根瘤菌及其应用。

本发明所提供的木兰根瘤菌是木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.4647。

以木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60 CGMCC No.4647为活性成分的根瘤菌剂也属于本发明的保护范围。

所述菌剂具体可由所述活性成分和载体组成。

所述载体可为蛭石。

实验证明，木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60 CGMCC No.4647可促进毛叶苕子不同品种的苕子生长，且与每个品种共生结瘤能力较好，可确定该菌为苕子的广谱结瘤菌株，可用于制备根瘤菌接种剂，具有较高的实用性和可推广性，在苕子的种植中具有广阔的应用前景。

保藏说明

菌种名称：木兰根瘤菌

拉丁名：Rhizobium indigoferae

菌株编号：NM60

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC 4647

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2011年3月11日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4647

附图说明

图1A为苕子小区试验中土库曼毛苕未接菌的对照的根系照片。

图1B为苕子小区试验中土库曼毛苕接种ACCC16053的根系照片。

图1C为苕子小区试验中土库曼毛苕接种NM60的根系照片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60CGMCC No.4647的分离鉴定

1、菌种的分离与纯化：

从内蒙古地区采集救荒野豌豆根瘤，选取颜色为粉红色的瘤子，冲洗干净后用3％次氯酸钠表面消毒5min，用无菌水冲洗数次后，用无菌镊子转移至根瘤菌琼脂(I)斜面上，轻轻压破根瘤，划线培养。用根瘤菌琼脂(I)平板法分离纯化菌株，挑取边缘整齐，乳白色，半透明的菌落，革兰氏染色，镜检，如不纯，重复平板划线纯化，菌种编号为NM60。

培养基及组成：根瘤菌琼脂(I)

2、NM60菌种的鉴定：

菌株形态观察：

在上述培养基培养48小时，菌落圆形，乳白色，半透明，边缘整齐。菌体杆状，运动，有鞭毛，有荚膜，内含PHB。

生理生化特征：需氧，最适pH中性、最适生长温度28-30℃，可耐受2％NaCl，pH生长范围为5-11，过氧化氢酶及氧化酶阳性。可利用下列碳源：D-(+)-阿糖醇、葡萄糖酸钙、糊精、D-阿拉伯糖、半乳糖醇、葡萄糖、D-葡萄糖酸钠、D-核糖、D-(+)-半乳糖、山梨糖醇、蔗糖、水杨素、麦芽糖、乳糖、肌醇、木糖；不利用己二酸、丙二酸钙、绵子糖、海藻糖、L-鼠李糖、D-(-)-果糖、菊糖、D-(+)-松三糖、山梨糖、蜜二糖、淀粉、香草酸；利用如下氮源：L-(-)-天冬氨酸、L-赖氨酸、DL-丙氨酸、DL-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-(+)-谷氨酸，不利用DL-天冬酰氨、D-谷氨酸、L-甘氨酸、D-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、D-苏氨酸、L-精氨酸。

木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60CGMCC No.4647与木兰根瘤菌模式菌株CCBAU71042^T碳氮源利用比较如表1。

表1.木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60 CGMCC No.4647与木兰根瘤菌模式菌株CCBAU70421^T碳氮源利用比较

表1中的“+”表示阳性，“-”表示阴性。

木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60 CGMCC No.4647的脂肪酸结果及其与木兰根瘤菌模式菌株CCBAU71042^T比较如表2。

表2.木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60CGMCC No.4647与木兰根瘤菌模式菌株CCBAU71042^T脂肪酸组成比较

脂肪酸成分	NM60	CCBAU71042^T
			14:0	1.43	-
15:020H	2.21	-
			16:0	3.03	15.58
16:030H	1.66	-
			17:1反异B/反式I	1.65	-
18:0	5.06	16.52
			18:1ω9c	1.16	6.78
18:1w7c 11-甲基	529	-
			19:0环ω8c	3.88	2.73
第二特征类型*	11.03	4.65
			第八特征类型*	61.07	51.69

表2中的“-”表示不含该种成分；第二特征类型包括12:0醛14:0 30H/16:1反I和/或未知10.928；第八特征类型18:1ω7c I和/或18:1ω6c。

16S rRNA基因序列测定及分析

采用引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；1492r(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行16S rRNA基因序列扩增并行序列测定，其16SrRNA基因的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。通过NCBI在线比对服务(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行，与已知模式菌株木兰根瘤菌(Rhizobiumindigoferae)CCBAU71042相似性最高，为100％。通过mega4.0构建系统进化树，NM60与木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)位于同一进化分支。

基于以上生物学特征，将菌株NM60鉴定为木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)。已将该菌株于2011年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4647。

实施例2、木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60CGMCC No.4647与不同苕子品种的共生固氮性能

1、实验方法

菌种的培养

首先活化菌株，将菌种在上述培养基(根瘤菌琼脂(I))斜面进行划线，30℃培养48小时，将活化好的菌种以5％的量接种到装有150ml液体培养基(除不含琼脂外，其余成分均与根瘤菌琼脂(I)相同)的500ml烧瓶中，进行摇床培养，培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，培养48小时，得到菌液。

待测植物毛叶苕子种子为下述品种的种子：土库曼毛苕、苕藤选、79-121苕、78-195。其中，土库曼毛苕和苕藤选来源于中国农业科学院作物所国家种质资源库，库编号分别为I7A00271、I7A00285，国家统一编号分别为00000092、00000110。其他两个品种保藏编号为中苕080和中苕087。

菌剂接种不同品种苕子的小区试验方法

对土库曼毛苕、苕藤选、79-121苕、78-195四个品种进行小区试验，实验区位于内蒙古自治区科左后旗卡镇浩坦塔拉村西4公里处。每个品种的小区试验采用随机区组实验设计，具体方法如下：

1.试验处理

实验设3个处理：空白处理(CK)、NM60处理(NM60)、ACCC16053处理(ACCC16053)空白处理不接种菌剂。

空白对照区：苕子种子不接菌。

接菌区：苕子种子拌根瘤菌：将上述制备的菌液与蛭石混匀，制成粉末型菌剂。通过平板测数法测定菌剂中有效菌的数量、水分及pH至，试验设三次重复，最终菌种数量为2.28×10⁹CFU/g，水分为15％，pH值为6.5。以2％羧甲基纤维素钠为粘着剂，以碳酸钙为分散剂拌种，种子与根瘤菌剂的比例约为10∶1。

为防止交叉，先播种空白对照区，后播种接菌区。每亩播种量为2.5Kg/亩计算。

2.小区设置

小区的大小约为10m²，小区间设40-50cm的隔离带，每个处理设四次重复，即设置4个区组，每个区组内每个处理只设一个小区，每个处理四个重复小区随机排列。

3.调查项目、步骤和方法

第一次调查：

幼苗第一片真叶期进行(苗龄20天左右)。主要调查结瘤率，即结瘤植株与调查植株的百分比数，植株根部只要有一个可见的根瘤就视为结瘤植株，每个小区随机挖取10株苗进行调查。

第二次调查：

初花期(苗龄约60天)时进行。主要调查根瘤数量、根瘤重量、植株高度和植株地上部分生长量(干重)，每个小区随机挖取10株苗进行调查。

第三次调查：

当年植株生长最旺盛期调查。主要调查植株高度、植株分枝数、植株鲜草量和植株干草重量，测产时每一个小区刈割1m²称重。

4.试验数据处理

每次调查试验后，将数据记录，试验结束后将各次各项调查数据整理汇总后填入调查统计表。

5.实验结果

从第一次和第二次调查结瘤率的结果可以看出，接种根瘤菌较未接种对照，结瘤率明显高；第二次调查发现，木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60CGMCC No.4647菌株接种从结瘤数量、根瘤重及植株高度、植株干重等特征，总体上比未接种根瘤菌和接种ACCC16053效果要好；对最后的产量调查结果进行差异显著性分析的方法，数据分析采用SPSS12.0(SPSS Inc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。结果如表3所示，接种木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60 CGMCC No.4647对品种75-121增产幅度最高，达到73％，对苕腾选的增幅为51％，对其他两个苕子品种的干草产量增幅也超过了20％，相比参比菌株ACCC16053效果好，统计结果表明除土库曼接种木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60CGMCC No.4647与对照ACCC16053为差异性显著(P＜0.05)外，其他木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)NM60CGMCCNo.4647与对照ACCC16053及未接种对相比均为差异极显著(P＜0.01)。

表3.苕子小区试验

Claims

1.木兰根瘤菌（Rhizobium indigoferae）NM60，其保藏号为CGMCC No.4647。

2.根瘤菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的木兰根瘤菌（Rhizobium indigoferae）NM60，其保藏号为CGMCC No.4647。

3.根据权利要求2所述的根瘤菌剂，其特征在于：所述菌剂由所述活性成分和载体组成。

4.根据权利要求3所述的根瘤菌剂，其特征在于：所述载体为蛭石。

5.所述权利要求1所述的木兰根瘤菌或权利要求2所述的菌剂在制备绿肥中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述绿肥用权利要求1所述的木兰根瘤菌（Rhizobium indigoferae）NM60或用权利要求2所述的菌剂接种于毛叶苕子制备得到。

7.绿肥，其特征在于：所述绿肥用权利要求1所述的木兰根瘤菌（Rhizobiumindigoferae）NM60或用权利要求2所述的菌剂接种于毛叶苕子制备得到。

8.权利要求7所述绿肥的制备方法，包括用权利要求1所述的木兰根瘤菌（Rhizobium indigoferae）NM60或用权利要求2所述的菌剂接种于毛叶苕子的步骤。