CN102851238A

CN102851238A - 一种鞘氨醇杆菌及利用其制备左乙拉西坦酸的方法

Info

Publication number: CN102851238A
Application number: CN2012102830402A
Authority: CN
Inventors: 徐毅; 陈晨; 陈建波
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2012-08-10
Filing date: 2012-08-10
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2032-08-10
Also published as: CN102851238B

Abstract

本发明公开了一种鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)SIT102，CGMCC NO.6158，以及利用该鞘氨醇杆菌SIT102作为生物催化剂催化外消旋乙拉西坦酸酯进行对映选择性水解产生左乙拉西坦酸的制备方法。所述左乙拉西坦酸的制备方法即将鞘氨醇杆菌SIT102细胞置于缓冲溶液中后向其中加入外消旋乙拉西坦酸酯，经催化进行对映选择性水解反应得到左乙拉西坦酸。本发明的利用该鞘氨醇杆菌SIT102作为生物催化剂制备左乙拉西坦酸的方法，所用的生物催化剂易于制备、反应条件温和，左乙拉西坦酸的产率能够达到48%，对映体过量值达96%，生产成本低，具有相当的工业应用开发前景。

Description

一种鞘氨醇杆菌及利用其制备左乙拉西坦酸的方法

技术领域

本发明涉及一种杆菌及其用途，特别涉及一种鞘氨醇杆菌以及利用该鞘氨醇杆菌作为生物催化剂制备左乙拉西坦酸的方法。

背景技术

已知左乙拉西坦酸是合成左乙拉西坦（（S）-α-乙基-2-氧合-1-乙酰胺吡咯烷，Levetiracetam）的关键手性中间体，其结构式如图1所示。

左乙拉西坦是比利时UCB（优时比）公司开发研制的一种新型抗癫痫药，与2000年4月获FDA批准，在美国和欧盟上市，主要用于治疗局限性及继发性全身性癫痫。目前在全球超过66个国家和地区上市，全球有超过100万人的治疗记录，是目前美国癫痫治疗中应用最多的新型抗癫痫药物。研究结果表明，右旋体对于抑制癫痫发作只有轻微或者不明显的药效作用，而左乙拉西坦则是一种安全、高效的抗癫痫药物。

目前左乙拉西坦的合成大致可以分为化学法和化学-酶法。其中，化学法主要可以分为以下几类方法：第一类是以2-氨基丁酸及类似物为原料，经转化得到左旋的α-氨基丁酰胺衍生物，然后与4-氯丁酰氯或4-氯丁酸酯反应环合再转化为左乙拉西坦的方法。第二类是以2-吡咯烷酮为原料，引进侧链制备消旋酸再拆分得到左乙拉西坦的方法。但该两种方法均需要用到与物料等摩尔剂量的手性酸或碱拆分剂和大量有机溶剂，拆分成本较高，操作步骤较为繁琐费时。

近年来，已有文献报道了利用环境友好、温和高效的酶作为催化剂来合成左乙拉西坦及其中间体。如利用腈水合酶作为催化剂来合成左乙拉西坦及其中间体，其关键步骤是腈水合酶催化动力学拆分消旋的2-吡咯烷酮腈化物直接得到左乙拉西坦。拆分产率达到43％，产物e.e.值为94％。此方法的优点是路线简介，反应条件温和，底物浓度较高。不足之处是在中间体合成中采用了有一定毒性的腈化物。

根据左乙拉西坦的结构特点，发现如果可以筛选到高立体选择性水解乙拉西坦酸酯（α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸酯）的生物催化剂，同样可以合成手性药物中间体左乙拉西坦酸（（S）-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸）。即利用酶催化上述羧酸酯的水解动力学拆分来代替传统的化学拆分法。这种羧酸酯水解酶在手性酸、醇和酯的合成中具有广泛的用途。该技术路线中的生物催化剂无毒、温和、具有高选择性和催化效率，并且避免了腈水合酶路线中有毒的腈化物原料，具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一在于为解决上述现有技术中所存在的用到大量有机溶剂、操作繁琐、原料有毒性等技术问题，而提供一种鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.) SIT102，CGMCC NO.6158。

本发明的目的之二在于提供上述的一种鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.) SIT102的培养方法。

本发明的目的之三在于提供一种将上述的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.) SIT102 作为生物催化剂应用的方法，即作为生物催化剂催化外消旋乙拉西坦酸酯进行对映选择性水解产生左乙拉西坦酸的制备方法。本发明所提供的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.) SIT102作为生物催化剂可以高选择性、高收率、低生产成本的催化合成左乙拉西坦酸。

本发明的技术方案

本发明的一种鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.) SIT102 是一种属于细菌类鞘氨醇杆菌属的菌株，该菌株是通过以下方法得到的，即从中国东南方地区上海富含油脂的土壤中采集土样,以乙拉西坦酸甲酯或其类似物为唯一碳源经过多轮富集培养后筛选得到的。

本发明的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.) SIT102菌种具有如下的微生物学特征：

1、形态特征

本发明所得的鞘氨醇杆菌 (Sphingobacterium sp.) SIT102细胞呈椭圆型，0.4~0.8 μm×0.8~2.5 μm，不具有端生或周生鞭毛，不形成菌丝体。

2、培养学特征

在酵母膏-蛋白胨-葡萄糖琼脂上菌落不透明，圆形并向上突起，边缘光滑，呈淡黄色。

3、生理生化特征

（1）革兰氏阴性杆状菌；好氧菌；

（2）运动性：运动能力较差；

（3）吲哚产生试验：阴性；

（4）硫化氢产生实验：阴性；

（5）淀粉水解试验：阳性；

（6）明胶液化试验：阳性；

（7）甲基红试验：阴性

（8）伏-普二氏试验（VP实验）：阳性

（9）柠檬酸盐利用试验：弱阳性

（10）尿素利用试验：阴性

（11）碳源同化

阳性：麦芽糖、甘露糖、甘露醇、葡萄糖、葡萄糖酸、阿拉伯糖、N-乙酰葡糖胺

阴性：硝酸盐、亚硝酸盐、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶

（12）生长最适宜温度：25～35℃；

根据生理生化试验和《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册》，结合16S rDNA分子生物学鉴定，该细菌属于鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）,但又与现有技术中报道的鞘氨醇杆菌有明显不同,其主要不同之处在于:可以作为生物催化剂，催化外消旋乙拉西坦酸酯对映选择性水解产生左乙拉西坦酸，并具有较高的产率和较好的立体选择性（产物e.e.>96%）。

[0014] 本发明的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102于2012年5月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.6158。

采用上述鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102作为生物催化剂催化外消旋乙拉西坦酸酯进行对映选择性水解产生左乙拉西坦酸的制备方法，其制备过程的反应方程示意图如图3所示，其制备过程包括下列步骤：

（1）、鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102 的培养

取4℃保存的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102斜面菌种，挑取一环接种至装有50ml发酵培养基的250ml摇瓶中，在25～35℃下，160～220rpm振摇培养24~48h，离心收获鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102菌体,然后将所得的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102菌体置于缓冲溶液中；

所述的发酵培养基配方：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，KH₂PO₄ 1g/L, K₂HPO₄ 2g/L， MgSO₄ 0.5g/L, pH7.0；

所述的缓冲溶液为pH值为6.5～7.5的磷酸钾缓冲溶液；

（2）、向步骤（1）中含有鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102的缓冲溶液中加入外消旋乙拉西坦酸酯，加入的外消旋乙拉西坦酸酯经鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102静息细胞催化进行对映选择性水解反应后得反应液；

上述的对映选择性水解反应过程控制温度为20～40℃，时间为3～48h；

上述反应过程中所用的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102细胞量、外消旋乙拉西坦酸酯、缓冲溶液的量按鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102细胞湿重:外消旋乙拉西坦酸酯:缓冲溶液为5～150g：5～100mmol：1L计算;

上述的外消旋乙拉西坦酸酯的结构式如图2所示；

（3）、将步骤（2）所得的反应液进行分离、纯化，最终得到目标产物左乙拉西坦酸。

本发明的有益效果

本发明采用鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102作为生物催化剂对外消旋乙拉西坦酸酯进行对映选择性水解制备左乙拉西坦酸，最终左乙拉西坦酸的产率可达48%以上，光学纯度e.e.达96%。

另外，由于本发明的生物催化剂鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102，其培养方便，原料易得，以鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102作为生物催化剂对外消旋乙拉西坦酸酯进行对映选择性水解制备左乙拉西坦酸反应条件温和，无需大量有机溶剂，从而降低生产成本，有利于进一步的工业化生产。

附图说明

图1、外消旋乙拉西坦酸酯的结构式示意图；

图2、左乙拉西坦酸的结构式示意图；

图3、本发明的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102，作为生物催化剂催化外消旋乙拉西坦酸酯进行对映选择性水解产生左乙拉西坦酸的反应方程示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步详细描述，但并不限制本发明。

本发明所用的试剂皆为分析纯或化学纯规格。

本发明用的外消旋乙拉西坦酸酯是通过外消旋的乙拉西坦酸与无水甲醇或无水乙醇在三甲基氯硅烷催化作用下合成的。

左乙拉西坦酸的检测方法：手性液相色谱（色谱柱为Chiralcel OD-H色谱柱，流动相为正己烷：异丙醇：三氟乙酸=95：5：0.1，紫外检测波长210nm，流速1 ml/min）；

本发明中所指的细胞羧酸酯酶活力单位的定义为：在30℃，pH7.0的条件下，每分钟催化外消旋乙拉西坦酸甲酯水解生成1.0μmol左乙拉西坦酸所需的酶量即为1个活力单位。

实施例1

鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）SIT102的培养

新鲜斜面培养基：葡萄糖10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，MgSO₄ 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L, K₂HPO₄ 2g/L，琼脂15-20 g/L，pH 7.0。

斜面种子的培养

取冰箱4℃保存的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102菌种，取出后接种到上述所述的新鲜斜面培养基上，在30℃下培养48h，得鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102斜面种子，并将其保存在4℃的冰箱中。

发酵培养基：葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，MgSO₄ 0.5 g/L，KH₂PO₄ 1g/L, K₂HPO₄ 2g/L，pH 7.0。

取4℃保存的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102斜面种子，挑取一环接种至装有50ml发酵培养基的250ml摇瓶中，在30℃下，180rpm振摇培养48h，以10000g离心约15min得到鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102静息细胞。

最终所得的发酵液产羧酸酯酶活力约为30～50 U/L，细胞浓度按湿重计算约15～25g/L，单位细胞产羧酸酯酶活力约为2U/g湿细胞。

实施例2

外消旋乙拉西坦酸甲酯的制备

将外消旋的乙拉西坦酸 (8.5g, 0.05mol), 无水甲醇 (40mL, 1mol),三甲基氯硅烷 (9mL, 0.15mol)室温下搅拌反应24 h；

减压除掉溶剂，剩余物加入乙酸乙酯重新溶解，用饱和 Na₂CO₃ 溶液(共3次，每次5ml)和蒸馏水(共4次，每次5ml)洗涤，之后用无水硫酸钠干燥，减压除掉溶剂后得到外消旋乙拉西坦酸甲酯，收率约为75%，纯度为99%。

取湿重1.0 g的实施例1所得的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102 静息细胞，悬浮于10ml磷酸钾盐缓冲溶液中（0.1mol/L, pH 7.0），加入上述所得的外消旋乙拉西坦酸甲酯0.1mmol，反应混合物在30℃、180r/min的恒温摇床上振摇反应，反应24h后加入2mol/L盐酸调水相pH值到2.0，以乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，即得左乙拉西坦酸。

用手性液相色谱分析上述所得的左乙拉西坦酸的对映体过量值和产率，左乙拉西坦酸的产率为43%，对映体过量值(e.e.)为92%。

实施例3

取湿重1.0 g的实施例1所得的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102静息细胞，悬浮于10ml磷酸钾盐缓冲溶液中（0.1 M, pH 7.0），加入实施例2中所得的外消旋乙拉西坦酸甲酯0.1mmol，反应混合物在30℃、180 r/min的恒温摇床上振摇反应，反应36h后加入2mol/L盐酸调水相pH值到2.0，以乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，即得左乙拉西坦酸。用手性液相色谱分析上述所得的左乙拉西坦酸的对映体过量值和产率，左乙拉西坦酸的产率为52%，对映体过量值(e.e.)为90%。

实施例4

取湿重1.0g的实施例1所得的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102静息细胞，悬浮于10ml磷酸钾盐缓冲溶液中（0.1 M, pH 7.0），加入实施例2中所得的外消旋乙拉西坦酸甲酯0.05mmol，反应混合物在30℃、180r/min的恒温摇床上振摇反应，反应24h后加入2mol/L盐酸调水相pH值到2.0，以乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，即得左乙拉西坦酸。用手性液相色谱分析上述所得的左乙拉西坦酸的对映体过量值和产率，左乙拉西坦酸的产率为46%，对映体过量值(e.e.)为94%。

实施例5

取湿重2.0 g的实施例1所得的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102静息细胞，悬浮于10ml磷酸钾盐缓冲溶液中（0.1M, pH7.5），加入实施例2中所得的外消旋乙拉西坦酸甲酯0.1mmol，反应混合物在30℃、180r/min的恒温摇床上振摇反应，反应24h后加入2mol/L盐酸调水相pH值到2.0，以乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，即得左乙拉西坦酸。用手性液相色谱分析上述所得的左乙拉西坦酸的对映体过量值和产率，左乙拉西坦酸的产率为48%，对映体过量值(e.e.)为96%。

实施例6

外消旋乙拉西坦乙酯的制备

将外消旋的乙拉西坦酸 (8.5g，0.05mol), 无水乙醇 (40mL，0.8mol),三甲基氯硅烷 (9mL，0.15mol)室温下搅拌反应24h，减压除掉溶剂，剩余物加入乙酸乙酯重新溶解，用饱和 Na₂CO₃ 溶液(共3次，每次5 ml)和蒸馏水(共4次，每次5ml)洗涤。之后用无水硫酸钠干燥，减压除掉溶剂后得到外消旋乙拉西坦乙酯，收率约为75%，纯度为99%。

取湿重1.0g的实施例1所得的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102 静息细胞，悬浮于10ml磷酸钾盐缓冲溶液中（0.1M, pH7.0），加入上述所得的外消旋乙拉西坦乙酯0.1mmol，反应混合物在30℃、180r/min的恒温摇床上振摇反应，反应24h后加入2mol/L盐酸调水相pH值到2.0，以乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，即得左乙拉西坦酸。用手性液相色谱分析上述所得的左乙拉西坦酸的对映体过量值和产率，左乙拉西坦酸的产率为50%，对映体过量值(e.e.)为80%。

实施例7

取湿重1.0g的实施例1所得的鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.） SIT102静息细胞，悬浮于10ml磷酸钾盐缓冲溶液中（0.1M, pH7.0），加入实施例6所得的外消旋乙拉西坦乙酯0.15mmol，反应混合物在30℃、180r/min的恒温摇床上振摇反应，反应24h后，加入2mol/L盐酸调水相pH值到2.0，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，即得左乙拉西坦酸。用手性液相色谱分析上述所得的左乙拉西坦酸的对映体过量值和产率，左乙拉西坦酸的产率为41%，对映体过量值(e.e.)为88%。

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.) SIT102，CGMCC NO. 6158。

2.如权利要求1所述的鞘氨醇杆菌SIT102的培养方法，其特征在于步骤如下：

以葡萄糖为碳源、以蛋白胨为氮源将鞘氨醇杆菌SIT102进行发酵培养，培养过程中控制pH为7.0、温度为25～35℃，时间为24～48h。

3.利用权利要求1所述的鞘氨醇杆菌SIT102作为生物催化剂催化外消旋乙拉西坦酸酯进行对映选择性水解产生左乙拉西坦酸的方法，其特征在于具体包括下列步骤：

（1）、鞘氨醇杆菌SIT102的培养，即以葡萄糖10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，KH₂PO₄ 1g/L, K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄ 0.5g/L为发酵培养基，将4℃保存的鞘氨醇杆菌SIT102斜面菌种进行发酵培养，培养过程中控制pH为7.0、温度为25～35℃，时间为24～48h后离心收获鞘氨醇杆菌SIT102菌体，然后将所得的鞘氨醇杆菌SIT102菌体置于缓冲溶液中；

（2）、向步骤（1）所得的缓冲溶液中加入外消旋乙拉西坦酸酯，其经鞘氨醇杆菌SIT102菌体催化进行对映选择性水解反应后得反应液；

上述的对映选择性水解反应过程控制反应温度为20～40℃，反应时间为3～48h；

上述的对映选择性水解反应过程中所用的鞘氨醇杆菌SIT102细胞量、外消旋乙拉西坦酸酯的量和缓冲溶液的量按鞘氨醇杆菌SIT102细胞湿重: 外消旋乙拉西坦酸酯：缓冲溶液体积为5～150g：5～100mmol：1L计算；

上述的外消旋乙拉西坦酸酯的结构式如下：

其中的R为C₁～C₃烷基；

（3）、将步骤（2）所得的反应液进行分离、纯化，最终得到目标产物左乙拉西坦酸；

所述的左乙拉西坦酸的结构式如下：

。

4.如权利要求3所述的利用鞘氨醇杆菌SIT102作为生物催化剂催化外消旋乙拉西坦酸酯进行对映选择性水解产生左乙拉西坦酸的方法，其特征在于步骤（1）中所述的缓冲溶液为磷酸钾缓冲溶液，其pH值为6.5～7.5。

5.如权利要求3或4所述的利用鞘氨醇杆菌SIT102作为生物催化剂催化外消旋乙拉西坦酸酯进行对映选择性水解产生左乙拉西坦酸的方法，其特征在于步骤（2）中所述的外消旋乙拉西坦酸酯是通过外消旋的乙拉西坦酸与无水甲醇或无水乙醇在三甲基氯硅烷催化作用下合成的。