CN110066784A - 一种香桧烯合酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

一种香桧烯合酶及其编码基因和应用。本发明涉及一种香桧烯合酶，该蛋白质具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或该蛋白质具有在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列基础上缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的衍生序列且该蛋白质具有香桧烯合酶活性。该香桧烯合酶能够催化香桧烯的合成，且催化效率高。

Description

一种香桧烯合酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种香桧烯合酶及其编码基因和应用。

背景技术

柑橘中富含挥发性物质，大多数种质中挥发性萜烯类物质占总挥发性物质的90％以上。挥发性萜烯类物质主要存储在柑橘油胞中，以柑橘果皮、叶片和花中为主。几乎所有柑橘果皮中主要积累d-柠檬烯，不同柑橘品种花中最主要的挥发性物质差异较大，如橘花中主要积累γ-萜品烯，甜橙花中主要积累香桧烯。香桧烯主要作为香精油应用于各种香料添加剂中，同时香桧烯具有强烈的消除自由基的功能，使得含有香桧烯的精油具有抗氧化功能，此外香桧烯还具有抗炎、抗微生物和抗真菌的生理活性。

目前香桧烯都是自植物中提取，没有关于其人工合成的报道。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题提供了一种新的香桧烯合酶及其编码基因和应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种香桧烯合酶，该蛋白质具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列；或该蛋白质具有在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列基础上缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的衍生序列且该蛋白质具有香桧烯合酶活性。

本发明还提供了一种香桧烯合酶的编码基因，该编码基因编码：

(a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)具有衍生自缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列并且具有香桧烯合酶活性的蛋白质。

进一步，所述基因为(ⅰ)或(ⅱ)的DNA分子：

(ⅰ)具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的DNA分子；

(ⅱ)与(ⅰ)所述的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码具有香桧烯合酶活性的蛋白质的DNA分子。

本发明还提供了一种重组载体，包括上述香桧烯合酶的编码基因。

所述重组载体为将上述任一所述编码基因插入出发载体(如PET-28a(+))的多克隆位点得到的重组表达载体。

本发明还提供了一种转化体，包括上述重组载体。

转化体可以为重组菌，例如，将上述任一所述编码基因插入出发载体(如PET-28a(+)载体)的多克隆位点得到的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

本发明还提供了一种引物对，用于扩增上述香桧烯合酶的编码基因全长及其任意片段。

例如，引物对的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。

本发明还提供了上述香桧烯合酶在香桧烯合成中的应用。

本发明还提供了利用上述香桧烯合酶合成香桧烯的方法，包括以下步骤：以牻牛儿基焦磷酸作为底物，在中性条件下，利用所述香桧烯合酶催化香桧烯合成。

本发明还提供了一种生产香桧烯合酶的方法，该方法为培养上述转化体并由培养物中收集香桧烯合酶。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的香桧烯合酶及其编码基因，该香桧烯合酶能够催化香桧烯的合成，且催化效率高。

附图说明

图1为本发明纯化的香桧烯合酶的检测结果，图1A为纯化的香桧烯合酶的SDS-PAGE凝胶电泳图，其中泳道M为Marker，泳道1和4为未纯化的蛋白，泳道2、3、5和6为纯化的蛋白；图1B为纯化的蛋白印记杂交，其中STPS-fl为未切除转运肽的STPS基因编码的蛋白，STPS-tr1和STPS-tr2为纯化的香桧烯合酶；

图2为本发明香桧烯催化牻牛儿基焦磷酸(GPP)合成产物的GC-MS结果图。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

发明人通过红肉脐橙不同发育时期花转录组和代谢组分析发现香桧烯在完全开放花中含量比气球期花中显著降低，通过克隆候选基因，并在大肠杆菌中异源表达，发现一种新的能催化香桧烯合成的香桧烯合酶。

实施例1香桧烯合酶编码基因及香桧烯合酶的合成

1、香桧烯合酶编码基因合成

提取红肉脐橙花的mRNA，以mRNA为模板进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，利用引物对Fw-1和Rv-1进行PCR，克隆出STPS基因的编码区序列，其中Fw、Rv和STPS基因的编码区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

SEQ ID NO:3的序列为：

atgtcttcttgcattaatccctca

SEQ ID NO:4的序列为：

tcagcctttggtgccaggaga

SEQ ID NO:5的序列为：

atgtcttcttgcattaatccctcaaccttggttacctctgtaaatggtttcaaatgtcttcctcttgcaacaaatggagcagccatcagaatcatggccaaaaataagccagtccaaagccttgtcagcgccaaatatgataatttgacagttgataggagatcagcaaactaccaaccttcaatttgggaccatgattttttgcagtcactgaatagcaactatacggatgaaacatacaaaagacgagcagaagagctgaagggaaaagtgaagacagcgattaaggatgtaaccgagcctctggatcagttggagctgatagataatttgcaaagacttggattggcttatcattttgagcctgagattcggaacatattgcgtaatatccacaaccataataaagattataattggagaaaagaaaatctgtatgcaacctcccttgaattcagactacttagacaacatggctatcctgtttctcaagaggttttcagtggttttaaagacgacaagggaggcttcatttgtgatgatttcaagggaatactgagcttgcatgaagcctcgtattacagcttagaaggagaaagcatcatggaggaggcctggcaattcaccagtaagcatcttaaagaaatgatgatcatcagcaacagcaaggaagaggatgtatttgtagcagaacaagcgaagcgtgcgctggagctccctctgcattggaaagtgcctatgttagaggcaaggtggttcatacacgtttatgagaaaagagaggacaagaaccaccttttacttgagctcgctaagttggagtttaacactttgcaggcaatttaccaggaagaacttaaagacatttcagggtggtggaaggatacaggtcttggagagaaattgagctttgcgaggaacaggttggtagcgtccttcttatggagcatggggatcgcgtttgagcctcaattcgcctactgcaggagagtgctcacaatctcgatagccctaattacagtgattgatgacatttatgatgtctatggaacattggatgaacttgagctattcactgatgctgttgagaggtgggacatcaattatgctttgaagcaccttccgggctatatgaaaatgtgttttcttgcgctttacaactttgttaatgaatttgcttattacgttctcaaacaacaggattttgatatgcttctgagcattaaaaatgcatggcttggcttaatacaagcctacttggtggaggcgaaatggtaccatagcaagtacacaccgaaactggaagaatacttggaaaatggattggtatcaataacgggccctttaattataacgatttcatatctttctggtacaaatccaatcattaagaaggaactggaatttctagaaagtaatccaggtatagttcactggtcatccaagattttccgtctgcaagatgatttgggaacttcatcggacgagatacagagaggggatgttccaaaatcaatccagtgttacatgcatgaaactggtgcctcggaggaagttgctcgtgaacacatcaaggatatgatgagacagatgtggaagaaggtgaatgcatacacagccgataaagactctcccttgactcgaacaactactgagttcctcttgaatcttgtgagaatgtcccattttatgtatctacatggagatgggcatggtgttcaaaaccaagagactatcgatgtcggttttacattgctttttcagcccattcccttggaggacaaagacatggctttcacagcatctcctggcaccaaaggctga

STPS基因的编码区序列全长1824bp，编码607个氨基酸序列的蛋白。将克隆得到的STPS基因的编码区序列片段回收，连接到克隆载体pTOPO-Blunt Simple载体(货号：292349AX)上，转化到大肠杆菌DH5α中，选择测序正确的菌液提取质粒、得到STPS基因的全长编码区序列。

以SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测STPS全长基因转运肽，并以切除转运肽引物Fw-2和Rv-2克隆出切除转运肽的序列，即香桧烯合酶的编码基因，该引物对同时会在香桧烯合酶的编码基因序列两端添加双酶切位点，其中Fw-2、Rv-2和香桧烯合酶的编码基因的序列分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:2，将克隆得到的序列再次连接到pTOPO-Blunt Simple载体上进行转化DH 5α感受态细胞，并提取测序正确的质粒。将含切除转运肽的STPS基因序列的质粒用内切酶BamHI和xholI进行双酶切并琼脂糖电泳回收酶切产物，与相同内切酶双酶切的PET-28a(+)并琼脂糖电泳回收酶切产物混合，T4连接酶4℃连接过夜，并转化大肠杆菌BL21感受态细胞。

SEQ ID NO:6的序列为：

cgggatccaggagatcagcaaactaccaacct

SEQ ID NO:7的序列为：

ccgctcgagtcagcctttggtgccaggagat

SEQ ID NO:2的序列为：

aggagatcagcaaactaccaaccttcaatttgggaccatgattttttgcagtcactgaatagcaactatacggatgaaacatacaaaagacgagcagaagagctgaagggaaaagtgaagacagcgattaaggatgtaaccgagcctctggatcagttggagctgatagataatttgcaaagacttggattggcttatcattttgagcctgagattcggaacatattgcgtaatatccacaaccataataaagattataattggagaaaagaaaatctgtatgcaacctcccttgaattcagactacttagacaacatggctatcctgtttctcaagaggttttcagtggttttaaagacgacaagggaggcttcatttgtgatgatttcaagggaatactgagcttgcatgaagcctcgtattacagcttagaaggagaaagcatcatggaggaggcctggcaattcaccagtaagcatcttaaagaaatgatgatcatcagcaacagcaaggaagaggatgtatttgtagcagaacaagcgaagcgtgcgctggagctccctctgcattggaaagtgcctatgttagaggcaaggtggttcatacacgtttatgagaaaagagaggacaagaaccaccttttacttgagctcgctaagttggagtttaacactttgcaggcaatttaccaggaagaacttaaagacatttcagggtggtggaaggatacaggtcttggagagaaattgagctttgcgaggaacaggttggtagcgtccttcttatggagcatggggatcgcgtttgagcctcaattcgcctactgcaggagagtgctcacaatctcgatagccctaattacagtgattgatgacatttatgatgtctatggaacattggatgaacttgagctattcactgatgctgttgagaggtgggacatcaattatgctttgaagcaccttccgggctatatgaaaatgtgttttcttgcgctttacaactttgttaatgaatttgcttattacgttctcaaacaacaggattttgatatgcttctgagcattaaaaatgcatggcttggcttaatacaagcctacttggtggaggcgaaatggtaccatagcaagtacacaccgaaactggaagaatacttggaaaatggattggtatcaataacgggccctttaattataacgatttcatatctttctggtacaaatccaatcattaagaaggaactggaatttctagaaagtaatccaggtatagttcactggtcatccaagattttccgtctgcaagatgatttgggaacttcatcggacgagatacagagaggggatgttccaaaatcaatccagtgttacatgcatgaaactggtgcctcggaggaagttgctcgtgaacacatcaaggatatgatgagacagatgtggaagaaggtgaatgcatacacagccgataaagactctcccttgactcgaacaactactgagttcctcttgaatcttgtgagaatgtcccattttatgtatctacatggagatgggcatggtgttcaaaaccaagagactatcgatgtcggttttacattgctttttcagcccattcccttggaggacaaagacatggctttcacagcatctcctggcaccaaaggctga

挑选取阳性大肠杆菌菌液添加到100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB中在37℃，180rpm生长至A₆₀₀＝0.6，加入1mMIPTG后转移至16℃，以180rpm培养16h，诱导结束后4℃4000rpm离心5min收集菌体。菌体用4ml 1×Ni-NTA BindingBuffer(50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；10mM咪唑)重悬，菌液用细胞破碎仪破碎，将上清液加入镍柱进行蛋白纯化，得到香桧烯合酶，其为555个氨基酸，香桧烯合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1的序列为：

Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Gln Pro Ser Ile Trp Asp His Asp Phe Leu GlnSer Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Asp Glu Thr Tyr Lys Arg Arg Ala Glu Glu Leu LysGly Lys Val Lys Thr Ala Ile Lys Asp Val Thr Glu Pro Leu Asp Gln Leu Glu LeuIle Asp Asn Leu Gln Arg Leu Gly Leu Ala Tyr His Phe Glu Pro Glu Ile Arg AsnIle Leu Arg Asn Ile His Asn His Asn Lys Asp Tyr Asn Trp Arg Lys Glu Asn LeuTyr Ala Thr Ser Leu Glu Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Tyr Pro Val Ser GlnGlu Val Phe Ser Gly Phe Lys Asp Asp Lys Gly Gly Phe Ile Cys Asp Asp Phe LysGly Ile Leu Ser Leu His Glu Ala Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Gly Glu Ser Ile MetGlu Glu Ala Trp Gln Phe Thr Ser Lys His Leu Lys Glu Met Met Ile Ile Ser AsnSer Lys Glu Glu Asp Val Phe Val Ala Glu Gln Ala Lys Arg Ala Leu Glu Leu ProLeu His Trp Lys Val Pro Met Leu Glu Ala Arg Trp Phe Ile His Val Tyr Glu LysArg Glu Asp Lys Asn His Leu Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn Thr LeuGln Ala Ile Tyr Gln Glu Glu Leu Lys Asp Ile Ser Gly Trp Trp Lys Asp Thr GlyLeu Gly Glu Lys Leu Ser Phe Ala Arg Asn Arg Leu Val Ala Ser Phe Leu Trp SerMet Gly Ile Ala Phe Glu Pro Gln Phe Ala Tyr Cys Arg Arg Val Leu Thr Ile SerIle Ala Leu Ile Thr Val Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu Asp GluLeu Glu Leu Phe Thr Asp Ala Val Glu Arg Trp Asp Ile Asn Tyr Ala Leu Lys HisLeu Pro Gly Tyr Met Lys Met Cys Phe Leu Ala Leu Tyr Asn Phe Val Asn Glu PheAla Tyr Tyr Val Leu Lys Gln Gln Asp Phe Asp Met Leu Leu Ser Ile Lys Asn AlaTrp Leu Gly Leu Ile Gln Ala Tyr Leu Val Glu Ala Lys Trp Tyr His Ser Lys TyrThr Pro Lys Leu Glu Glu Tyr Leu Glu Asn Gly Leu Val Ser Ile Thr Gly Pro LeuIle Ile Thr Ile Ser Tyr Leu Ser Gly Thr Asn Pro Ile Ile Lys Lys Glu Leu GluPhe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Ile Val His Trp Ser Ser Lys Ile Phe Arg Leu GlnAsp Asp Leu Gly Thr Ser Ser Asp Glu Ile Gln Arg Gly Asp Val Pro Lys Ser IleGln Cys Tyr Met His Glu Thr Gly Ala Ser Glu Glu Val Ala Arg Glu His Ile LysAsp Met Met Arg Gln Met Trp Lys Lys Val Asn Ala Tyr Thr Ala Asp Lys Asp SerPro Leu Thr Arg Thr Thr Thr Glu Phe Leu Leu Asn Leu Val Arg Met Ser His PheMet Tyr Leu His Gly Asp Gly His Gly Val Gln Asn Gln Glu Thr Ile Asp Val GlyPhe Thr Leu Leu Phe Gln Pro Ile Pro Leu Glu Asp Lys Asp Met Ala Phe Thr AlaSer Pro Gly Thr Lys Gly

纯化柱为Ni-Agarose纯化系统，填充料Ni-NTA Agarose购自自德国QIAGEN公司，蛋白纯化方法参见说明书。

纯化得到的香桧烯合酶进行SDS-PAGE电泳，结果如图1A所示，得到的香桧烯合酶的大小为72kD左右；将纯化得到的香桧烯合酶与未切除转运肽的STPS全长基因的表达产物进行蛋白印记杂交，结果如图2所示。

实施例2香桧烯合酶催化香桧烯合成

香桧烯合酶可以催化牻牛儿基焦磷酸(GPP)产生以香桧烯为主的单萜代谢物，通过以下方法验证其催化功能。

将纯化的香桧烯合酶50μg加入到500μL缓冲液中(缓冲液组分为：25mM4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸pH7.3，10mM氯化镁，0.1mM氯化锰，0.2mM钨酸钠，0.1mM氟化钠，5mM二硫苏糖醇和10％甘油)，添加50μM以牻牛儿基焦磷酸GPP，覆盖500μL正戊烷(正戊烷覆盖在反应液上层，为了萃取反应中生成的物质又能防止生成的萜烯物质挥发，方便GC-MS分析)，30℃孵育30min，将正戊烷转移至进样瓶中用于GC-MS分析。对照组不添加香桧烯合酶。GC-MS的条件为：GC-MS结合TR-5质谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为高纯氦气，进样量为1μL，不分流，恒流模式，流速为1mL/min。进样口、离子源和传输线温度分别为250/260和280℃。GC升温程序为：40℃维持3min，以3℃/min升温至160℃，维持1min，然后以8℃/min升温至240℃并保留3min。MS条件为：离子源(EI)，电子轰击能量70eV，正离子模式，质量扫描范围m/z45-400amu。检测STPS蛋白反应体系中产生的化合物，物质定性基于NIST质谱图库及标准样品，GC-MS检测结果如图2所示，异源表达香桧烯合酶编码基因的大肠杆菌添加GPP后可以产生香桧烯、d-柠檬烯、β-月桂烯、反式-β-罗勒烯、和α-蒎烯，其峰面积分别为74.02％、10.51％、4.73％、5.12％、2.99％和2.64％，

测定香桧烯、d-柠檬烯、β-月桂烯、反式-β-罗勒烯、和α-蒎烯各物质的标准曲线，结果如下表所示：

注：y:各物质的峰面积，x为浓度(μg/g)

根据各物质的标准曲线，得到产生的香桧烯、d-柠檬烯、芳樟醇、反式-β-罗勒烯、β-月桂烯和α-蒎烯的量分别为7.41、1.32、0.99、0.55、0.88、0.30μg/g。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种香桧烯合酶及其编码基因和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 555

<212> PRT

<213> 脐橙(Citrus sinensis Osbeck )

<400> 1

Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Gln Pro Ser Ile Trp Asp His Asp Phe Leu

1 5 10 15

Gln Ser Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Asp Glu Thr Tyr Lys Arg Arg Ala

20 25 30

Glu Glu Leu Lys Gly Lys Val Lys Thr Ala Ile Lys Asp Val Thr Glu

35 40 45

Pro Leu Asp Gln Leu Glu Leu Ile Asp Asn Leu Gln Arg Leu Gly Leu

50 55 60

Ala Tyr His Phe Glu Pro Glu Ile Arg Asn Ile Leu Arg Asn Ile His

65 70 75 80

Asn His Asn Lys Asp Tyr Asn Trp Arg Lys Glu Asn Leu Tyr Ala Thr

85 90 95

Ser Leu Glu Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Tyr Pro Val Ser Gln

100 105 110

Glu Val Phe Ser Gly Phe Lys Asp Asp Lys Gly Gly Phe Ile Cys Asp

115 120 125

Asp Phe Lys Gly Ile Leu Ser Leu His Glu Ala Ser Tyr Tyr Ser Leu

130 135 140

Glu Gly Glu Ser Ile Met Glu Glu Ala Trp Gln Phe Thr Ser Lys His

145 150 155 160

Leu Lys Glu Met Met Ile Ile Ser Asn Ser Lys Glu Glu Asp Val Phe

165 170 175

Val Ala Glu Gln Ala Lys Arg Ala Leu Glu Leu Pro Leu His Trp Lys

180 185 190

Val Pro Met Leu Glu Ala Arg Trp Phe Ile His Val Tyr Glu Lys Arg

195 200 205

Glu Asp Lys Asn His Leu Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn

210 215 220

Thr Leu Gln Ala Ile Tyr Gln Glu Glu Leu Lys Asp Ile Ser Gly Trp

225 230 235 240

Trp Lys Asp Thr Gly Leu Gly Glu Lys Leu Ser Phe Ala Arg Asn Arg

245 250 255

Leu Val Ala Ser Phe Leu Trp Ser Met Gly Ile Ala Phe Glu Pro Gln

260 265 270

Phe Ala Tyr Cys Arg Arg Val Leu Thr Ile Ser Ile Ala Leu Ile Thr

275 280 285

Val Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu Asp Glu Leu Glu

290 295 300

Leu Phe Thr Asp Ala Val Glu Arg Trp Asp Ile Asn Tyr Ala Leu Lys

305 310 315 320

His Leu Pro Gly Tyr Met Lys Met Cys Phe Leu Ala Leu Tyr Asn Phe

325 330 335

Val Asn Glu Phe Ala Tyr Tyr Val Leu Lys Gln Gln Asp Phe Asp Met

340 345 350

Leu Leu Ser Ile Lys Asn Ala Trp Leu Gly Leu Ile Gln Ala Tyr Leu

355 360 365

Val Glu Ala Lys Trp Tyr His Ser Lys Tyr Thr Pro Lys Leu Glu Glu

370 375 380

Tyr Leu Glu Asn Gly Leu Val Ser Ile Thr Gly Pro Leu Ile Ile Thr

385 390 395 400

Ile Ser Tyr Leu Ser Gly Thr Asn Pro Ile Ile Lys Lys Glu Leu Glu

405 410 415

Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Ile Val His Trp Ser Ser Lys Ile Phe

420 425 430

Arg Leu Gln Asp Asp Leu Gly Thr Ser Ser Asp Glu Ile Gln Arg Gly

435 440 445

Asp Val Pro Lys Ser Ile Gln Cys Tyr Met His Glu Thr Gly Ala Ser

450 455 460

Glu Glu Val Ala Arg Glu His Ile Lys Asp Met Met Arg Gln Met Trp

465 470 475 480

Lys Lys Val Asn Ala Tyr Thr Ala Asp Lys Asp Ser Pro Leu Thr Arg

485 490 495

Thr Thr Thr Glu Phe Leu Leu Asn Leu Val Arg Met Ser His Phe Met

500 505 510

Tyr Leu His Gly Asp Gly His Gly Val Gln Asn Gln Glu Thr Ile Asp

515 520 525

Val Gly Phe Thr Leu Leu Phe Gln Pro Ile Pro Leu Glu Asp Lys Asp

530 535 540

Met Ala Phe Thr Ala Ser Pro Gly Thr Lys Gly

545 550 555

<210> 2

<211> 1668

<212> DNA

<213> 脐橙(Citrus sinensis Osbeck )

<400> 2

aggagatcag caaactacca accttcaatt tgggaccatg attttttgca gtcactgaat 60

agcaactata cggatgaaac atacaaaaga cgagcagaag agctgaaggg aaaagtgaag 120

acagcgatta aggatgtaac cgagcctctg gatcagttgg agctgataga taatttgcaa 180

agacttggat tggcttatca ttttgagcct gagattcgga acatattgcg taatatccac 240

aaccataata aagattataa ttggagaaaa gaaaatctgt atgcaacctc ccttgaattc 300

agactactta gacaacatgg ctatcctgtt tctcaagagg ttttcagtgg ttttaaagac 360

gacaagggag gcttcatttg tgatgatttc aagggaatac tgagcttgca tgaagcctcg 420

tattacagct tagaaggaga aagcatcatg gaggaggcct ggcaattcac cagtaagcat 480

cttaaagaaa tgatgatcat cagcaacagc aaggaagagg atgtatttgt agcagaacaa 540

gcgaagcgtg cgctggagct ccctctgcat tggaaagtgc ctatgttaga ggcaaggtgg 600

ttcatacacg tttatgagaa aagagaggac aagaaccacc ttttacttga gctcgctaag 660

ttggagttta acactttgca ggcaatttac caggaagaac ttaaagacat ttcagggtgg 720

tggaaggata caggtcttgg agagaaattg agctttgcga ggaacaggtt ggtagcgtcc 780

ttcttatgga gcatggggat cgcgtttgag cctcaattcg cctactgcag gagagtgctc 840

acaatctcga tagccctaat tacagtgatt gatgacattt atgatgtcta tggaacattg 900

gatgaacttg agctattcac tgatgctgtt gagaggtggg acatcaatta tgctttgaag 960

caccttccgg gctatatgaa aatgtgtttt cttgcgcttt acaactttgt taatgaattt 1020

gcttattacg ttctcaaaca acaggatttt gatatgcttc tgagcattaa aaatgcatgg 1080

cttggcttaa tacaagccta cttggtggag gcgaaatggt accatagcaa gtacacaccg 1140

aaactggaag aatacttgga aaatggattg gtatcaataa cgggcccttt aattataacg 1200

atttcatatc tttctggtac aaatccaatc attaagaagg aactggaatt tctagaaagt 1260

aatccaggta tagttcactg gtcatccaag attttccgtc tgcaagatga tttgggaact 1320

tcatcggacg agatacagag aggggatgtt ccaaaatcaa tccagtgtta catgcatgaa 1380

actggtgcct cggaggaagt tgctcgtgaa cacatcaagg atatgatgag acagatgtgg 1440

aagaaggtga atgcatacac agccgataaa gactctccct tgactcgaac aactactgag 1500

ttcctcttga atcttgtgag aatgtcccat tttatgtatc tacatggaga tgggcatggt 1560

gttcaaaacc aagagactat cgatgtcggt tttacattgc tttttcagcc cattcccttg 1620

gaggacaaag acatggcttt cacagcatct cctggcacca aaggctga 1668

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcttctt gcattaatcc ctca 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcagcctttg gtgccaggag a 21

<210> 5

<211> 1824

<212> DNA

<213> 脐橙(Citrus sinensis Osbeck)

<400> 5

atgtcttctt gcattaatcc ctcaaccttg gttacctctg taaatggttt caaatgtctt 60

cctcttgcaa caaatggagc agccatcaga atcatggcca aaaataagcc agtccaaagc 120

cttgtcagcg ccaaatatga taatttgaca gttgatagga gatcagcaaa ctaccaacct 180

tcaatttggg accatgattt tttgcagtca ctgaatagca actatacgga tgaaacatac 240

aaaagacgag cagaagagct gaagggaaaa gtgaagacag cgattaagga tgtaaccgag 300

cctctggatc agttggagct gatagataat ttgcaaagac ttggattggc ttatcatttt 360

gagcctgaga ttcggaacat attgcgtaat atccacaacc ataataaaga ttataattgg 420

agaaaagaaa atctgtatgc aacctccctt gaattcagac tacttagaca acatggctat 480

cctgtttctc aagaggtttt cagtggtttt aaagacgaca agggaggctt catttgtgat 540

gatttcaagg gaatactgag cttgcatgaa gcctcgtatt acagcttaga aggagaaagc 600

atcatggagg aggcctggca attcaccagt aagcatctta aagaaatgat gatcatcagc 660

aacagcaagg aagaggatgt atttgtagca gaacaagcga agcgtgcgct ggagctccct 720

ctgcattgga aagtgcctat gttagaggca aggtggttca tacacgttta tgagaaaaga 780

gaggacaaga accacctttt acttgagctc gctaagttgg agtttaacac tttgcaggca 840

atttaccagg aagaacttaa agacatttca gggtggtgga aggatacagg tcttggagag 900

aaattgagct ttgcgaggaa caggttggta gcgtccttct tatggagcat ggggatcgcg 960

tttgagcctc aattcgccta ctgcaggaga gtgctcacaa tctcgatagc cctaattaca 1020

gtgattgatg acatttatga tgtctatgga acattggatg aacttgagct attcactgat 1080

gctgttgaga ggtgggacat caattatgct ttgaagcacc ttccgggcta tatgaaaatg 1140

tgttttcttg cgctttacaa ctttgttaat gaatttgctt attacgttct caaacaacag 1200

gattttgata tgcttctgag cattaaaaat gcatggcttg gcttaataca agcctacttg 1260

gtggaggcga aatggtacca tagcaagtac acaccgaaac tggaagaata cttggaaaat 1320

ggattggtat caataacggg ccctttaatt ataacgattt catatctttc tggtacaaat 1380

ccaatcatta agaaggaact ggaatttcta gaaagtaatc caggtatagt tcactggtca 1440

tccaagattt tccgtctgca agatgatttg ggaacttcat cggacgagat acagagaggg 1500

gatgttccaa aatcaatcca gtgttacatg catgaaactg gtgcctcgga ggaagttgct 1560

cgtgaacaca tcaaggatat gatgagacag atgtggaaga aggtgaatgc atacacagcc 1620

gataaagact ctcccttgac tcgaacaact actgagttcc tcttgaatct tgtgagaatg 1680

tcccatttta tgtatctaca tggagatggg catggtgttc aaaaccaaga gactatcgat 1740

gtcggtttta cattgctttt tcagcccatt cccttggagg acaaagacat ggctttcaca 1800

gcatctcctg gcaccaaagg ctga 1824

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggatccag gagatcagca aactaccaac ct 32

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgctcgagt cagcctttgg tgccaggaga t 31

Claims (9)

1.一种香桧烯合酶，其特征在于，该蛋白质具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或该蛋白质具有在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列基础上缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的衍生序列且该蛋白质具有香桧烯合酶活性。

2.一种香桧烯合酶的编码基因，其特征在于，该基因编码：

(a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)具有衍生自缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列并且具有香桧烯合酶活性的蛋白质。

3.根据权利要求2所述的一种香桧烯合酶的编码基因，其特征在于，所述基因为(ⅰ)或(ⅱ)的DNA分子：

(ⅰ)具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的DNA分子；

(ⅱ)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码具有香桧烯合酶活性的蛋白质的DNA分子。

4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求2～3任一项所述的香桧烯合酶的编码基因。

5.一种转化体，其特征在于，包括权利要求4所述的重组载体。

6.一种引物对，其特征在于，用于扩增权利要求2～3任一项所述的香桧烯合酶的编码基因全长及其任意片段。

7.一种如权利要求1所述的香桧烯合酶在香桧烯合成中的应用。

8.一种利用如权利要求1所述的香桧烯合酶合成香桧烯的方法，其特征在于，包括以下步骤：以牻牛儿基焦磷酸作为底物，在中性条件下，利用所述香桧烯合酶催化合成香桧烯。

9.一种生产香桧烯合酶的方法，其特征在于，培养权利要求5所述的转化体并由培养物中收集香桧烯合酶。