CN102102087B - 雷弗松氏菌及在制备(r)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株可用于微生物催化不对称还原[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮制备高光学纯度的(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的新菌种——雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904及其应用。所述雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；保藏编号：CCTCC NO：M2010241，保藏日期：2010年9月21日。采用该新菌种催化制备光学纯(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇具有底物浓度高，立体选择性好，产物光学纯度高等优点。本发明菌株与以往同类研究报道的微生物不同，并且催化转化的底物浓度和产率均高于文献报道，从而在研究微生物催化法制备阿瑞吡坦药物关键手性中间体(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇方面提供了有益的参考。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株可用于微生物催化不对称还原[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮制备高光学纯度(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的新菌种——雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904及其应用。
(二)背景技术
(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的化学结构式为：
(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇是合成药物阿瑞吡坦(Aprepitant，商品名： 
)的重要手性中间体。阿瑞吡坦化学名为：5-[[(2R，3S)-2-[(1R)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基-]甲基]-1，2-二氢-3H-1，2，4-三氮唑-3-酮基。2003年美国食品和药物管理局(FDA)批准阿瑞吡坦用于高度致吐化疗方案所致恶心、呕吐的药物，它是一个全新机制的镇吐药物-NK-1受体拮抗剂。NK-1受体拮抗剂对各种致吐刺激具有广泛的镇吐作用，且在迟发性呕吐中作用突出。阿瑞吡坦是目前唯一应用于临床的NK-1受体拮抗剂。此外，阿瑞吡坦还具有治疗抑郁及其他精神疾病的作用。阿瑞吡坦与5-HT3受体拮抗剂、地塞米松合用被列为高致吐化疗和延迟性呕吐的标准药物治疗方案。2006年1月11日，默克公司宣布，美国FDA批准预防化疗相关的恶心和呕吐药阿瑞 吡坦的扩展用途。该药曾获准与其他抗恶心药联合用于接受高度可能引起这种不良反应的化疗患者。新的批准是该药与其他抗恶心药联合，用于接受中度可能引起这类不良反应的化疗患者。目前，阿瑞吡坦被认为是效果最好的化疗后止吐药之一。
采用化学法制备(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，需要使用价格昂贵的如铑、钌等金属催化剂，并且会对环境造成污染。采用微生物全细胞催化的生物不对称还原方法制备(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点。
目前，文献已报道的生物催化合成(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇主要涉及以下几种微生物类型：
法国罗地亚有限公司的Gelo-Puji等(Microbial and homogenous asymmetric catalysis in the reduction of 1-[3，5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanone[J].Tetrahedron：Asymmetry，2006，17：2000-2005)采用开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)和黑曲霉(Aspergillus niger)还原[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮得到(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。采用开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)转化[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮时，底物初始浓度为5mmol/L，反应16小时的产率为100％，ee值大于99％；当底物浓度提高到50mmol/L，反应16小时后产率仅为13％；当底物浓度增至200mmol/L时，反应96小时的产率为31％。因该菌种催化反应的底物浓度偏低，不适合工业化应用。
印度的Vankawala等(Efficient Synthesis of(1R)-[3，5-Bis(trifluoromethyl)phenyl]Ethanol，a Key Intermediate for Aprepitant，an NK-1Receptor Antagonist[J].Synthetic Communications，2007，37：3439-3446)采用外消旋的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇为底物， 以乙烯醋酸酯作为酰基受体，通过南极假丝酵母脂肪酶(Candida antarctica lipase-B，CAL-B)催化(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇生成(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酸乙酯。外消旋体中的S-型醇不发生反应，继而通过盐酸水解(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酸乙酯可得到(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，产率为84％，ee值大于99％，反应式如下：
土耳其Esabi B.Kurbanoglu等(Total production of(R)-3，5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric reduction of3，5-bis(trifluoromethyl)-acetophenone in the submerged culture of Penicillium expansum isolate[J].Tetrahedron：Asymmetry 2009，20：2759-2763)报道了采用青霉菌(Penicillium expansum)还原[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮合成(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，反应在2L的发酵罐中进行，当底物浓度为17mmol/L时，反应56h后，转化率达到100％，产率为76％，ee值大于99％。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株可用于生物催化不对称还原[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮制备高光学纯度(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的微生物新菌种——雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904，以及该菌种在催化不对称合成制备(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。
本发明采用的技术方案是：
雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；保藏编号：CCTCC NO： M 2010241，保藏日期：2010年9月21日。
菌种来源：雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904菌株系从采自安徽省黄山附近的土样中分离筛选获得。
具体筛选方法如下：
将采集土样加入到装有50mL富集培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm，培养4～5d，待培养液变混浊后，取1mL培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续培养4～5d，如此重复富集培养3～4次。富集培养基中以[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮为唯一碳源。
随后富集培养液经梯度稀释，涂布到分离平板上，经多次分离培养后获得单菌落菌株。挑取单菌落菌株接种到种子培养基，培养24小时，再转接至产酶培养基中培养48小时。以[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮为底物，筛选得到的微生物细胞为催化剂，在磷酸缓冲液中生物转化24h后，采用手性气相色谱法检测转化液中目的产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的对映体过量值(e.e值)，从中筛选得到所述的微生物新菌株——雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904。
该新菌种的特征如下：
菌落形态：30℃培养48h，菌落呈不规则状，表面湿润，光滑，略微隆起。菌落呈乳白色，略发黄，半透明，有光泽。
细胞形态：细胞为棒杆状，有些呈现一头大一头小的棒状[(0.5～0.8)μm×(1.0～5.0)μm]，可单个、成对排列或聚集成丛。
生理生化特征：革兰氏染色阳性，不生芽孢，不运动，无荚膜，碳水化合物发酵产酸，不产气，氧化酶阳性，接触酶阳性，专性需氧。可以利用的碳源有：α-环糊精、β-环糊精、菊粉、甘露聚糖、吐温40、吐温80、N-乙酰-D-葡糖胺、杏苷、L-阿拉伯糖、熊果苷、D-果糖、L-岩藻糖、D- 半乳糖酸、m-纤维醇、乳果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、α-甲基-D-半乳糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、D-阿洛酮糖、D-核糖、景天庚醛聚糖、水苏糖、D-海藻糖、木糖醇、α-羟基丁酸、P-羟基苯乙酸、α-酮古洛糖酸、L-乳酸、丙酮酸甲酯、丙酮酸、琥珀酰胺酸、N-乙酰-L-乳酸胺谷氨酸、D-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、腐胺、甘油、2’-脱氧腺苷、胸苷、胸苷-5’-磷酸、D-果糖-6-磷酸盐、D-L-α-甘油磷酸盐。不能利用的碳源有：糊精、肝糖、D-阿糖醇、D-纤维二糖、龙胆二糖、D-葡萄糖酸、α-D-葡萄糖、α-D-乳糖、麦芽三糖、D-甘露糖醇、β-甲基-D-半乳糖苷、3-甲基-D-葡萄糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、α-甲基-D-甘露糖苷、帕拉金糖、D-蜜三糖、L-鼠李糖、水杨苷、D-山梨醇、蔗糖、D-塔格糖、松二糖、D-木糖、醋酸、β-羟基丁酸、γ-羟基丁酸、α-酮戊二酸、乳酸胺、D-乳酸甲酯、D-苹果酸、L-苹果酸、琥珀酸甲基酯、琥珀酸、L-丙胺酰胺、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、甘氨酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸、肌苷、尿苷、尿苷-5’-磷酸盐、α-D-葡萄糖-1-磷酸盐、D-葡萄糖-6-磷酸盐。
菌种的16S rDNA序列特性：以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物P1和P2扩增菌株的16S rDNA基因，再将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述雷弗松氏菌HS0904的16S rDNA基因序列如下：GCAGTCGAACGATGAACCCGGAGCTTGCTCCGGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAACCTCCGGAAACGGAAGCTAATACCGGATATGACGCACGGAGGCATCTCCTGTGCGTGGAAAGAATTTCGGTCAAGGATGGACTCGCGGCCTATCAGGTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGCCTACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAA CCTCTTTTAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTCTGTCGCGTCTGCTGTGAAAACCCGAGGCTCAACCTCGGGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGAATGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGTTCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGATGTGGGGACCATTCCACGGTTTCCGTGTCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACGAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGGACACTCGTGAACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCAATACCGTAAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAGCCG。
该序列已提交GenBank(GenBank登录号为No.HQ287806)，将HS0904菌株的16S rRNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对(BLAST)，结果表明：HS0904菌株与雷弗松氏菌属(Leifsonia sp.)的部分菌株序列同源性较高。HS0904菌株与Leifsonia xyli菌株(GenBank登录号为No.AJ717351)的序列同源性达到99％。
根据生理生化特性并结合分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)。
采用Box-Behnken旋转中心组合实验设计法对葡萄糖浓度、酵母膏浓度和KH2PO4浓度三个对产酶影响显著的因素进行优化，得到雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904菌株的优化培养基组成为：葡萄糖20～30g/L，酵母膏10～20g/L，KH2PO42.0～4.5g/L，MgSO4·7H2O 0.3～0.6g/L，NaCl0.2～0.5g/L，Li2SO40.1～0.2g/L，pH 6.0～7.5。
雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904的培养条件为：初始pH 6.0～7.5，摇瓶装液量80～120mL/250mL锥形瓶，培养温度30℃、摇床转速180～220rpm，接种量4～10％，培养时间36～48h。
本发明所涉及的微生物菌种是通过以下方法筛选得到：
1)富集培养：将从全国各地采集的土样接种到富集培养基中，置30℃，200rpm的摇床培养5天，待培养液变混浊后，取1mL培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续培养5天，如此重复3个循环。富集培养基配方如下：[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮50mmol/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO41g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 6.5。
2)平板培养：将最后一次富集培养液稀释后涂布平板培养基，平板培养基组成为富集培养基中加入15-20g/L的琼脂。
3)斜面培养：挑取平板培养基中的单菌落至斜面保藏。斜面培养基配方如下：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏4g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO41g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂20g/L，pH 6.5。30℃培养2～3d，4℃冰箱保存。
4)种子培养：从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有200mL种子培养基的500mL摇瓶中，30℃，200r/min培养24小时。种子培养基配方如下：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏4g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO4 1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 6.5。
5)发酵培养：以8％的接种量将种子液转接到装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200r/min培养48小时。发酵培养基配方同种子培养基。
6)生物转化反应：将离心得到的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液中，加入一定量的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮底物和葡萄糖，置30℃摇床中转化一定时间。转化结束后，转化液用等体积乙酸乙酯萃取，经离心后得到上清液，采用手性气相色谱法分析目的产物和残留底物的含量，以及产物的光学纯度。
7)分析检测：
反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物为十二烷。取1mL萃取液加入2μL十二烷进行分析。气相色谱条件：日本岛津GC-2014气相色谱仪，浙大N2000色谱工作站；美国瓦里安CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min；进样量1μL，分流比为15∶1；检测器和进样口温度均为250℃；色谱柱温度80～180℃；升温速度：4℃/min；检测器为FID。气相色谱图见图1～3。
本发明还涉及所述的雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904在微生物催化不对称还原制备(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。
具体的，所述应用为：以[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮为底物，以雷弗松氏菌HS0904经发酵获得的湿菌体细胞为酶源，在25℃～35℃下，于pH为6.0～8.5的缓冲液中进行转化反应12～60小时，反应结束后反应液经分离纯化得到(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。所述发酵可在常规适用于雷弗松氏菌的液体培养基中进行。
优选的，所述缓冲液转化体系中，底物[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮的初始浓度为20～200mmol/L缓冲液，雷弗松氏菌HS0904湿菌体细胞的添加量以湿重计为50～300g/L缓冲液。
所述湿菌体细胞可按照常规方法由菌株发酵后分离获得，优选的，所述湿菌体细胞由如下方法获得：将雷弗松氏菌HS0904接种至发酵培养基，30℃、200rpm摇床培养48小时，发酵液经离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖20～30g/L，酵母膏10～20g/L，KH2PO42.0～4.5g/L，MgSO4·7H2O 0.3～0.6g/L，NaCl0.2～0.5g/L，Li2SO40.1～0.2g/L，pH 6.0～7.5。
为促进辅酶再生，提高反应效率，所述转化体系中还可添加辅助底物，所述辅助底物为下列之一：①葡萄糖、②蔗糖、③麦芽糖、④异丙醇、⑤甲醇、⑥乙醇；辅助底物为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖时，加入量为20～200g/L缓冲液，辅助底物为甲醇、乙醇或异丙醇时，加入体积为缓冲液体积的10～30％。优选的，所述辅助底物为异丙醇，此时所得产物的光学纯度和产率最高。
所述缓冲液为常规缓冲液，优选的，所述反应在pH8.0的磷酸缓冲液中进行。
具体的，所述应用方法如下：
(1)将雷弗松氏菌HS0904接种至发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48小时，发酵液经离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖25g/L，酵母膏20g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，NaCl 0.4g/L，Li2SO40.2g/L，pH 6.5。
(2)取0.2M pH为8.0的磷酸缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌体细胞，所述湿菌体细胞浓度以湿重计为150g/L缓冲液，加入底物[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮至底物浓度为50mmol/L，并加入体积为缓冲液体积10％的异丙醇作为辅助底物，30℃摇床振荡反应24小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，得到(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。
本发明从土样中筛选获得了与以往同类研究报道不同的微生物新菌种，并且催化转化的底物浓度和产率均高于文献报道，从而在研究微生物催化法制备阿瑞吡坦药物关键手性中间体(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇方面提供了有益的参考。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一株可用于微生物催化不对称还原[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮制备(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的微生物新菌种，采用该新菌种催化制备光学纯(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇具有底物浓度高，立体选择性好，产物光学纯度高等优点。本发明通过采用雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904细胞为催化剂的手性生物催化，当底物浓度为200mmol/L时，目的产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的e.e达到99.9％，产率达到82.9％。
(四)附图说明
图1为底物标准品气相色谱图；
图2为产物标准品气相色谱图；
图3为雷弗松氏菌HS0904菌株生物还原反应萃取液气相色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：产物的检测方法
GC法测定目标产物的光学纯度和产率：反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物是十二烷。取1mL萃取液加入2μL十二烷进行分析。气相色谱条件：日本岛津GC-2014气相色谱仪，浙大N2000色谱工作站；美国瓦里安CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min；进样量1μL，分流比为15∶1；检测器和进样口温度均为250℃；色谱柱温度80～180℃；升温速度：4℃/min；检测器为FID。
用相对校正因子分别计算出反应液中的底物和产物的浓度。进而求出反应的产率(Yield)。计算式为：
产率＝Ci/C0×100％
式中C0、Ci分别为反应起始底物的摩尔浓度和反应结束时产物的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess，e.e.)来表示。
e.e＝(CR-CS)/(CR+CS)×100％
式中CR和CS分别为R型和S型3，5-二(三氟甲基)苯乙醇的摩尔浓度。
实施例2：湿菌体细胞的获得
种子培养基配方：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏4g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO41g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5。
发酵培养基配方：葡萄糖25g/L，酵母膏20g/L，KH2PO44g/L，NaCl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，Li2SO40.2g/L，溶剂为水，pH 6.5。
从培养成熟的斜面挑一环菌体(CCTCC NO：M 2010241)接入装有 200mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养24小时得种子液，再以体积比8％的接种量将种子液转接到装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm培养48小时。培养结束后发酵液离心，并用磷酸缓冲液洗涤一次，收集湿菌体细胞，备用。
实施例3：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，湿菌体以湿重计浓度为50g/L；加入20mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入50g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应12h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为6.2mmol/L，光学纯度ee值99.4％，产率31.1％。
实施例4：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，湿菌体以湿重计浓度为50g/L；加入20mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入50g/L的蔗糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为5.8mmol/L，光学纯度ee值97.6％，产率29.3％。
实施例5：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中，湿菌体以湿重计浓度为100g/L；加入50mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三 氟甲基)苯基]乙醇的浓度为18.7mmol/L，光学纯度ee值99.2％，产率37.4％。
实施例6：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体以湿重计浓度为150g/L；加入50mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应36h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为20.4mmol/L，光学纯度ee值99.4％，产率40.8％。
实施例7：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，湿菌体以湿重计浓度为200g/L；加入50mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入150g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应48h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为23.5mmol/L，光学纯度ee值99.4％，产率47.2％。
实施例8：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中，湿菌体以湿重计浓度为100g/L；加入50mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入1mL(10％，v/v)的异丙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为30.6mmol/L，光学纯度ee值 99.9％，产率61.2％。
实施例9：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，湿菌体以湿重计浓度为150g/L；加入80mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入1.5mL(15％，v/v)的异丙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为52.6mmol/L，光学纯度ee值99.9％，产率65.8％。
实施例10：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，湿菌体以湿重计浓度为150g/L；加入100mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入1.5mL(15％，v/v)的异丙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应48h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为76.4mmol/L，光学纯度ee值99.9％，产率76.4％。
实施例11：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，湿菌体以湿重计浓度为200g/L；加入100mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入2mL(20％，v/v)的异丙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为79.7mmol/L，光学纯度ee值99.9％，产率79.7％。
实施例12：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，湿菌体以湿重计浓度为200g/L；加入150mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入2mL(20％，v/v)的异丙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为113.7mmol/L，光学纯度ee值99.9％，产率75.8％。
实施例13：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，湿菌体以湿重计浓度为250g/L；加入150mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入2mL(20％，v/v)的异丙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应36h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为121.8mmol/L，光学纯度ee值99.9％，产率81.2％。
实施例14：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，湿菌体以湿重计浓度为300g/L；加入180mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入2mL(20％，v/v)的异丙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应36h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为155.5mmol/L，光学纯度ee值99.9％，产率86.4％。
实施例15：
将实施例2所得的湿菌体悬浮于10mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，湿菌体以湿重计浓度为300g/L；加入200mmol/L的[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮作为底物，再加入2mL(20％，v/v)的异丙醇作为辅助底物，置于30℃，200r/min的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法，产物(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度为165.8mmol/L，光学纯度ee值99.9％，产率82.9％。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 雷弗松氏菌及在制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 1389
<212> DNA
<213> Leifsonia xyli
<400> 1
gcagtcgaac gatgaacccg gagcttgctc cgggggatta gtggcgaacg ggtgagtaac 60
acgtgagtaa cctgcccttg actctgggat aacctccgga aacggaagct aataccggat 120
atgacgcacg gaggcatctc ctgtgcgtgg aaagaatttc ggtcaaggat ggactcgcgg 180
cctatcaggt agttggtgag gtaacggccc accaagccta cgacgggtag ccggcctgag 240
agggtgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg 300
gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcaacg ccgcgtgagg gatgacggcc 360
ttcgggttgt aaacctcttt tagtagggaa gaagcgaaag tgacggtacc tgcagaaaaa 420
gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggtgcgagc gttgtccgga 480
attattgggc gtaaagagct cgtaggcggt ctgtcgcgtc tgctgtgaaa acccgaggct 540
caacctcggg cctgcagtgg gtacgggcag actagagtgc ggtaggggag aatggaattc 600
ctggtgtagc ggtggaatgc gcagatatca ggaggaacac cgatggcgaa ggcagttctc 660
tgggccgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg 720
gtagtccacg ccgtaaacgt tgggcgctag atgtggggac cattccacgg tttccgtgtc 780
gcagctaacg cattaagcgc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg 840
aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgcggatt aattcgatgc aacgcgaaga 900
accttaccaa ggcttgacat acacgagaac gggccagaaa tggtcaactc tttggacact 960
cgtgaacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020
gcaacgagcg caaccctcgt tctatgttgc cagcgcgtaa tggcgggaac tcataggaga 1080
ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgtc 1140
ttgggcttca cgcatgctac aatggccggt acaaagggct gcaataccgt aaggtggagc 1200
gaatcccaaa aagccggtct cagttcggat tgaggtctgc aactcgacct catgaagtcg 1260
gagtcgctag taatcgcaga tcagcaacgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1320
caccgcccgt caagtcatga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca acccttgtgg 1380
agggagccg 1389
Claims (9)
1.雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；保藏编号：CCTCC NO：M 2010241，保藏日期：2010年9月21日。
2.权利要求1所述的雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904在微生物催化不对称还原制备(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮为底物，以雷弗松氏菌HS0904经发酵获得的湿菌体细胞为酶源，在25℃～35℃下，于pH为6.0～8.5的缓冲液中进行转化反应12～60小时，反应结束后反应液经分离纯化得到(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述转化反应的体系中，底物[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮的初始浓度为20～200mmol/L，雷弗松氏菌HS0904湿菌体细胞的初始浓度以湿重计为50～300g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体细胞由如下方法获得：将雷弗松氏菌HS0904接种至发酵培养基，30℃、200rpm摇床培养48小时，发酵液经离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖20～30g/L，酵母膏10～20g/L，KH2PO4 2.0～4.5g/L，MgSO4·7H2O 0.3～0.6g/L，NaCl 0.2～0.5g/L，Li2SO4 0.1～0.2g/L，溶剂为水，pH 6.0～7.5。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述转化反应的体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物为下列之一：①葡萄糖、②蔗糖、③麦芽糖、④异丙醇、⑤甲醇、⑥乙醇；辅助底物为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖时，初始浓度为20～200g/L，辅助底物为甲醇、乙醇或异丙醇时，加入体积为缓冲液体积的10～30％。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述辅助底物为异丙醇。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应在pH8.0的磷酸缓冲液中进行。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用方法如下：
(1)将雷弗松氏菌HS0904接种至发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48小时，发酵液经离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖25g/L，酵母膏20g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，NaCl 0.4g/L，Li2SO4 0.2g/L，溶剂为水，pH 6.5；
(2)取0.2M pH为8.0的磷酸缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌体细胞，所述湿菌体细胞初始浓度以湿重计为150g/L，加入底物[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙酮至底物浓度为50mmol/L，并加入体积为缓冲液体积10％的异丙醇作为辅助底物，30℃摇床振荡反应24小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，得到(R)-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。
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