ES2371648T3 - Cepas de microorganismos optimizadas para vías de biosíntesis consumidoras de nadph. - Google Patents

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Abstract

Cepa de microorganismo, caracterizada porque comprende la limitación de una o varias actividad(es) que oxidan el NADPH mediante la deleción de uno o varios gen(es) que codifican para una quinona oxidorreductasa y/o una transhidrogenasa soluble, y porque comprende asimismo unas modificaciones que permiten favorecer una o varias actividad(es) enzimática(s) que reducen el NADP + mediante la deleción de uno o varios gen(es) que codifican para una fosfoglucosa isomerasa y/o una fosfofructoquinasa.

Description

Cepas de microorganismos optimizadas para vías de biosíntesis consumidoras de NADPH.
El NADP (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato) participa en su forma reducida, NADPH, en las reacciones intracelulares de oxidorreducciones que implican unas enzimas con actividad deshidrogenasa o reductasa.
La presente invención se refiere a unas cepas de microorganismos optimizadas para la producción, mediante biotransformación, de moléculas que tienen unas vías de biosíntesis consumidoras de NADPH. Las cepas según la invención se pueden utilizar en unos procedimientos de biotransformación consumidores de NADPH. Las cepas definidas según la invención pueden ser procarióticas o eucarióticas. En un modo de realización preferido, dicha cepa procariótica es una cepa de Escherichia coli. En otro modo de realización, dicha cepa eucariótica es una cepa de Saccharomyces, en particular S. cerevisiae.
La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de moléculas por biotransformación que comprende el cultivo en un medio apropiado de una cepa optimizada según la invención, comprendiendo asimismo dicha cepa optimizada los elementos genéticos necesarios para la preparación de dicha molécula.
Los procedimientos de biotransformación han sido desarrollados para permitir la producción de moléculas en grandes cantidades a bajo coste, permitiendo al mismo tiempo asimismo la valorización de diferentes sub-productos industriales o de la agricultura.
Para producir unas moléculas de interés mediante biotransformación in vivo se distinguirán dos grandes enfoques:
-
por un lado la fermentación que permite la producción de moléculas por un microorganismo a partir de una fuente de carbono simple (por ejemplo el documento WO0102547) que describe la producción de lisina por fermentación de C. glutamicum en presencia de glucosa),
-
por otra parte, la bioconversión por un microorganismo de un co-sustrato dado en una molécula de interés (véanse por ejemplo el documento WO0012745 que describe la producción de derivados R-piperidina, y el documento WO 0068397 que describe la producción de tagatosa). El co-sustrato es no asimilable; es diferente de la fuente de carbono que se utiliza sólo para producir la biomasa y el NADPH necesario a la bioconversión.
La mejora de un procedimiento de biotransformación puede basarse en diferentes factores tales como la temperatura, la oxigenación, la composición del medio, el procedimiento de recuperación, etc. Se puede prever asimismo la modificación del microorganismo de tal manera que la producción de la molécula de interés y/o su excreción sean aumentadas.
En el ámbito de una fermentación, se esforzará por ejemplo en optimizar la vía de biosíntesis, por ejemplo modificando la regulación de los genes o modificando los genes con el fin de modificar las características de las enzimas implicadas, o también optimizando la regeneración de los cofactores.
En el marco de la bioconversión, se esforzará más en reducir la formación de co-productos y optimizar la regeneración de cofactores implicados en la(s) etapa(s) de bioconversión.
Entre los cofactores implicados en las biotransformaciones, el NADPH toma una parte importante, en particular para la producción de aminoácidos (por ejemplo, arginina, prolina, isoleucina, metionina, lisina), de vitaminas (por ejemplo pantotenato, filoquinona, tocoferol), de moléculas aromáticas (por ejemplo documento WO9401564), de polioles (por ejemplo xilitol), de poliaminas (por ejemplo espermidina), de hidroxiésteres (por ejemplo etil-4-cloro-3-hidroxibutirato)
o de otras moléculas de alto valor añadido.
La presente invención se refiere por lo tanto a una cepa de microorganismos optimizados para la producción de moléculas que tienen unas vías de biosíntesis consumidoras de NADPH tal como la definida en la reivindicación 1.
En lugar de intentar optimizar para cada biotransformación el ratio NADPH/NADP+ en el microorganismo, los inventores han optado por la producción de microorganismos modificados con el fin de obtener diferentes ratios NADPH/NADP+, siendo dichos microorganismos modificados utilizados después para realizar las biotransformaciones consumidoras de NADPH.
Por "cepa de microorganismos" se entiende, según la invención, un conjunto de microorganismos de una misma especie, que comprende por lo menos un microorganismo de dicha especie. Así, las características descritas para la cepa se aplican a cada uno de los microorganismos de dicha cepa. Asimismo, las características descritas para uno de los microorganismos de la cepa se aplicarán al conjunto de dichos microorganismos que la compone.
Entre los microorganismos optimizados según la invención, se citarán las bacterias y las levaduras, los hongos filamentosos y en particular las bacterias y las levaduras de las especies siguientes: Aspergillus sp., Bacillus sp.,
E04805397 14-11-2011
Brevibacterium sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Gluconobacter sp., Pénicillium sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces sp., Xanthomonas sp., Candida sp.
El principio de la optimización del ratio NADPH/NADP+ se describe para E. coli y S. cerevisae. El mismo principio puede ser aplicado de manera similar a todos los microorganismos cultivados en condiciones aerobias.
El principio de la optimización del ratio NADPH/NADP+ consiste en limitar las actividades enzimáticas implicadas en la oxidación del NADPH, y en favorecer las actividades enzimáticas que permiten la reducción del NADP+. Se limitan las actividades enzimáticas implicadas en la oxidación del NADPH disminuyendo, y más particularmente inactivando, dichas actividades, en particular las actividades de tipo quinona oxidorreductasa y/o transhidrogenasa soluble. Se favorecen las actividades enzimáticas que permiten la reducción del NADP+ imponiendo el flujo de carbono a través del ciclo de pentosas fosfato y/o modificando la especificidad de cofactor de por lo menos una enzima de tal manera que ésta utiliza el NADP preferentemente al NAD, su cofactor habitual.
Las cepas optimizadas según la invención se obtienen mediante biología molecular. El experto en la materia conoce los protocolos que permiten modificar el carácter genético de los microorganismos. Las técnicas de transformación están documentadas y están al alcance del experto en la materia (Sambrook et al., 1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2ª ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nueva York).
Los procedimientos que permiten limitar una actividad enzimática consisten en modificar el gen que permite su expresión por un medio apropiado, por ejemplo aportando una o varias mutación(es) en la parte que codifica el gen en cuestión, o modificando la región promotora, en particular sustituyéndola por una secuencia que permite disminuir la expresión del gen.
Los procedimientos que permiten inactivar una actividad enzimática consisten en inactivar el producto de expresión del gen en cuestión por un medio apropiado, o bien en inhibir la expresión del gen en cuestión, o también suprimir por lo menos una parte del gen en cuestión, de manera que su expresión no tenga lugar (por ejemplo deleción de una parte o del conjunto de la región promotora necesaria para su expresión), o el producto de expresión haya perdido su función (por ejemplo deleción en la parte que codifica el gen en cuestión).
De manera preferida, la deleción de un gen comprende la supresión de lo esencial de dicho gen y, llegado el caso, su sustitución por un gen marcador de selección que permite facilitar la identificación, el aislamiento y la purificación de las cepas optimizadas según la invención.
La inactivación de un gen en E. coli se lleva a cabo preferentemente mediante recombinación homóloga (Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645). Se recuerda brevemente el principio de un protocolo: se introduce en la célula un fragmento lineal, obtenido in vitro, que comprende las dos regiones que flanquean el gen, y por lo menos un gen de selección entre estas dos regiones (generalmente un gen de resistencia a un antibiótico), presentando por lo tanto dicho fragmento lineal un gen inactivado. Se seleccionan las células que han sufrido un evento de recombinación y que tienen el fragmento introducido por exposición sobre medio selectivo. Se seleccionan entonces las células que hayan sufrido un evento de doble recombinación, en las cuales el gen nativo se ha sustituido por el gen inactivado. Este protocolo puede ser mejorado utilizando unos sistemas de selección positiva y negativa, con el fin de acelerar la detección de los eventos de dobles recombinaciones.
La inactivación de un gen en S. cervisiae se lleva a cabo asimismo de forma preferida mediante recombinación homóloga (Baudin et al., Nucl. Acids Res. 21, 3329-3330, 1993; Wach et al., Yeast 10, 1793-1808, 1994; Brachmann et al., Yeast. 14: 115-32, 1998).
Los procedimientos que permiten favorecer una actividad enzimática consisten en estabilizar el producto de expresión del gen en cuestión mediante un medio apropiado por ejemplo, disminuyendo su sensibilidad a unos efectores alostéricos, o en aumentar la expresión de dicho gen de manera que aumente la cantidad de enzima.
La sobreexpresión de un gen se puede llevar a cabo mediante el cambio del promotor de este gen in situ, por un promotor fuerte o inducible. De manera alternativa, se introduce, en la célula, un plásmido replicativo (simple o multicopias) en el que el gen que se desea sobreexpresar está bajo el control del promotor adecuado. En el caso de una modificación de Escherichia coli, se podrá, por ejemplo, utilizar los promotores Plac-o, Ptrc-o, ptac-o, tres promotores fuertes bacterianos para los cuales el operador lac (lacO) se ha suprimido para hacerlos constitutivos. En el caso de modificaciones de Saccharomyces cerevisiae, se podrán por ejemplo utilizar los promotores Ppgk, Padh1, Pgal1, Pgal10.
Los procedimientos que permiten modificar la especificidad de cofactor de una enzima de tal manera que ésta utilice el NADP preferentemente al NAD, consisten en modificar la secuencia del gen que permite la expresión de esta enzima (Bocanegra, J. A. Scrutton, N. S.; Perham, R. N. (1993) Création of an NADP-dependent pyruvate dehydrogenase multienzyme complex by protein engineering. Biochemistry 32: 2737-2740).
Las cepas optimizadas según la invención (es decir, capacidad aumentada de reducción del NADP+) comprenden la atenuación, incluso la inactivación, de una o varias actividad(es) enzimática(s) que oxida(n) el NADPH, y en particular, unas actividades de tipo quinona oxidorreductasa y/o transhidrogenasa soluble.
Se citarán como ejemplos de enzimas que oxidan el NADPH y sin que esta lista sea limitativa, las actividades y los genes siguientes:
Actividades enzimáticas
Número EC Genes E. coli Genes S. cerevisiae
Alcohol deshidrogenasa
1.1.1.2 yahK ADH6
Aldosa reductasa
1.1.1.21 GRE3
Shikimato deshidrogenasa
1.1.1.25 aroE ARO1
Metilglioxal reductasa
1.1.1.78 GRE2p
Gamma-glutamil fosfato reductasa
1.2.1.41 proA PRO2
2,4-dienoil coenzima A reductasa
1.3.1.34 fadH
Glutamato deshidrogenasa
1.4.1.4 gdhA GDH1, GDH2
Glutamato sintasa
1.4.1.13 gltB, gltD GLT1
Metilintetrahidrofolato deshidrogenasa
1.5.1.5 folD ADE3, MIS1
Transhidrogenasa soluble
1.6.1.1 udhA
Transhidrogenasa membranaria
1.6.1.2 pntA, pntB
Quinona oxidorreductasa
1.6.5.5 qor ZTA1
Nitrito reductasa
1.7.1.4 nirB, nirD
Sulfito reductasa
1.8.1.2 cysl, cysJ
Esterol desmetilasa
1.14.13.70 ERG 11
4-Hidroxi-3-metilbut-2-enilo difosfato reductasa
1.17.1.2 ispH
Flavodoxin reductasa
1.18.1.2 fpr
Las cepas optimizadas según la invención (es decir, la capacidad aumentada de reducción del NADP+) comprenden
10 asimismo unas modificaciones que permiten favorecer una o varias actividad(es) enzimática(s) que reduce(n) el NADP+, y en particular, unas modificaciones que permiten imponer el flujo de carbono a través del ciclo de pentosas fosfato, y/o unas modificaciones que se basan en la especificidad del cofactor de por lo menos una enzima, de tal manera que ésta utiliza el NADP preferentemente al NAD, su cofactor habitual.
15 Las actividades susceptibles de ser modificadas en las cepas optimizadas según la invención (es decir, la capacidad aumentada de reducción del NADP+) con el fin de favorecer una o varias actividad(es) enzimática(s) que reduce(n) el NADP+ se describen a continuación:
Actividades enzimáticas
Número EC Genes E. coli Genes S. cerevisiae
Fosfoglucosa isomerasa
5.3.1.9 pgi PGI1
Fosfofructoquinasa
2.7.1.11 pfkA, pfkB PFK1, PFK2
Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa
1.1.1.49 zwf ZWF1
6-Fosfogluconolactonasa
3.1.1.31 SOL1.SOL2, S0L3, SOL4
6-Fosfogluconato deshidrogenasa
1.1.1.44 gnd GND1, GND2
6-Fosfogluconato deshidratasa
4.2.1.12 edd
Malato sintasa
2.3.3.9 aceB DAL7
Isocitrato liasa
4.1.3.1 aceA ICL1
Isocitrato deshidrogenasa
1.1.1.42 icd IDP1, IDP2, IDP3
Isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfatasa
2.7.1.116 aceK
Dihidrolipoamida deshidrogenasa
1.8.1.4 lpd LPD1
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
1.2.1.12 gapA, gapC TDH1, TDH2, TDH3
20 Las actividades enzimáticas susceptibles de ser modificadas en las cepas optimizadas según la invención se definen principalmente mediante el uso de la denominación de la proteína o del gen en E. coli o S. cerevisiae. Sin embargo, este uso tiene un significado más general según la invención y abarca las actividades enzimáticas correspondientes en otros microorganismos. En efecto, utilizando las secuencias de las proteínas y de los genes de E. coli o de S. cerevisiae, el experto en la materia es capaz de determinar las proteínas y los genes equivalentes en otros
25 microorganismos diferentes de E. coli o S. cerevisiae.
Los medios de identificación de las secuencias homólogas y de sus porcentajes de homología son bien conocidos por el experto en la materia, comprendiendo en particular el programa BLAST que se puede utilizar a partir de la página http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros indicados por defecto en esta página. Las
30 secuencias obtenidas pueden ser entonces explotadas (es decir, alineadas) utilizando por ejemplo los programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) o MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl), con los parámetros indicados por defecto en estas páginas.
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Alternativamente, es posible utilizar el programa CD-Search (http://www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) que permite identificar unos dominios conservados en las secuencias proteicas de E. coli o de S. cerevisiae y buscar unas secuencias de otros microorganismos, que presentan el o los mismos dominios. Los dominios conservados están catalogados en la base de datos CDD (Conserved domain database; Marchler-Bauer A, Anderson JB, DeWeese-Scott C, Fedorova ND, Geer LY, He S, Hurwitz DI, Jackson JD, Jacobs AR, Lanczycki CJ, Liebert CA, Liu C, Madej T, Marchler GH, Mazumder R, Nikolskaya AN, Panchenko AR, Rao BS, Shoemaker BA, Simonyan V, Song JS, Thiessen PA, Vasudevan S, Wang Y, Yamashita RA, Yin JJ, Bryant SH. CDD: a curated Entrez database of conserved domain alignments. Nucleic Acids Research 31:383-387 (2003)), que reúne los datos de tipo PFAM o COG.
Los PFAM (Protein FAMilies database of alignments and hidden markov models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representan una amplia colección de alineaciones de secuencias proteicas, Cada PFAM permite visualizar unas alineaciones múltiples, ver unos dominios proteicos, evaluar la repartición entre los organismos, tener acceso a otras bases de datos, visualizar unas estructuras conocidas de proteínas.
Los COG (Clusters of Orthologous Groups of proteins; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) se obtienen comparando las secuencias proteicas procedentes de 43 genomas completamente secuenciados que representan 30 líneas filogenéticas mayores. Cada COG se define a partir de por lo menos tres líneas, lo cual permite así identificar unos dominios conservados antiguos.
A partir de las secuencias de consenso identificadas mediante estos diferentes métodos, es posible dibujar unas sondas oligonucleotídicas degeneradas que permiten clonar el gen correspondiente en otro microorganismo. Estas técnicas de rutina de biología molecular son bien conocidas en la técnica y son descritas por ejemplo en Sambrook et al. (1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2ª ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nueva York.).
Ejemplos de genes que codifican para unas proteínas análogas a la transhidrogenasa soluble de E. coli codificada por el gen udhA:
Genes
Microorganismos
sth
Azotobacter vinelandii
udhA
Salmonella typhimurium LT2
sthA
Pseudomonas aeruginosa PA01
sth
Pseudomonas fluorescens
sthA
Pseudomonas putida KT2440
udhA
Shigella flexneri 2a str. 3.0.1
sthA
Vibrio cholera
sthA
Yersinia pestis
Ejemplo de genes que codifican para unas proteínas análogas a la quinona oxidorreductasa de E. coli codificada por el gen qor:
Genes
Microorganismos
qor
Bradyrhizobium japonicum USDA 110
qor
Brucella suis 1330
CC3759
Caulobacter crescentus
mII0505
Mesorhizobium loti
qor
Mycobacterium tuberculosis H37RV
qor
Pseudomonas aeruginosa
ZTA1
S. cerevisiae
SPCC285.01c
Schizosaccharomyces pombe
drgA
Synechocystis sp. PCC6803
qorA
Staphylococcus aureus
TTC0305
Thermus thermophilus H B8
qor
Yersinia pestis C092
Las cepas optimizadas según la invención (es decir, la capacidad aumentada de reducción del NADP+) comprenden la deleción de por lo menos un gen que codifica para una actividad que oxida el NADPH, y en particular, la deleción de un gen que codifica para una quinona oxidorreductasa (por ejemplo qor, ZTA1) y/o un gen que codifica para una actividad transhidrogenasa soluble (por ejemplo udhA).
Según un modo preferido de realización de la invención, los genes udhA y qor son ambos suprimidos.
Según un modo particular de realización de la invención, las cepas optimizadas según la invención comprenden asimismo la deleción de uno o varios genes que codifican para las actividades fosfoglucosa isomerasa (por ejemplo
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pgi, PGI1) y/o fosfofructoquinasa (por ejemplo pfkA, PFK1).
Según otro modo particular de realización de la invención, las cepas optimizadas según la invención comprenden asimismo la modificación de uno o varios genes que codifican para las actividades dihidrolipoamida deshidrogenasa (por ejemplo lpd, LPD1) y/o gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (por ejemplo gapA, TDH1), consistiendo la modificación en modificar la preferencia de la enzima al provecho del NADP en lugar de NAD, su cofactor habitual.
Las cepas según la invención que tienen la deleción de los genes que codifican las actividades fosfoglucosa isomerasa y/o fosfofructoquinasa están adaptadas más particularmente para los procedimientos de biotransformación.
Para aumentar más la cantidad de NADPH disponible en los microorganismos optimizados según la invención, puede ser asimismo ventajoso sobreexpresar por lo menos un gen que codifica para una actividad enzimática entre la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (por ejemplo zwf, ZWF1) la 6-fosfogluconolactonasa (por ejemplo SOL1), la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (por ejemplo gnd, GND1) la isocitrato deshidrogenasa (por ejemplo icd, IDP1) y la transhidrogenasa membranaria (por ejemplo pntA) y/o suprimir por lo menos un gen que codifica para una actividad enzimática entre la 6-fosfogluconato deshidratasa (por ejemplo edd), la malato sintasa (por ejemplo aceB, DAL7), la isocitrato liasa (por ejemplo aceA, ICL1) y la isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfatasa (por ejemplo aceK).
La presente invención tiene asimismo por objeto un microorganismo optimizado para la producción de NADPH tal como se ha definido anteriormente y a continuación, que comprende asimismo uno o varios genes que codifican para las actividades enzimáticas implicadas en la biotransformación de una molécula de interés, así como uno o varios genes marcadores de selección.
Estos genes pueden ser nativos de la cepa optimizada según la invención o también introducidos en la cepa optimizada según la invención mediante transformación con un vector apropiado, o bien mediante integración en el genoma del microorganismo o también mediante un vector replicativo, llevando dicho vector apropiado uno o varios genes que codifican para dichas enzimas implicadas en la biotransformación de dicha molécula de interés y/o dichos marcadores de selección.
Estos genes comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima implicada en la biotransformación de la molécula de interés y/o un marcador de selección, siendo la secuencia codificante fusionada a unas secuencias promotoras eficaces en la célula procariota y/o eucariota seleccionada para la biotransformación. El vector (o plásmido) puede ser un vector vehículo entre E. coli y otro microorganismo.
La elección de la cepa optimizada para el ratio NADPH/NADP+ será determinada en función del tipo de biotransformación (fermentación o bioconversión), de la demanda total en NADPH de la vía de bioconversión considerada, de la naturaleza de la(s) fuente(s) carbonada(s), de la demanda en flujo de biomasa, etc.
La deleción de los genes que codifican para las actividades fosfoglucosa isomerasa y/o fosfofructoquinasa debería imponerse cuando no se es capaz de dominar la repartición del flujo de carbono entre la glicólisis y la vía de las pentosas fosfato. La deleción de los genes que codifican para la fosfoglucosa isomerasa se elegirá preferentemente para las fermentaciones o cuando la demanda en NADPH necesita, como mínimo, un flujo de reducción de 2 moles de NADP+ por mol de glucosa importada. La deleción de los genes que codifican para la fosfofructoquinasa se seleccionará preferentemente para las bioconversiones o cuando la demanda en NADPH necesita, como mínimo, un flujo de reducción de 3-4 moles de NADP+ por mol de glucosa importada. La modificación, tal como se ha descrito anteriormente y tal como se describirá a continuación, de los genes que codifican para las actividades dihidrolipoamida deshidrogenasa y/o gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa se realizará cuando las biotransformaciones necesitarán un flujo de reducción, como mínimo, superior a 3 moles de NADP+ por mol de glucosa importada y en particular para optimizar las cepas E. coli Δ(udhA, qor,) o E. coli Δ (udhA, qor, pgi) o E. coli Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB). Las demás modificaciones citadas, a saber la sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica para una actividad enzimática entre la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, la 6-fosfogluconolactonasa, la 6fosfogluconato deshidrogenasa, la isocitrato deshidrogenasa y la transhidrogenasa membranaria y/o la deleción de por lo menos un gen que codifica para una actividad enzimática entre la 6-fosfogluconato deshidratasa, la malato sintasa, la isocitrato liasa y la isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfatasa, podrán ser realizadas con el fin de afinar la optimización del ratio NADPH/NADP+ a las necesidades de la célula y del procedimiento de biotransformación en cuestión.
La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de las cepas optimizadas según la invención tal como se ha definido anteriormente y tal como se definirá a continuación, en el que se suprime un gen tomado de entre los que codifican para las actividades quinona oxidorreductasa y transhidrogenasa soluble y, llegado el caso, se suprime un gen tomado de entre los que codifican para las actividades glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y 6-fosfogluconolactonasa, y/o se modifica por lo menos un gen que codifica unas enzimas a NAD, en particular para las actividades dihidrolipoamida deshidrogenasa y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, con el fin de que éstas utilicen preferentemente el NADP y, llegado el caso, se suprime por lo menos un gen seleccionado de entre los que codifican para las actividades 6-fosfogluconato deshidratasa, malato sintasa, isocitrato liasa e
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isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfatasa, siendo estas deleciones y modificaciones realizadas mediante un medio apropiado, y/o se sobreexpresa por lo menos un gen seleccionado de entre los que codifican para las actividades glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, 6-fosfogluconolactonasa, 6-fosfogluconato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa y transhidrogenasa membranaria, o bien transformando la cepa con un vector apropiado que permite la sobreexpresión, o bien modificando la fuerza del promotor endógeno que controla el gen a sobreexpresar.
Según un modo particular de realización de la invención, el procedimiento de preparación de las cepas según la invención comprende asimismo la transformación de las cepas optimizadas con por lo menos un vector apropiado que comprende uno o varios genes que codifican una o varias enzimas implicadas en la biotransformación de una molécula de interés, así como uno o varios genes marcadores de selección.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de estas cepas optimizadas según la invención para las biotransformaciones NADPH-dependientes permitiendo así una mejora del rendimiento de biotransformación con relación a una cepa no optimizada para el NADPH.
Las biotransformaciones se realizarán utilizando unas cepas definidas según la invención en las que se expresarán unos genes que codifican las actividades enzimáticas que catalizan unas reacciones NADPH-dependientes. El experto en la materia sabrá fácilmente identificar tales enzimas, se citarán para ejemplos y sin que esta lista sea limitativa, las enzimas siguientes: EC 1.1.1.10 L-xilulosa reductasa, EC 1.1.1.21 metilglioxal reductasa, EC 1.1.1.51 3(o 17)β-hidroxiesteroide deshidrogenasa, EC 1.1.1.54 alil-alcohol deshidrogenasa, EC 1.1.1.80 isopropanol deshidrogenasa, EC 1.1.1.134 dTDP-6-deoxi-L-talosa 4-deshidrogenasa, EC 1.1.1.149 20α-hidroxiesteroide deshidrogenasa, EC 1.1.1.151 21-hidroxiesteroide deshidrogenasa, EC 1.1.1.189 prostaglandina-E2 9-reductasa, EC
1.1.1.191 indol-3-acetaldehído reductasa, EC 1.1.1.207 (-)-mentol deshidrogenasa, EC 1.1.1.234 flavanona 4reductasa, EC 1.2.1.50 long-chain-fatty-acil-CoA reductasa, EC 1.3.1.4 cortisona α-reductasa, EC 1.3.1.23 colestenona 5β-reductasa, EC 1.3.1.70 Δ14-esterol reductasa, EC 1.4.1.12 2,4-diaminopentanoato deshidrogenasa, EC 1.5.1.10 sacaropina deshidrogenasa, L-glutamata-forming, EC 1.7.1.6 azobenceno reductasa, EC 1.8.1.5 2oxopropil-CoM reductasa (carboxilatado), EC 1.10.1.1 trans-acenafteno-1,2-diol deshidrogenasa, EC 1.14.13.7 fenol 2-monooxigénasa, EC 1.14.13.12 benzoato 4-monooxigenasa, EC 1.14.13.26 fosfatidilcolina 12-monooxigenasa, EC
1.14.13.64 4-hidroxibenzoato 1-hidroxilasa, EC 1.14.13.70 esterol 14-demetilasa, EC 1.16.1.5 acuacobalamina reductasa, EC 1.17.1.1 CDP-4-dehidro-6-deoxiglucosa reductasa, EC 1.18.1.2 feredoxina-NADP reductasa.
La invención se refiere asimismo a un procedimiento de producción de una molécula de interés de la cual al menos una de las reacciones de la vía de biosíntesis es NADPH-dependiente, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a) cultivar unos microorganismos optimizados según la invención en un medio de cultivo apropiado que favorece su
crecimiento y que comprende las sustancias necesarias para la realización de la biotransformación mediante
fermentación o biotransformación, con la excepción del NADPH, y
b) extraer la molécula de interés del medio y, llegado el caso, purificarla.
De manera preferida, la molécula de interés se selecciona de entre los aminoácidos, las vitaminas, los esteroles, los flavonoides, los ácidos grasos, los ácidos orgánicos, los polioles y los hidroxiésteres. Para los aminoácidos o sus precursores, se citarán en particular la lisina, la metionina, la treonina, la prolina, el ácido glutámico, la homoserina, la isoleucina y la valina. Para las vitaminas o sus precursores, se citarán en particular el pantoato, el transneuroesporeno, la filoquinona, los tocoferoles. Para los esteroles, se citarán en particular el escualeno, el colesterol, la testosterona, la progesterona, la cortisona. Para los flavonoides, se citarán en particular la frambinona y la vestinona. Para los ácidos orgánicos, se citarán el ácido coumárico, el ácido 3-hidroxipropiónico. Para los polioles, se citarán el sorbitol, el xilitol, el glicerol. Para los hidroxiésteres, se citarán el etil-3-hidroxibutirato, el etil-4-cloro-3hidroxibutirato.
En el caso de una bioconversión, el procedimiento comprende asimismo la adición del sustrato a "convertir" en el medio de cultivo apropiado.
El medio de cultivo citado en la etapa b) del procedimiento según la invención definido anteriormente comprende por lo menos un carbohidrato asimilable seleccionado de entre diferentes azúcares asimilables, tales como la glucosa, la galactosa, la sacarosa, la lactosa, o las melazas, o los subproductos de estos azúcares. Una fuente de carbono simple muy particularmente preferida es la glucosa. Otra fuente de carbono simple preferida es la sacarosa. El medio de cultivo puede contener además una o varias sustancias (por ejemplo aminoácidos, vitaminas, sales minerales, etc.) que favorecen el crecimiento del microorganismo y/o la producción de la molécula de interés. En particular, el medio mineral de cultivo para E. coli podrá así ser de composición idéntica o similar a un medio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128), un medio M63 (Miller, 1992 ; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) o un medio tal como el definido por Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).
La definición de las condiciones de biotransformación es de la competencia del experto en la materia. Se fermentan en particular los microorganismos a una temperatura comprendida entre 20ºC y 55ºC, preferentemente entre 25ºC y 40ºC, más particularmente aproximadamente 30ºC para S. cerevisiae y aproximadamente 37ºC para E. coli.
5 Los ejemplos se proporcionan únicamente a título de ilustración de la invención y no limitan de ninguna forma el modo de realización ni el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Cálculo de los rendimientos óptimos teóricos de bioconversión del etilacetoacetato en etil-3hidroxibutirato
10 a) bioconversión con E. coli
Unas modelizaciones predictivas se realizan utilizando el algoritmo MetOpt®-Coli, un modelo estequiométrico desarrollado por la compañía METabolic EXplorer, que permite definir 1) el rendimiento máximo de producción en
15 etil-3-hidroxibutirato a partir del etilacetoacetato, 2) la mejor distribución de flujo a partir de la glucosa para asegurar las necesidades de crecimiento y de equilibrios redox necesarios para el desarrollo de la célula y alcanzar el rendimiento máximo de bioconversión.
Los parámetros impuestos al modelo son en particular 1) un flujo de importación de glucosa a 3 mmol-g-1.h-1, 2) un
20 porcentaje de crecimiento variable de 0, 0,15 y 0,25 h-1, 3) un flujo de la transhidrogenasa membranaria (pntAB) variable e inferior o igual a 1 mmol.g-1.h-1. El valor límite de flujo de la transhidrogenasa membranaria se determina a partir de la bibliografía (Hanson, 1979; Anderlund et al., 1999; Emmerling et al., 2002); 4) el flujo de mantenimiento ha sido limitado entre 5 y 22 mmol.g-1.h-1.
25 En todos los casos, el modelo sugiere la deleción de los genes udhA y qor. En la práctica, sin embargo, la cepa E. coli [Δ(udhA, qor)] no permitirá obtener un rendimiento equivalente al rendimiento óptimo teórico, debido a que será difícil mantener la repartición adecuada de flujo de carbono entre la vía de las pentosas fosfato y la de la glicólisis, siendo esta repartición variable con el porcentaje de crecimiento. En la práctica, se preferirá por lo tanto utilizar las cepas E. coli Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB)] o [Δ (udhA, qor, pgi)], dependiendo la selección entre estas dos cepas del
30 porcentaje de crecimiento de la cepa durante el procedimiento de bioconversión.
Los rendimientos óptimos teóricos de bioconversión del etilacetoacetato en etil-3-hidroxibutirato han sido calculados para diferentes cepas de E. coli optimizadas según la invención:
= 0
= 0,15 h-1 = 0,25 h1
Δ (udhA, qor, pgi)
1,82 1,74 1,22
Δ (udhA, qor, pgi) gapA-NADP dependiente
4,29 3,64 2,43
Δ (udhA, qor, pgi) Ipd-NADP dependiente
5,67 3,46 1,99
Δ (udhA, qor, pgi) gapA-NADP dependiente lpd-NADP dependiente
6,86 4,96 3,33
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB)
6,76 4,65 0,19
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dependiente
8,16 5,54 1,02
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB) lpd-NADP dependiente
8,33 5,60 1,77
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dependiente Ipd-NADP dependiente
9,33 6,38 2,60
Rendimientos óptimos teóricos de bioconversión del etilacetoacetato en etil-3-hidroxibutirato (mol por mol de glucosa) por unas cepas de E. coli optimizadas en su capacidad de reducción del NADP+
Con el fin de mejorar aún más el rendimiento óptimo teórico de las cepas optimizadas según la invención, se pueden
40 tener en cuenta unas modificaciones suplementarias, tales como la sobreexpresión de por lo menos un gen seleccionado de entre zwf, gnd, pntA, pntB e icd y/o la deleción de por lo menos un gen seleccionado de entre edd, aceA, aceB y aceK.
b) bioconversión con S. cerevisiae
45 Las modelizaciones predictivas se realizan utilizando el algoritmo MetOpt®-Scere, un modelo estequiométrico desarrollado por la compañía, que permite definir 1) el rendimiento máximo de producción en etil-3-hidroxibutirato a partir del etilacetoacetato, 2) la mejor distribución de flujo a partir de la glucosa para asegurar las necesidades de crecimiento y de equilibrios redox necesarios para el desarrollo de la célula y alcanzar el rendimiento máximo de
50 bioconversión.
Los parámetros impuestos al modelo son en particular 1) un flujo de importación de glucosa a 3 mmol-g-1.h-1, 2) un porcentaje de crecimiento variable de 0, 0,15 y 0,25 h-1, 3) un flujo de mantenimiento inferior o igual a 22 mmol.g-1.h-1. 4) las reacciones de los aldehídos deshidrogenasa (ALD2, ALD3, ALD6) son irreversibles e
55 impuestos en el sentido acetato + NAD(P)H -> acetilaldehído + NAD(P); la levadura no posee ninguna actividad equivalente a udhA o pntA,B.
El modelo permite tener en cuenta la compartimentación mitocondrial y peroxisomal.
En todos los casos, el modelo sugiere la deleción de un gen que codifica para una enzima que oxida el NADPH y en
5 particular, del gen ZTA1. En la práctica, sin embargo, la cepa S. cerevisiae [ΔZTA1] no permitirá obtener un rendimiento equivalente al rendimiento óptimo teórico, puesto que será difícil mantener la repartición adecuada de flujo de carbono entre la vía de las pentosas fosfato y la de la glicólisis, siendo esta repartición variable con el porcentaje de crecimiento. En la práctica, se preferirá por lo tanto utilizar las cepas S. cerevisiae [Δ (ZTA1, PFK1, PFK2)] o [Δ (ZTA1, PGI1)], dependiendo la selección entre estas dos cepas del porcentaje de crecimiento de la cepa
10 durante el procedimiento de bioconversión.
Los rendimientos óptimos teóricos de bioconversión del etilacetoacetato en etil-3-hidroxibutirato han sido calculados para diferentes cepas de S. cerevisiae optimizadas según la invención:
= 0
= 0,15 h-1 = 0,25 h-1
Δ (ZTA1,PGI1)
2,42 2,00 1,73
Δ (ZTA1 ,PGI1 ) TDH1,2,3-NADP dependiente
4,22 3,50 3,03
Δ (ZTA1,PGI1) LPD1-NADP dependiente
4,08 3,29 2,77
Δ (ZTA1,PGI1) TDH1,2,3-NADP dependiente LPD1- NADP dependiente
6,17 5,01 4,23
Δ (ZTA1, PFK1, PFK2)
12,00 8,18 5,64
Δ (ZTA1, PFK1, PFK2) TDH1,2,3-NADR dependiente
12,00 9,11 7,19
Δ (ZTA1, PFK1, PFK2) LPD1-NADP dependiente
12,00 8,44 6,06
Δ (ZTA1, PFK1, PFK2) TDH1,2,3-NADP dependiente LPD1-NADP dependiente
12,00 9,28 7,46
15 Rendimientos óptimos teóricos de bioconversión del etil-acetoacetato en etil-3-hidroxibutirato (mol por mol de glucosa) por unas cepas de S. cerevisiae optimizadas en su capacidad de reducción del NADP+
Con el fin de mejorar aún más el rendimiento óptimo teórico de las cepas optimizadas según la invención, se pueden
20 tener en cuenta unas modificaciones suplementarias, tales como la sobreexpresión de por lo menos un gen seleccionado de entre ZWF, SOL1, SOL2, SOL3, SOL4, GND1, GND2, IDP1, IDP2 e IDP3 y/o la deleción de por lo menos un gen seleccionado de entre ICL1 y DAL7.
Ejemplo 2: Construcción de la cepa E. coli [ (udhA, qor)]
25 La inactivación del gen udhA se lleva a cabo mediante recombinación homóloga según la técnica descrita por Datsenko y Wanner (One-step inactivatiom of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 6640-6645).
30 Esta técnica consiste en insertar un casete de resistencia a un antibiótico (cloramfenicol) suprimiendo al mismo tiempo la mayor parte del gen en cuestión. Para ello, se sintetiza un par de oligonucleótidos, estando cada uno constituidos por 100 pb de los cuales 80 pb (minúsculas) son homólogos con el gen a suprimir (por ejemplo udhA) y 20 pb (mayúsculas) son homólogos con el casete de resistencia al cloramfenicol:
35 DudhAF ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagcCATATGAATATCCTCCTTA G
DudhAR 40 CccagaatctcttttgtttcccgatggaacaaaattttcagcgtgcccacgttcatgccgacgatttgtgcgcgtgccagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
El casete antibiótico llevado por el plásmido pKD3 se amplifica mediante PCR utilizando los oligonucleótidos DudhAF y DudhAR. El producto PCR obtenido se introduce entonces mediante electroporación en la cepa E. coli [pKD46], que lleva el gen que codifica la Red recombinasa, enzima que cataliza la recombinación homóloga. Los
45 transformantes que resisten al cloramfenicol son entonces seleccionados, y la inserción del casete de resistencia se verifica mediante un análisis PCR utilizando los oligonucleótidos UdhAF y UdhAR:
UdhaF Ggccgctcaggatatagccagataaatgac
50 UdhaR Gcgggatcactttactgccagcgctggctg
Después, se elimina el casete de resistencia al cloramfenicol. Para ello, el plásmido pCP20 que lleva la recombinasa 55 FLP que actúa a nivel de los sitios FRT del casete de resistencia al cloramfenicol, se introduce en las cepas
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recombinantes mediante electroporación. Después, tras una serie de cultivo a 42ºC, la pérdida del casete de resistencia al antibiótico se verifica mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos UdhAF y UdhAR.
La inactivación del gen qor se realiza según la misma técnica, utilizando los oligonucleótidos siguientes:
DqorF ggtggcccggaagtacttcaagccgtagagttcactcctgccgatccggcggagaatgaaatccaggtcgaaaataaagcCATATGAATATCCTCCTT AG
DqorR cgcccggctttccagaatctcatgcgcacgctgcgcatccttcagcggatatttctgctgctcggcgacatcgaccttaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
QorF Cgcccaacaccgactgctccgcttcgatcg
QorR cagcgttatgaccgctggcgttactaaggg
Por razones prácticas, puede ser interesante suprimir los dos genes simultáneamente. Para ello, cada gen es sustituido por un casete de resistencia a un antibiótico diferente (por ejemplo cloramfenicol para udhA y kanamicina para qor).
La cepa obtenida es por lo tanto E. coli [Δ(udhA, qor)].
Ejemplo 3: Construcción del plásmido pSK-PgapA-GRE2p, introducción en la cepa E. coli [ (udhA, qor)] y biotransformación del etilacetoacetato en etil-3-hidroxibutirato
El plásmido pSK-PgapA se construye mediante inserción del promotor gapA en el vector pBluescript-SK (pSK). Para ello, el promotor gapA de E. coli se amplifica con la polimerasa Pwo a partir del ADN cromosómico.
El producto PCR obtenido es digerido después por la enzima de restricción HinIII y se liga al vector pSK digerido por la enzima de restricción HindIII y desfosforila para dar el plásmido pSK-PgapA. El vector pSK lleva un origen de replicación para E. coli y un gen de resistencia a la ampicilina.
El plásmido pSK-PgapA se introduce entonces en la cepa E. coli DH5α para la verificación de la construcción. La secuenciación del promotor gapA del plásmido pSK-PgapA con el oligonucleótido universal M13 directo se realiza después para confirmar la construcción.
El plásmido pSK-PgapA-GRE2p se construye mediante la inserción del gen GRE2p en el plásmido pSK-PgapA. Para ello, se amplifica el gen GRE2p de Saccharomyces cerevisiae con la polimerasa Pwo a partir del ADN cromosómico utilizando los oligonucleótidos siguientes:
Ome119_GRE2F (Ndel) Acgtacgtggcatatgtcagttttcgtttcaggtgctaacggg
Ome120_GRE2R (PstI) Acgtacctgcagttatattctgccctcaaattttaaaatttggg
El producto PCR obtenido es digerido después por las enzimas de restricción NdeI - PstI y se ligan al vector pSK-PgapA digerido por las enzimas de restricción NdeI - PstI y se desfosforilan para dar el plásmido pSK-PgapA-GRE2p. El plásmido pSK-PgapA lleva un origen de replicación para E. coli y un gen de resistencia a la ampicilina.
El plásmido pSK-PgapA-GRE2p se introduce entonces en la cepa E. coli DH5α para la verificación de la construcción. La secuenciación del gen GRE2p del plásmido pSK-PgapA-GRE2p con los oligonucleótidos universales M13 inverso y M13 directo se realiza después para confirmar la construcción.
El plásmido validado se introduce entonces en la cepa E. coli [Δ(udhA, qor)] (ejemplo 2) mediante electroporación.
La cepa obtenida E. coli [Δ(udhA, qor)] pSK-PgapA-GRE2p] se cultiva entonces en un medio que contiene glucosa y etilacetoacetato. Una cepa de E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] se cultiva en las mismas condiciones.
Cuando los cultivos han terminado, se compara:
-
la evolución de la biomasa de cada cepa durante la fase de bioconversión,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato producido en el medio extracelular,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato acumulado en las células,
-
la productividad en etil-3-hidroxibutirato,
-
el rendimiento glucosa/etil-3-hidroxibutirato.
5 Se podrá observar que la cepa E. coli [Δ(udhA, qor)] pSK-PgapA-GRE2p] presenta un rendimiento de producción de etil-3-hidroxibutirato aumentado con relación a la cepa no optimizada.
Ejemplo 4: Construcción de la cepa E. coli [ (udhA, qor, pgi)] pSK-PgapA-GRE2p] y biotransformación del etilacetoacetato en etil-3-hidroxibutirato
10 La inactivación del gen pgi se lleva a cabo en la cepa E. coli [Δ(udhA, qor)] (ejemplo 2) utilizando la técnica descrita en el ejemplo 2, y los oligonucleótidos siguientes:
DpgiF 15 ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTT CG
DpgiR gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG
20 pgiF gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc
pgiR 25 cggtatgatttccgttaaattacagacaag
La construcción se realiza en medio rico (por ejemplo LB). Se introduce entonces en la cepa obtenida el plásmido pSK-PgapA-GRE2p (ejemplo 3) mediante electroporación, y la cepa resultante E. coli [Δ(udhA, qor, pgi)] pSK-PgapA-GRE2p] se selecciona sobre medio rico.
30 La cepa obtenida se cultiva entonces en medio mínimo que contiene glucosa y etilacetoacetato. Una cepa de E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] se cultiva en las mismas condiciones.
Cuando los cultivos han terminado, se compara: 35
-
la evolución de la biomasa de cada una de las cepas durante la fase de bioconversión,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato producido en el medio extracelular,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato acumulado en las células,
-
la productividad en etil-3-hidroxibutirato, 40 - el rendimiento glucosa/etil-3-hidroxibutirato.
Se podrá observar que la cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pgi)] pSK-PgapA-GRE2p] presenta un rendimiento de producción de etil-3-hidroxibutirato aumentado con relación a la cepa no optimizada.
molEHB/molGlucosa
MG1655 pSK-PgapA-GRE2p
0,75
MG1655 Δ (udhA, qor, pgi) pSK-PgapA-GRE2p
2,12
Ejemplo 5; Construcción de la cepa E. coli [ (udhA, qor, pgi, edd)] pSK-PgapA-GRE2p] y biotransformación del etilacetoacetato en etil-3-hidroxibutirato
La inactivación del gen edd se lleva a cabo en la cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pgi)] (ejemplo 4) utilizando la técnica 50 descrita en el ejemplo 2, y los oligonucleótidos siguientes:
DeddF (1932582-1932499) CgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgttcatcgttcgcagttggcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCT TCG
55 DeddR (1930866-1930943) cgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcccacgcgtgacgcgctcaggtcaggaatgtgcggttcgcgagcagccCATATGAATATCCTCCTTAG
EddF (1932996-1932968) 60 Gggtagactccattactgaggcgtgggcg
EddR (1930439-1930462)
Ccccggaatcagaggaatagtccc
La construcción se realiza en medio rico (por ejemplo LB). Se introduce entonces en la cepa obtenida cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd)] el plásmido pSK-PgapA-GRE2p (ejemplo 3) mediante electroporación, y la cepa resultante 5 E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd)] pSK-PgapA-GRE2p] se selecciona sobre medio rico.
La cepa obtenida cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd)] pSK-PgapA-GRE2p] se cultiva entonces en medio mínimo que contiene glucosa y etilacetoacetato. Una cepa de E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] se cultiva en las mismas condiciones.
10 Cuando los cultivos han terminado, se compara:
-
la evolución de la biomasa de cada una de las cepas durante la fase de bioconversión,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato producido en el medio extracelular,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato acumulado en las células, 15 - la productividad en etil-3-hidroxibutirato,
-
el rendimiento glucosa/etil-3-hidroxibutirato.
Se podrá observar que la cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, edd)] pSK-PgapA-GRE2p] presenta un rendimiento de producción de etil-3-hidroxibutirato aumentado con relación a la cepa no optimizada.
20 Ejemplo 6: Construcción de la cepa E. coli [ (udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p] y biotransformación del etilacetoacetato en etil-3-hidroxibutirato
La inactivación de los genes pfkA y pfkB se lleva a cabo en la cepa E. coli [Δ(udhA, qor)] (ejemplo 2) utilizando la 25 técnica descrita en el ejemplo 2, y los oligonucleótidos siguientes:
DpfkAF ggt gtg ttg aca agc ggc ggt gat gcg cca ggc atg aac gcc gca att cgc ggg gtt gtt cgt tct gcg ctg aca gaa ggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
30 DpfkAR TtcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgcttcatgttttcgatagcgtcgatgatgtcgtggtgaaccagctgCATATGAATATCCTCCTTAG
PfkAF 35 Cgcacgcggcagtcagggccgacccgc
PfkAR ccctacgccccacttgttcatcgcccg
40 DpfkBF (1804421-1804499) gcgccctctctcgatagcgcaacaattaccccgcaaatttatcccgaaggaaaactgcgctgtaccgcaccggtgttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTC G
DpfkBR (1805320-1805241) 45 gcgggaaaggtaagcgtaaattttttgcgtatcgtcatgggagcacagacgtgttccctgattgagtgtggctgcactccCATATGAATATCCTCCTTAG
PfkBF (1803996-1804025)
tggcaggatcatccatgacagtaaaaacgg
50 PfkBR (1805657-1805632) gccggttgcactttgggtaagccccg
La construcción se realiza en medio rico (por ejemplo LB). Se introduce entonces en la cepa obtenida cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB)] el plásmido pSK-PgapA-GRE2p (ejemplo 3) mediante electroporación, y la cepa resultante
55 E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB)] pSK-PgapA-GRE2p] se selecciona sobre medio rico.
La cepa obtenida cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB)] pSK-PgapA-GRE2p] se cultiva entonces en medio mínimo que contiene glucosa y etilacetoacetato. Una cepa de E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] se cultiva en las mismas condiciones.
60 Cuando los cultivos han terminado, se compara:
-
la evolución de la biomasa de cada una de las cepas durante la fase de bioconversión,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato producido en el medio extracelular, 65 - la cantidad de etil-3-hidroxibutirato acumulado en las células,
-
la productividad en etil-3-hidroxibutirato,
-
el rendimiento glucosa/etil-3-hidroxibutirato.
Se podrá observar que la cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pfkA, pfkB)] pSK-PgapA-GRE2p] presenta un rendimiento de producción de etil-3-hidroxibutirato aumentado con relación a la cepa no optimizada.
molEHB/molGlucosa
MG1655 pSK-PgapA-GRE2p
0,75
MG1655 Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB) pSK-PgapA-GRE2p
3,46
Ejemplo 7: Construcción de la cepa E. coli [ (udhA, qor, pgi, lpd) plpd*, pSK-PgapA-GRE2p] y biotransformación del etilacetoacetato en etilo-3-hidroxibutirato
10 El gen lpd que codifica la dihidrolipoamida deshidrogenasa NAD-dependiente, implicada en el complejo multienzimático piruvato deshidrogenasa, se suprime utilizando la técnica descrita en el ejemplo 2, salvo que la cepa inicial es la cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pgi)] descrita en el ejemplo 4 en lugar de ser una cepa salvaje. La construcción y la selección de la cepa modificada se llevan a cabo en medio rico (por ejemplo LB). La cepa obtenida es E. coli
15 [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)].
Por otra parte, se construye el plásmido p-lpd* que permite la sobreexpresión de una dihidrolipoamida deshidrogenasa NADP-dependiente. Existen diferentes posibilidades para modificar la especificidad de cofactor de una enzima. Por ejemplo, Bocanegra et al. (1993) dan a conocer un método para crear una dihidrolipoamida
20 deshidrogenasa NADP-dependiente.
Los plásmidos p-lpd* y pSK-PgapA-GRE2p son entonces introducidos mediante electroporación en la cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)], alternativamente, se puede elegir clonar lpd* sobre pSK-PgapA-GRE2p; se obtendría entonces el plásmido pSK-PgapA-GRE2p-lpd* que se introduciría mediante electroporación en la cepa E. coli
25 [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)]. La construcción y la selección de la cepa modificada se llevan a cabo en medio rico (por ejemplo LB).
La cepa obtenida cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)pSK-PgapA-GRE2p, p-lpd*)] se cultiva entonces en medio mínimo que contiene glucosa y etilacetoacetato. Una cepa de E. coli [pSK-PgapA-GRE2p] se cultiva en las mismas 30 condiciones.
Cuando los cultivos han terminado, se compara:
-
la evolución de la biomasa de cada una de las cepas durante la fase de bioconversión, 35 - la cantidad de etil-3-hidroxibutirato producido en el medio extracelular,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato acumulado en las células,
-
la productividad en etil-3-hidroxibutirato,
-
el rendimiento glucosa/etil-3-hidroxibutirato.
40 Se podrá observar que la cepa E. coli [Δ(udhA, qor, pgi, lpd)pSK-PgapA-GRE2p, p-lpd*)] presenta un rendimiento de producción de etil-3-hidroxibutirato aumentado con relación a la cepa no optimizada.
Ejemplo 8: Construcción del plásmido pRSGK-GRE2p
45 El plásmido pYGK se construye mediante inserción del promotor Ppgk, del sitio de multiclonación y del terminador cycl del vector pYPG2 en el vector pBluescript-SK (pSK). Para ello, el promotor Ppgk, el sitio de multiclonación y el terminador cycl son amplificados con la polimerasa Pfu Turbo a partir del vector pYPG2. El producto PCR obtenido se digiere después por las enzimas de restricción SacII -NotI, y se liga al vector pSK digerido mediante las enzimas de restricción ApaI - SmaI, se liga y después es digerido por las enzimas de restricción NotI - SacII y se desfosforila
50 para dar el plásmido pYGK.
El plásmido pYGK se introduce entonces en la cepa E. coli DH5α para verificar la construcción. La secuenciación del promotor PpGK, del sitio de multiclonación y del terminador cycl del plásmido pYGK con los oligonucleótidos universales M13 inverso y M13 directo se realiza después para confirmar la construcción.
55 El plásmido pYGK-GRE2p se construye después mediante la inserción del gen GRE2p en el plásmido pYGK. Para ello, el gen GRE2p de Saccharomyces cerevisiae se amplifica con la polimerasa Pwo a partir del ADN cromosómico, utilizando los oligonucleótidos siguientes:
60 Ome376_Gre2 pYGK F (SmaI) Acgtacgtcccccgggaaaaatgtcagttttcgtttcaggtgc
E04805397 14-11-2011
Ome377_Gre2 pYGKR (ApaI) ACGTACGGGCCCTTATATTCTGCCCTCAAATTTTAAAATTTGGG
El producto PCR obtenido es digerido después por las enzimas de restricción ApaI - SmaI y se liga al vector pYGK digerido mediante las enzimas de restricción ApaI - SmaI y se desfosforila para dar el plásmido pYGK-FRE2p.
El plásmido pYGK-FRE2p se introduce entonces en la cepa E. coli DH5α para la verificación de la construcción. La secuenciación del gen GRE2p del plásmido pYGK-GRE2p con los oligonucleótidos universales M13 inverso y M13 directo se realiza después para confirmar la construcción.
El plásmido pRSGK-GRE2p se obtiene finalmente mediante digestión de los plásmidos pYGK-GRE2p y pRS426 con las enzimas de restricción NotI - SacII y después ligación.
Ejemplo 9: Construcción de la cepa S. cerevisiae [ (ZTA1)pRSGK-GRE2p] y biotransformación del etilacetoacetato en etil-3-hidroxibutirato
La inactivación del gen ZTA1 se lleva a cabo insertando un marcador (resistencia a un antibiótico, auxotrofia) suprimiendo al mismo tiempo la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada está descrita por Brachmann et al. (Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications, Yeast, 1998, 14: 115-32). Se puede utilizar asimismo la técnica descrita por Wach et al. (New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae, Yeast, 1994, 10: 1793-1808).
En todos los casos se obtiene una cepa final S. cerevisiae [Δ(ZTA1)], en la que se introduce entonces el plásmido pRSGK-GRE2p (ejemplo 8).
Alternativamente, se puede elegir asimismo introducir el plásmido pRSGK-GRE2p en una cepa Δ(ZTA1), disponible, por ejemplo la cepa EUROSCARF Y33183 (genotipo: BY4743; Mat a/α; his3D1/his3D1; leu2D0/leu2D0; lys2D0/LYS2; MET15/met15D0, ura3D0/ura3D0; YBR046c::kanMX4/YBR046c::kanMX4). Es posible entonces después de la esporulación recuperar una cepa homocigoto S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p].
La cepa obtenida S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] se cultiva después en medio mínimo que contiene glucosa y etilacetoacetato.
La cepa control S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] se cultiva en las mismas condiciones.
Cuando los cultivos han terminado, se compara:
-
la evolución de la biomasa de cada una de las cepas durante la fase de bioconversión,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato producido en el medio extracelular,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato acumulado en las células,
-
la productividad en etil-3-hidroxibutirato,
-
el rendimiento glucosa/etil-3-hidroxibutirato.
Se podrá observar que la cepa S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] presenta un rendimiento de producción de etil-3-hidroxibutirato aumentado con relación a la cepa no optimizada.
Ejemplo 10: Construcción de la cepa S. cerevisiae [ (ZTA1, PGI1) pRSGK-GRE2p] y biotransformación del etilacetoacetato en etil-3-hidroxibutirato
La inactivación del gen PGI1 se lleva a cabo en la cepa S. cerevisiae [Δ(ZTA1) pRSGK-GRE2p] utilizando la técnica descrita en el ejemplo 9, y los oligonucleótidos siguientes:
Dpgi1F CCAACGCAGACCGCTGCCTGGCAGGCACTACAGAAACACTTCGATGAAATGAAAGACGTTACGATCGCCGATCT TTTTGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
Dpgi1R GCGCCACGCTTTATAGCGGTTAATCAGACCATTGGTCGAGCTATCGTGGCTGCTGATTTCTTTATCATCTTTCAG CTCTGCATATGAATATCCTCCTTAG
Pgi1F GCGGGGCGGTTGTCAACGATGGGGTCATGC
Pgi1R
CGGTATGATTTCCGTTAAATTACAGACAAG
Alternativamente, es posible utilizar una cepa Δ(PGI1) disponible, por ejemplo la cepa EUROSCARF Y23336 (Mat α/a; his3D1/his3D1; leu2D0/leu2D0; lys2D0/LYS2; MET15/met15D0; ura3D0/ura3D0; YBR196c::kanMX4/YBR196c). 5 La cepa se transforma entonces mediante plásmido pRSGK-GRE2p (ejemplo 8) y después se realiza la deleción del gen ZTA1 utilizando la técnica descrita en el ejemplo 9.
La cepa obtenida S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PGI1) pRSGK-GRE2p] se cultiva entonces en un medio mínimo que contiene glucosa y etilacetoacetato.
10 La cepa control S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] se cultiva en las mismas condiciones.
Cuando los cultivos han terminado, se compara:
15 - la evolución de la biomasa de cada una de las cepas durante la fase de bioconversión,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato producido en el medio extracelular,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato acumulado en las células,
-
la productividad en etil-3-hidroxibutirato,
-
el rendimiento glucosa/etil-3-hidroxibutirato.
20 Se podrá observar que la cepa S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PGI1) pRSGK-GRE2p] presenta un rendimiento de producción de etil-3-hidroxibutirato aumentado con relación a la cepa no optimizada.
Ejemplo 11: Construcción de la cepa S. cerevisiae [ (ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] y 25 biotransformación del etilacetoacetato en etil-3-hidroxibutirato
Los genes PFK1 y PFK2 son suprimidos en la cepa S. cerevisiae [Δ(ZTA1)] utilizando la técnica descrita en el ejemplo 9, y los oligonucleótidos siguientes:
30 Dpfk1F ATGCAATCTCAAGATTCATGCTACGGTGTTGCATTCAGATCTATCATCACAAATGATGAAAAGCTTCGTACGCTGC AGGTCG
Dpfk1R
35 TTTGTTTTCAGCGGCTAAAGCGGCTACCTCAGCTCTCAACTTTAATCTACCGGACAGGATGGGCCACTAGTGGAT CTGATATC
Pfk1 int F GCTTTCTTAGAAGCTACCTCCG
40 Pfk1 int R GAACCGACAAGACCAACAATGG
Pfk2 int F 45 CAGTTGTACACTTTGGACCC
Pfk2 intR GATCAGCACCAGTCAAAGAACC
50 La cepa se transforma entonces mediante el plásmido pRSGK-GRE2p (ejemplo 8).
La cepa obtenida S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] se cultiva entonces en un medio mínimo que contiene glucosa y etilacetoacetato.
55 La cepa control S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p] se cultiva en las mismas condiciones.
Cuando los cultivos han terminado, se compara:
-
la evolución de la biomasa de cada una de las cepas durante la fase de bioconversión, 60 - la cantidad de etil-3-hidroxibutirato producido en el medio extracelular,
-
la cantidad de etil-3-hidroxibutirato acumulado en las células,
-
la productividad en etil-3-hidroxibutirato,
-
el rendimiento glucosa/etil-3-hidroxibutirato.
65 Se podrá observar que la cepa S. cerevisiae [Δ(ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p] presenta un rendimiento de
E04805397 14-11-2011
producción de etil-3-hidroxibutirato aumentado con relación a la cepa no optimizada.
molEHB/molGlucosa
S. cerevisiae [pRSGK-GRE2p]
en curso
S. cerevisiae [Δ (ZTA1, PFK1, PFK2) pRSGK-GRE2p]
en curso
Ejemplo 12: Comparación entre los valores experimentales y las predicciones mediante el modelo 5 metabólico para la optimización de la producción de etil-3-hidroxibutirato por Escherichia coli
Se podrá observar una buena correlación entre las modelizaciones predictivas (ejemplo 1) y las realizaciones experimentales descritas en los ejemplos 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 y 11.
10 Los ejemplos 1 a 11 anteriores son unas aplicaciones particulares de la patente y no limitan su utilización. El experto en la técnica sabrá adaptar fácilmente estos ejemplos para la biotransformación de moléculas que tienen una síntesis NADPH-dependiente. El a través de la optimización del ratio NADPH/NADP+ está validado; esto permite además reivindicar una aplicación ampliada a todas las biotransformaciones NADPH-dependientes, que podrán ser modelizadas y previstas por MetOpt® o uno de sus derivados, utilizando E. coli, S. cerevisiae o cualquier otro
15 microorganismo.
Ejemplo 13: Cálculo de los rendimientos óptimos teóricos en el ámbito de procedimientos de fermentación en E. coli
20 El ejemplo 12 muestra que los modelos MetOpt® desarrollados por la compañía se pueden aplicar a las bioconversiones y deberían aplicarse más generalmente a las biotransformaciones tales como las fermentaciones.
A título de ejemplo, el modelo MetOpt®-Coli se aplica a la producción de cisteína o de 3-hidroxipropionato mediante fermentación de la glucosa en unas cepas de E. coli optimizadas según la invención. Los parámetros utilizados son 25 los mismos que en el ejemplo 1, a saber: 1) un flujo de importación de glucosa a 3 mmol.g-1.h-1, 2), un porcentaje de crecimiento variable de 0, 0,15 y 0,25 h-1, 3), un flujo de la transhidrogenasa membranaria (pntAB) variable e inferior
o igual a 1 mmol.g-1.h-1. El valor límite de flujo de la transhidrogenasa membranaria se determina a partir de la bibliografía (Hanson, 1979; Anderlund et al., 1999; Emmerling et al., 2002); 4) El flujo de mantenimiento ha sido limitado entre 5 y 22 mmol.g-1.h-1.
30 a) caso de la producción de cisteína mediante fermentación de la glucosa
= 0
= 0,15 h-1 = 0,25 h-1
Δ (udhA, qor, pgi)
0,66 0,37 0,09
Δ (udhA, qor, pgi) gapA-NADP dependiente
0,78 0,37 0,09
Δ (udhA, qor, pgi) Ipd-NADP dependiente
0,78 0,37 0,09
Δ (udhA, qor, pgi) gapA-NADP dependiente Ipd-NADP dependiente
0,78 0,37 0,09
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB)
0,40 0,18 0,01
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dependiente
0,62 0,30 0,06
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB) Ipd-NADP dependiente
0,71 0,36 0,13
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dependiente Ipd-NADP dependiente
0,77 0,42 0,17
Rendimientos óptimos teóricos de producción de la cisteína mediante unas cepas de E. coli optimizadas en 35 su capacidad de reducción del NADP+ (mol por mol de glucosa)
Con el fin de mejorar aún más el rendimiento óptimo teórico de las cepas optimizadas según la invención, se pueden tener en cuenta unas modificaciones suplementarias, tales como la sobreexpresión de por lo menos un gen seleccionado de entre zwf, gnd, pntA, pntB e icd y/o la deleción de por lo menos un gen seleccionado de entre edd,
40 aceA, aceB y aceK.
En la práctica, para obtener dichos rendimientos, otras modificaciones deberán ser aportadas a las cepas optimizadas según la invención, por ejemplo sobreexpresando el gen cysB tal como se ha descrito en la patente WO0127307, o modificando el gen cysE tal como se ha descrito en la patente EP 0 885 962.
45 b) caso de la producción de 3-hidroxipropionato mediante fermentación de la glucosa
La producción de 3-hidroxipropionato se realiza en unas cepas de E. coli que contiene los genes que codifican para las enzimas de la vía de síntesis del 3-hidroxipropionato, por ejemplo la malonil-coA reductasa de Chloroflexus
50 aurantiacus (Hügler et al., Journal of Bacteriology, 2002, 184: 2404-2410).
= 0
= 0,15 h-1 = 0,25 h-1
Δ (udhA, qor, pgi)
1,33 0,79 0,30
Δ (udhA, qor, pgi) gapA-NADP dependiente
1,76 0,99 0,30
Δ (udhA, qor, pgi) Ipd-NADP dependiente
1,82 0,99 0,30
Δ (udhA, qor, pgi) gapA-NADP dependiente Ipd-NADP dependiente
1,82 0,99 0,30
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB)
1,62 0,66 0,03
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dependiente
1,76 0,79 0,07
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB) Ipd-NADP dependiente
1,79 0,84 0,07
Δ (udhA, qor, pfkA, pfkB) gapA-NADP dependiente Ipd-NADP dependiente
1,79 0,84 0,07
Rendimientos óptimos teóricos de producción de 3-hidroxipropionato mediante unas cepas de E. coli optimizados en su capacidad de reducción del NADP+ (mol por mol de glucosa)
5 Con el fin de mejorar aún más el rendimiento óptimo teórico de las cepas optimizadas según la invención, se pueden tener en cuenta unas modificaciones suplementarias, tales como la sobreexpresión de por lo menos un gen seleccionado de entre zwf, gnd, pntA, pntB e icd y/o la deleción de por lo menos un gen seleccionado de entre edd, aceA, aceB y aceK.
10 Ejemplo 14: Cálculo de los rendimientos óptimos teóricos en el marco de procedimientos de fermentación en S. cerevisiae; aplicación a la producción de hidrocortisona
El ejemplo 12 muestra que los modelos MetOpt® desarrollados por la compañía se pueden aplicar a las bioconversiones y deberían aplicarse más generalmente a las biotransformaciones tales como las fermentaciones.
15 A título de ejemplo, el modelo MetOpt®-Coli se aplica a la producción de hidrocortisona mediante fermentación de la glucosa en unas cepas de S. cerevisiae optimizadas según la invención. Los parámetros utilizados son los mismos que en el ejemplo 1, a saber: 1) un flujo de importación de glucosa a 3 mmol.g-1.h-1, 2), un porcentaje de crecimiento variable de 0, 0,15 y 0,25 h-1, 3), un flujo de de mantenimiento inferior o igual a 22 mmol.g-1.h-1; 4) las reacciones de
20 los aldehídos deshidrogenasas (ALD2, ALD3, ALD&) son irreversibles e impuestas en el sentido acetato + NAD(P)H -> acetaldehído + NAD(P); 5) la levadura no posee ninguna actividad equivalente a udjA o pntA,B.
El modelo permite tener en cuenta la compartimentación mitocondrial y peroxisomal.
25 Esta representación de los resultados permite demostrar la aportación real de cada una de las mutaciones aportadas según la invención, en la mejora de la producción de NADPH y por lo tanto en la mejora del flujo de producción de hidrocortisona.
La producción de hidrocortisona se lleva a cabo en unas cepas de S cerevisiae que contienen los genes que 30 codifican para las enzimas de la vía de síntesis de la hidrocortisona (Szczebara et al., 2003, Nature Biotechnology,
21: 143-149).
= 0
= 0,15 h-1 = 0,25 h-1
Δ (ZTA1,PGI1)
0,12 0,08 0,06
Δ (ZTA1 ,PGI1 ) TDH1,2,3-NADP dependiente
0,21 0,14 0,10
Δ (ZTA1,PGI1) LPD1-NADP dependiente
0,20 0,14 0,10
Δ (ZTA1,PGI1)TDH1,2,3-NADP dependiente LPD1-NADP dependiente
0,21 0,14 0,10
Rendimientos óptimos teóricos de producción de hidrocortisona por unas cepas de S. cerevisiae 35 optimizadas en su capacidad de reducción del NADP+ (mol por mol de glucosa)
Las cepas de las cuales se suprimen los genes PFK1 y PFK2 son incapaces de producir la hidrocortisona, incluso no son viables. Esto se debe al hecho de que la producción de hidrocortisona está más limitada por la demanda en carbono que por la necesidad en NADPH. Una solución consiste en permitir una ligera expresión de una actividad de
40 tipo transhidrogenasas en la levadura. Sin embargo, las modelizaciones muestran que el flujo de producción de hidrocortisona no será nunca tan bueno como en el caso de una deleción del gen PGI1.
Con el fin de mejorar aún más el rendimiento óptimo teórico de las cepas optimizadas según la invención, se pueden tener en cuenta unas modificaciones suplementarias, tales como la sobreexpresión de por lo menos un gen 45 seleccionado de entre ZWF, SOL1, SOL2, SOL3, SOL4, GND1, GND2, EDP1, IDP2 e IDP3 y/o la deleción de por lo menos un gen seleccionado de entre ICL1, DAL7.
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<211> 100
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<400> 3
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<400> 4
15
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<210> 5 <211> 100 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 5
25
ggtggcccgg aagtacttca agccgtagag ttcactcctg ccgatccggc ggagaatgaa atccaggtcg aaaataaagc catatgaata tcctccttag 60 100
<210> 6 <211> 100 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 6
35
cgcccggctt tccagaatct catgcgcacg ctgcgcatcc ttcagcggat atttctgctg ctcggcgaca tcgaccttaa tgtaggctgg agctgcttcg 60 100
<210> 7 <211> 30 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 7
45
cgcccaacac cgactgctcc gcttcgatcg <210> 8 <211> 30 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético 30
<400> 8
cagcgttatg accgctggcg ttactaaggg
30
55
<210> 9 <211> 43 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 9
acgtacgtgg catatgtcag ttttcgtttc aggtgctaac ggg
43
65
<210> 10 <211> 44 <212> ADN
<213> oligonucleótido sintético
<400> 10
5
acgtacctgc agttatattc tgccctcaaa ttttaaaatt tggg 44
<210> 11
<211> 100
<212> ADN
<213> oligonucleótido sintético
<400> 11
ccaacgcaga ccgctgcctg gcaggcacta cagaaacact tcgatgaaat gaaagacgtt
60
15
acgatcgccg atctttttgc tgtaggctgg agctgcttcg 100
<210> 12
<211> 100
<212> ADN
<213> oligonucleótido sintético
<400> 12
gcgccacgct ttatagcggt taatcagacc attggtcgag ctatcgtggc tgctgatttc
60
25
tttatcatct ttcagctctg catatgaata tcctccttag 100
<210> 13
<211> 30
<212> ADN
<213> oligonucleótido sintético
<400> 13
gcggggcggt tgtcaacgat ggggtcatgc
30
35
<210> 14
<211> 30
<212> ADN
<213> oligonucleótido sintético
<400> 14
cggtatgatt tccgttaaat tacagacaag
30
45
<210> 15
<211> 102
<212> ADN
<213> oligonucleótido sintético
<400> 15
cgcgcgagac tcgctctgct tatctcgccc ggatagaaca agcgaaaact tcgaccgttc
60
atcgttcgca gttggcatgc ggtgtaggct ggagctgctt cg
102
55
<210> 16
<211> 98
<212> ADN
<213> oligonucleótido sintético
<400> 16
cgcaaggcgc tgaataattc acgtcctgtt cccacgcgtg acgcgctcag gtcaggaatg
60
tgcggttcgc gagcagccca tatgaatatc ctccttag
98
65
<210> 17
<211> 29
<212> ADN <213> oligonucleótido sintético
5
<400> 17 gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29
<210> 18 <211> 24 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 18
15
ccccggaatc agaggaatag tccc 24
<210> 19 <211> 100 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 19
25
ggtgtgttga caagcggcgg tgatgcgcca ggcatgaacg ccgcaattcg cggggttgtt cgttctgcgc tgacagaagg tgtaggctgg agctgcttcg 60 100
<210> 20 <211> .100 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 20
35
ttcgcgcagt ccagccagtc acctttgaac ggacgcttca tgttttcgat agcgtcgatg atgtcgtggt gaaccagctg catatgaata tcctccttag 60 100
<210> 21 <211> 27 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 21
45
cgcacgcggc agtcagggcc gacccgc <210> 22 <211> 27 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético 27
<400> 22
ccctacgccc cacttgttca tcgcccg
27
55
<210> 23 <211> 99 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 23
gcgccctctc tcgatagcgc aacaattacc ccgcaaattt atcccgaagg aaaactgcgc tgtaccgcac cggtgttcgt gtaggctgga gctgcttcg
60 99
65
<210> 24 <211> 100
<212> ADN <213> oligonucleótido sintético
5
<400> 24 gcgggaaagg taagcgtaaa ttttttgcgt atcgtcatgg gagcacagac gtgttccctg attgagtgtg gctgcactcc catatgaata tcctccttag 60 100
<210> 25 <211> 30 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
15
<400> 25 tggcaggatc atccatgaca gtaaaaacgg 30
<210> 26 <211> 26 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 26
25
gccggttgca ctttgggtaa gccccg 2 6
<210> 27 <211> 43 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 27
35
acgtacgtcc cccgggaaaa atgtcagttt tcgtttcagg tgc <210> 28 <211> 44 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético 4 3
<400> 28
acgtacgggc ccttatattc tgccctcaaa ttttaaaatt tggg
44
45
<210> 29 <211> 100 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 29
ccaacgcaga ccgctgcctg gcaggcacta cagaaacact tcgatgaaat gaaagacgtt acgatcgccg atctttttgc tgtaggctgg agctgcttcg
60 100
55
<210> 30 <211> 100 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 30
gcgccacgct ttatagcggt taatcagacc attggtcgag ctatcgtggc tgctgatttc tttatcatct ttcagctctg catatgaata tcctccttag
60 100
65
<210> 31 <211> 30
<212> ADN <213> oligonucleótido sintético
5
<400> 31 gcggggcggt tgtcaacgat ggggtcatgc 30
<210> 32 <211> 30 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 32
15
cggtatgatt tccgttaaat tacagacaag 30
<210> 33 <211> 82 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 33
25
atgcaatctc aagattcatg ctacggtgtt gcattcagat ctatcatcac aaatgatgaa aagcttcgta cgctgcaggt cg 60 82
<210> 34 <211> 83 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 34
35
tttgttttca gcggctaaag cggctacctc agctctcaac tttaatctac cggacaggat gggccactag tggatctgat atc 60 83
<210> 35 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 35
45
gctttcttag aagctacctc cg <210> 36 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético 22
<400> 36
gaaccgacaa gaccaacaat gg
22
55
<210> 37 <211> 20 <212> ADN <213> oligonucleótido sintético
<400> 37
cagttgtaca ctttggaccc
20
65
<210> 38 <211> 22 <212> ADN
<213> oligonucleótido sintético
<400> 38 gatcagcacc agtcaaagaa cc
5 22
E04805397 14-11-2011

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Cepa de microorganismo, caracterizada porque comprende la limitación de una o varias actividad(es) que oxidan el NADPH mediante la deleción de uno o varios gen(es) que codifican para una quinona oxidorreductasa y/o una transhidrogenasa soluble, y porque comprende asimismo unas modificaciones que permiten favorecer una o varias actividad(es) enzimática(s) que reducen el NADP+ mediante la deleción de uno o varios gen(es) que codifican para una fosfoglucosa isomerasa y/o una fosfofructoquinasa.
  2. 2.
    Cepa según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende asimismo la modificación de uno o varios gen(es) que codifican para una dihidrolipoamida deshidrogenasa y/o una gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, con el fin de que utilice(n) preferentemente el NADP.
  3. 3.
    Cepa según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque comprende asimismo la sobreexpresión de uno o varios gen(es) que codifican para una glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, una 6-fosfogluconolactonasa, una 6-fosfogluconato deshidrogenasa, una isocitrato deshidrogenasa o una transhidrogenasa membranaria.
  4. 4.
    Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque comprende asimismo la deleción de uno o varios gen(es) que codifican para una 6-fosfogluconato deshidratasa, una malato sintasa, una isocitrato liasa o una isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfatasa.
  5. 5.
    Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque comprende uno o varios genes, endógenos o exógenos, que codifican unas enzimas implicadas en la biotransformación de una molécula de interés.
  6. 6.
    Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque comprende uno o varios genes marcadores de selección.
  7. 7.
    Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque se selecciona de entre las especies siguientes: Aspergillus sp., Bacillus sp., Brevibacteritm sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Escherlchia sp., Gluconobacter sp., Pénicillium sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Saccharomyces sp., Streptomyces sp., Xanthomonas sp. y Candida sp.
  8. 8.
    Procedimiento de preparación de las cepas optimizadas según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se suprime uno o varios gen(es) que codifican para una quinona oxidorreductasa y/o una transhidrogenasa soluble, y se suprime uno o varios gen(es) que codifican para una fosfoglucosa isomerasa, una fosfofructoquinasa, una 6-fosfogluconato deshidratasa, una malato sintasa, una isocitrato liasa o una isocitrato deshidrogenasa quinasa/fosfotasa, y/o porque se modifica uno o varios gen(es) que codifican para una dihidrolipoamida deshidrogenasa y/o una gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, con el fin de que utilice(n) preferentemente el NADP, siendo estas deleciones y modificaciones llevadas a cabo mediante un medio apropiado, y/o se sobreexpresa uno o varios gen(es) que codifican para una glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, una 6-fosfogluconolactonasa, una 6-fosfogluconato deshidrogenasa, una isocitrato deshidrogenasa o una transhidrogenasa membranaria, o bien transformando la cepa con un vector apropiado que comprende uno o varios gen(es) que codifican una o varias enzima(s) implicadas en la biotransformación de una molécula de interés y/o uno
    o varios gen(es) marcadores de selección, o bien modificando la fuerza del o de los promotor(es) endógeno(s) que controlan el o los gen(es) a sobreexpresar.
  9. 9. Procedimiento de producción de una molécula de interés de la cual por lo menos una de las reacciones de la vía de biosíntesis es NADPH-dependiente, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
    a) cultivar unos microorganismos optimizados según una de las reivindicaciones 1 a 7, en un medio de cultivo apropiado que favorece su crecimiento y que comprende las sustancias necesarias para la realización de la biotransformación mediante fermentación o biotransformación, con la excepción del NADPH, y
    b) extraer la molécula de interés del medio y, llegado el caso, purificarla.
  10. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la molécula de interés se selecciona de entre los aminoácidos, las vitaminas, los esteroles, los flavonoides, los ácidos grasos, los ácidos orgánicos, los polioles y los hidroxiéteres.
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