CN105154380A

CN105154380A - 用于产生脂肪醇的方法和组合物

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Publication number: CN105154380A
Application number: CN201510520756.3A
Authority: CN
Inventors: 胡志浩
Original assignee: LS9 Inc
Current assignee: Genomatica Inc
Priority date: 2008-10-28
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2029-10-07
Also published as: US10961553B2; JP2012506715A; KR101636403B1; EP2796559B1; CA2740037C; EP2367947A4; ZA201103835B; KR20160083135A; EP2367947A2; MY194500A; CA3146669A1; US9068201B2; ES2505115T3; AU2009320224A1; US20190017081A1; KR20110090964A; US20130115665A1; CN102264910A; CN102264910B; AP2011005673A0

Abstract

本发明提供了对编码脂肪醛生物合成多肽的基因的鉴定，这些基因可以用来产生脂肪醛，随后这些脂肪醛可以被转化成脂肪醇。更具体地，本发明提供了通过遗传改造的宿主细胞产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达编码脂肪醛生物合成多肽或其变体的基因，在发酵培养基中培养宿主细胞，和分离脂肪醇，其中所述脂肪醇是从所述宿主细胞分泌的或者是被动转运入细胞外环境中。

Description

用于产生脂肪醇的方法和组合物

本申请是申请日为2009年10月7日、申请号为200980152677.4、发明名称为“用于产生脂肪醇的方法和组合物”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2008年10月28日提交的美国临时申请号61/109,131的权益，特此将其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

石油是地球上发现的、液体、气体或固体形式的有限的天然资源。石油主要由碳氢化合物组成，碳氢化合物主要由碳和氢组成。石油还含有大量的处于不同形式的其它元素，例如氮、氧或硫。

石油是宝贵资源，但是以相当大的金融和环境代价对石油产品进行开发。首先，必须发现石油资源。石油勘探是耗资并有风险的投资。勘探深水井的费用可以超过1亿美元。此外，不能保证这些井会含有石油。据估计，仅40％的钻井成为产生商业碳氢化合物的生产井。除经济费用外，石油勘探存在严重的环境代价。例如近海勘探扰乱周围海洋环境。

发现生产井后，必须以巨大代价从地球开采石油。在初次采收(primaryrecovery)中，地下的自然压力足以开采约20％的井中石油。当该自然压力降低时，如果经济上合算，则使用二次采收(secondrecovery)。通常，二次采收涉及通过例如水注射、天然气注射或气举等增加井压。使用二次采油，采收到另外5％至15％的石油。一旦二次采收方法不起作用，如果经济上合算，可以使用三次采收方法。三次方法涉及降低石油的粘度以使其更易开采。使用三次采收方法，采收到另外5％至15％的石油。因此，即使在最佳条件下，仅可以开采50％的井中石油。石油开采也存在环境代价。例如，石油开采可以导致大量石油渗漏上升至表面。此外，近海钻井涉及挖掘河床，这扰乱或破坏周围海洋环境。

因为石油矿藏不是在地球各处均匀发现的，所以石油必须从石油产生区长距离运输到石油消耗区。除运输费用外，还存在大规模油泄漏的环境风险。

从地球开采的原油在天然形式时具有少数商业用途。其是具有不同长度和复杂性的碳氢化合物(例如，石蜡(或烷)、烯烃(或烯)、炔、环烷(napthenes)(或环烷(cylcoalkanes))、脂肪族化合物、芳香族化合物等)的混合物。此外，原油含有其它有机化合物(例如含有氮、氧、硫等的有机化合物)和杂质(例如硫磺、盐、酸、金属等)。

因此，在商业上可以使用前，必须提炼并纯化原油。由于其高能量密度及其便利的可运输性，大部分石油被提炼为燃料，例如运输燃料(例如汽油、柴油、航空燃料等)、燃用油、液化石油气等。

原油还是用于产生石化产品的原材料的主要来源。两类主要的来自石油的原材料是短链烯烃(例如乙烯和丙烯)和芳香族化合物(例如苯和二甲苯异构体)。这些原材料来源于原油中较长链的碳氢化合物，这是通过以相当大的费用使用各种方法，例如催化裂化、蒸汽裂化或催化重整，裂化原油。这些原材料用于制造不能直接从原油提炼的石化产品，例如单体、溶剂、去垢剂或粘合剂。

来源于原油的原材料的一个实例是乙烯。乙烯被用于生产石化产品，例如聚乙烯、乙醇、氧化乙烯、乙二醇、聚酯、乙二醇醚、乙氧基化物、乙酸乙烯酯、1,2-二氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯、氯乙烯和聚氯乙烯。原材料的其它实例是丙烯，丙烯用于生产异丙醇、丙烯腈、聚丙烯、氧化丙烯、丙烯二醇、乙二醇醚、丁烯、异丁烯、1,3-丁二烯、合成橡胶、聚烯烃、α-烯烃、脂肪醇、丙烯酸、丙烯聚合物、氯化丙烯、环氧氯丙烷和环氧树脂。

然后，这些石化产品可以用于制造特种化学品，例如塑料、树脂、纤维、橡胶、药品、润滑剂或凝胶。可以产自石化材料的具体特种化学品为：脂肪酸、碳氢化合物(例如长链、支链、饱和的、不饱和的等)、脂肪醇、酯、脂肪醛、酮、润滑剂等。

脂肪醇具有许多商业用途。脂肪醇以及它们的衍生物的全球年销售额超过十亿美元。链较短的脂肪醇在化妆品和食品工业中用作乳化剂、润滑剂和增稠剂。由于其两性分子属性，脂肪醇起非离子表面活性剂的作用，所述非离子表面活性剂可用于个人护理和家庭产品，例如作为去垢剂。此外，脂肪醇被用于蜡、树胶、树脂、药物软膏和洗剂、润滑油添加剂、纺织品抗静电和整理剂、增塑剂、化妆品、工业溶剂和脂肪溶剂中。

醛用于生产很多特种化学品。例如，醛用于生产聚合物、树脂(例如胶木(Bakelite))、染料、调味剂、增塑剂、香水、药品和其它化学品。一些被用作溶剂、防腐剂或消毒剂。一些天然和合成的化合物，例如维生素和激素是醛。此外，很多糖含有醛基。

从原油获得这些特种化学品需要大量的金融投资以及大量的能量。因为原油中的长链碳氢化合物常常被裂化以产生较小的单体，其也是低效的过程。这些单体然后被用作生产更复杂的特种化学品的原材料。

除勘探、开采、运输和提炼石油的问题外，石油是有限的并逐渐减少的资源。估计世界石油消耗为每年300亿桶。据估计，以现有生产水平，世界石油储量预计在2050年前会耗竭。

最后，基于石油的燃料的燃烧释放温室气体(例如二氧化碳)和其它形式的空气污染(例如一氧化碳、二氧化硫等)。随着世界对燃料需求的增加，温室气体和其它形式的空气污染的排放也增加。大气中温室气体的累积导致增加全球变暖。因此，除局部破坏环境外(例如油泄漏、海洋环境的挖掘等)，燃烧石油还破坏全球环境。

由于石油所引起的内在挑战，存在对于不需要像石油一样被勘探、开采、长距离运输或大量提炼的可再生石油资源的需要。存在对于可以经济地生产而不会产生石油工业和基于石油的燃料的燃烧所产生的类型的环境破坏的可再生石油资源。基于相似原因，还存在对于通常来自石油的化学品的可再生资源的需要。

生产可再生的石油的一个方法是通过工程微生物来生产可再生的石油产品。一些微生物具有产生化学品的天然能力。例如，数世纪以来使用酵母来生产乙醇(例如啤酒、葡萄酒等)。近年来，通过先进的生物技术的发展，有可能在代谢上将生物工程化来产生以前未曾产生的生物产物。来源于这些细胞的活动的产物，例如化学品，被称为生物产物。产自这些细胞的活动的燃料被称为生物燃料。生物燃料是基于石油的燃料的可再生的替代燃料。生物燃料可以替代任何基于石油的燃料(例如汽油、柴油、航空燃料、民用燃料油等)。生物燃料可以来源于可再生的来源，例如植物质、动物质或甚至废料。这些可再生的来源共同地被称为生物质。生物燃料胜过基于石油的燃料的一个优点在于它们不需要昂贵的并且危险的勘探或开采。此外，可以在本地生产生物燃料。因此，它们不要求长距离的运输。而且，可以直接制造生物燃料，而不需要如同精炼原油所需要的昂贵的并且消耗大量能量的精炼。在其它的情形下，生物燃料可以需要有限的并且有成本效益水平的精炼。此外，生物燃料的使用通过减少在燃烧期间释放的环境有害排放物(例如温室气体、大气污染等)的量而改善了环境。例如，生物燃料维持了平衡的碳循环，因为生物燃料是从生物质产生的而生物质是可再生的自然资源。虽然生物燃料的燃烧会释放碳(例如二氧化碳)，但这种碳将会在生物质的产生期间再度循环(例如栽培作物)，因此能平衡碳循环，这与基于石油的燃料不同。

由于类似的原因，生物来源的化学品提供了如同生物燃料胜过基于石油的燃料一样的优点。生物来源的化学品是石油化学品的可再生的替代品。生物来源的化学品例如烃类(例如烷类、烯类或炔类)、脂肪醇、酯类、脂肪酸类、脂肪醛类以及酮类优于石油化制品，因为它们是直接生产的而无需大规模精炼。与石油化学品不同，生物来源的化学品不需要像原油那样被精炼以回收原料，这些原料然后必须还被加工以制造更复杂的石油化学品。生物来源的化学品是直接由从生物质转化成所希望的化学产品。

发明概述

本发明至少部分地基于编码脂肪醛生物合成多肽以及脂肪醇生物合成多肽的基因的鉴定，这些基因可以用来产生脂肪醛，随后这些脂肪醛可以被转化成脂肪醇。因此，一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达编码脂肪醛生物合成多肽的基因，所述脂肪醛生物合成多肽包含SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270或272的氨基酸序列或以上的变体。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞中分离所述脂肪醇。在一些实施方案中，所述脂肪醇存在于细胞外环境。在某些实施方案中，所述脂肪醇分离自所述宿主细胞的细胞外环境。在一些实施方案中，所述脂肪醇是从所述宿主细胞分泌的。在可选实施方案中，所述脂肪醇被转运入细胞外环境中。在其它的实施方案中，所述脂肪醇是被动转运入细胞外环境中。

在一些实施方案中，所述脂肪醛生物合成多肽包含具有一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270或272的氨基酸序列，并且所述多肽具有羧酸还原酶活性。在一些实施方案中，所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。

在一些实施方案中，所述多肽包含下列保守型氨基酸取代中的一种或多种：将诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸的脂肪族氨基酸替换为另一种脂肪族氨基酸；将丝氨酸替换为苏氨酸；将苏氨酸替换为丝氨酸；将诸如天冬氨酸以及谷氨酸的酸性残基替换为另一种酸性残基；将诸如天冬酰胺和谷氨酰胺的带有酰胺基团的残基替换为另一种带有酰胺基团的残基；将诸如赖氨酸和精氨酸的碱性残基替换为另一种碱性残基；以及将诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基替换为另一种芳香族残基。在一些实施方案中，所述多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。在一些实施方案中，所述多肽具有羧酸还原酶活性。在一些实施方案中，所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。

在一些实施方案中，所述方法还包括修饰所述宿主细胞中编码脂肪酸合酶的基因的表达。在某些实施方案中，修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在所述宿主细胞中表达所述编码脂肪酸合酶的基因和/或增加所述宿主细胞中内源性脂肪酸合酶的表达或活性。在可选实施方案中，修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括减弱所述宿主细胞中编码脂肪酸合酶的基因和/或降低所述宿主细胞中内源性脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中，所述脂肪酸合酶是硫酯酶。在具体的实施方案中，所述硫酯酶是由tesA、没有前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码的。

在一些实施方案中，所述方法还包括在所述宿主细胞中表达编码脂肪醇生物合成多肽的基因。在具体的实施方案中，所述脂肪醇生物合成多肽包括SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列，或以上的变体。

在其它的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于野生型宿主细胞的降低水平的脂肪酸降解酶。在一些实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于野生型宿主细胞的降低水平的酰基辅酶A合酶。在具体的实施方案中，所述宿主细胞表达降低水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基辅酶A合酶。在某些实施方案中，所述基因工程化的宿主细胞包含一个或多个编码脂肪酸降解酶的基因(例如上述酰基辅酶A合酶基因)的敲除。

在另外的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达降低水平的脱水酶/异构酶，例如由fabA或由图15中列出的基因编码的酶。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含fabA或图15中列出的基因的敲除。在其它的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达降低水平的酮酰-ACP合酶，例如由fabB或由图16中列出的基因编码的酶。在某些实施方案中，所述宿主细胞包含fabB或图16中列出的基因的敲除。在另外的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达改变水平的编码脱饱和酶的基因，例如desA。

在一些实施方案中，所述多肽来自细菌、植物、昆虫、酵母、真菌或哺乳动物。

在某些实施方案中，所述多肽来自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、细菌细胞或本文所述的任何其它生物。在一些实施方案中，所述细菌是选自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)、脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)、鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)、牛型分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、海洋分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)以及溃疡分枝杆菌(Mycobacteriumulcerans)的分枝杆菌。在其它的实施方案中，所述细菌是诺卡氏菌NRRL5646、皮疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、砂嗜盐产孢菌(Salinisporaarenicola)或密执安棒状杆菌(Clavibactermichiganenesis)。

在一些实施方案中，所述方法还包括在脂肪醛生物合成多肽的至少一种生物底物存在下培养所述宿主细胞。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达编码脂肪醛生物合成多肽的基因，所述脂肪醛生物合成多肽包括与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270或272的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列是SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270或272的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞分离所述脂肪醇。在一些实施方案中，所述脂肪醇存在于细胞外环境中。在某些实施方案中，所述脂肪醇分离自所述宿主细胞的细胞外环境。在一些实施方案中，所述脂肪醇是从所述宿主细胞分泌的。在可选实施方案中，所述脂肪醇被转运入细胞外环境中。在其它的实施方案中，所述脂肪醇是被动转运入细胞外环境中。

在一些实施方案中，所述方法还包括修饰所述宿主细胞中编码脂肪酸合酶的基因的表达。在某些实施方案中，修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在所述宿主细胞中表达编码脂肪酸合酶的基因和/或增加所述宿主细胞中内源性脂肪酸合酶的表达或活性。在可选实施方案中，修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括减弱所述宿主细胞中编码脂肪酸合酶的基因和/或降低所述宿主细胞中内源性脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中，所述脂肪酸合酶是硫酯酶。在具体的实施方案中，所述硫酯酶是由tesA、没有前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码的。

在一些实施方案中，所述方法还包括在所述宿主细胞中表达编码脂肪醇生物合成多肽的基因。在具体的实施方案中，所述脂肪醇生物合成多肽包含SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列或以上的变体。

在某些实施方案中，所述多肽来自于哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、细菌细胞或本文所述的任何其它生物。在一些实施方案中，所述细菌是选自耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛型分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、海洋分枝杆菌以及溃疡分枝杆菌的分枝杆菌。在其它的实施方案中，所述细菌是诺卡氏菌NRRL5646、皮疽诺卡氏菌、灰色链霉菌、砂嗜盐产孢菌或密执安棒状杆菌。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、263、265、267、269或271的核苷酸序列的互补物或与所述互补物的片段杂交，其中所述多核苷酸编码具有羧酸还原酶活性的多肽。在一些实施方案中，所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。

在一些实施方案中，所述多核苷酸在低严紧性、中等严紧性、高严紧性或极高严紧性条件下与SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、263、265、267、269或271的核苷酸序列的互补物或与所述互补物的片段杂交。

在一些实施方案中，所述多核苷酸来自细菌、植物、昆虫、酵母、真菌或哺乳动物。

在某些实施方案中，所述多肽来自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、细菌细胞或本文所述的任何其它生物。在一些实施方案中，所述细菌是选自耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛型分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、海洋分枝杆菌以及溃疡分枝杆菌的分枝杆菌。在其它的实施方案中，所述细菌是诺卡氏菌NRRL5646、皮疽诺卡氏菌、灰色链霉菌、砂嗜盐产孢菌或密执安棒状杆菌。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在所述宿主细胞中表达编码脂肪醛生物合成多肽的基因，所述脂肪醛生物合成多肽包含SEQIDNO:16的氨基酸或它的变体。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞分离所述脂肪醇。在一些实施方案中，所述脂肪醇存在于细胞外环境中。在某些实施方案中，所述脂肪醇分离自所述宿主细胞的细胞外环境。在一些实施方案中，所述脂肪醇是从所述宿主细胞分泌的。在可选实施方案中，所述脂肪醇被转运入细胞外环境中。在其它的实施方案中，所述脂肪醇是被动转运入细胞外环境中。

在一些实施方案中，所述多肽包含具有一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQIDNO:16的氨基酸序列，其中所述多肽具有羧酸还原酶活性。在一些实施方案中，所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达编码脂肪醛生物合成多肽的基因，所述脂肪醛生物合成多肽包含与SEQIDNO:16的氨基酸序列具有至少约70％的序列一致性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞分离所述脂肪醇。在某些实施方案中，所述脂肪醇分离自所述宿主细胞的细胞外环境。在一些实施方案中，所述脂肪醇是从所述宿主细胞分泌的。

在一些实施方案中，所述氨基酸序列与SEQIDNO:16的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列一致性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列是SEQIDNO:16。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:15的核苷酸序列的互补物或与所述互补物的片段杂交，其中所述多核苷酸编码具有羧酸还原酶活性的多肽。在一些实施方案中，所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。

在一些实施方案中，所述多核苷酸在低严紧性、中等严紧性、高严紧性或极高严紧性条件下与SEQIDNO:15的核苷酸序列的互补物或与所述互补物的片段杂交。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达重组载体，所述重组载体包含与图8中列出的核苷酸序列具有至少约70％的序列一致性的脂肪醛生物合成核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、263、265、267、269或271的核苷酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列一致性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、263、265、267、269或271。

在一些实施方案中，所述重组载体还包含可操作地连接至所述核苷酸序列的启动子。在某些实施方案中，所述启动子是发育调节型、细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性启动子。

在其它的实施方案中，所述重组载体包含至少一种选自以下的序列：(a)可操作地连接至所述核苷酸序列的调节序列；(b)可操作地连接至所述核苷酸序列的选择标记；(c)可操作地连接至所述核苷酸序列的标记序列；(d)可操作地连接至所述核苷酸序列的纯化部分；(e)可操作地连接至所述核苷酸序列的分泌序列；以及(f)可操作地连接至所述核苷酸序列的引导序列。

在一些实施方案中，所述重组载体是质粒。

在一些实施方案中，所述宿主细胞表达由所述重组载体编码的多肽。在一些实施方案中，所述核苷酸序列被稳定合并入所述宿主细胞的基因组DNA中，并且所述核苷酸序列的表达受调节性启动子区的控制。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达重组载体，所述重组载体包含与SEQIDNO:15的核苷酸序列具有至少约70％的序列一致性的脂肪醛生物合成核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:15的核苷酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列一致性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:15的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述重组载体是质粒。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达编码脂肪醛生物合成多肽的基因，所述脂肪醛生物合成多肽包含(i)SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9以及SEQIDNO:10；(ii)SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14；和/或(iii)SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10以及SEQIDNO:11；其中所述多肽具有羧酸还原酶活性。在一些实施方案中，所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。

在一些实施方案中，所述多肽的长度是约1,000个氨基酸至约2,000个氨基酸。在某些实施方案中，所述多肽的长度是约1,000个氨基酸、约1,050个氨基酸、约1,100个氨基酸、约1,150个氨基酸、约1,200个氨基酸、约1,250个氨基酸、约1,300个氨基酸、约1,400个氨基酸、约1,500个氨基酸、约1,600个氨基酸、约1,700个氨基酸、约1,800个氨基酸、约1,900个氨基酸或约2,000个氨基酸。在其它的实施方案中，所述多肽的长度多至约2,000个氨基酸、多至约1,900个氨基酸、多至约1,800个氨基酸、多至约1,700个氨基酸、多至约1,600个氨基酸、多至约1,500个氨基酸、多至约1,400个氨基酸、多至约1,300个氨基酸、多至约1,250个氨基酸、多至约1,200个氨基酸、多至约1,150个氨基酸、多至约1,100个氨基酸、多至约1,050个氨基酸或多至约1,000个氨基酸。在其它的实施方案中，所述多肽的长度大于约1,000个氨基酸、大于约1,050个氨基酸、大于约1,100个氨基酸、大于约1,150个氨基酸、大于约1,200个氨基酸、大于约1,250个氨基酸、大于约1,300个氨基酸、大于约1,400个氨基酸、大于约1,500个氨基酸、大于约1,600个氨基酸、大于约1,700个氨基酸、大于约1,800个氨基酸、大于约1,900个氨基酸或约2,000个氨基酸。

在其它的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于野生型宿主细胞降低水平的脂肪酸降解酶。在一些实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于野生型宿主细胞降低水平的酰基辅酶A合酶。在具体的实施方案中，所述宿主细胞表达降低水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基辅酶A合酶。在某些实施方案中，所述基因工程化的宿主细胞包含一个或多个编码脂肪酸降解酶的基因(例如上述酰基辅酶A合酶基因)的敲除。

在另外的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达降低水平的脱水酶/异构酶，例如由fabA或由图15中列出的基因编码的酶。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含fabA或图15中列出的基因的敲除。在其它的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达降低水平的酮酰-ACP合酶，例如由fabB或由图16中列出的基因编码的酶。在某些实施方案中，所述宿主细胞包含fabB或图16中列出的基因的敲除。在另外的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达改变水平的编码脱饱和酶的基因例如desA。

在一些实施方案中，所述方法还包括在所述脂肪醛生物合成多肽的至少一种生物底物存在下培养所述宿主细胞。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达编码脂肪醇生物合成多肽的基因，所述脂肪醇生物合成多肽包含SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列或以上的变体。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞分离所述脂肪醇。在一些实施方案中，所述脂肪醇存在于细胞外环境中。在某些实施方案中，所述脂肪醇分离自所述宿主细胞的细胞外环境。在一些实施方案中，所述脂肪醇是从所述宿主细胞分泌的。在可选实施方案中，所述脂肪醇被转运入细胞外环境中。在其它的实施方案中，所述脂肪醇是被动转运入细胞外环境中。

在一些实施方案中，所述脂肪醇生物合成多肽包含具有一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列，并且所述多肽具有醇脱氢酶活性。

在一些实施方案中，所述多肽包含下列保守型氨基酸取代中的一种或多种：将诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸的脂肪族氨基酸替换为另一种脂肪族氨基酸；将丝氨酸替换为苏氨酸；将苏氨酸替换为丝氨酸；将诸如天冬氨酸以及谷氨酸的酸性残基替换为另一种酸性残基；将诸如天冬酰胺和谷氨酰胺的带有酰胺基团的残基替换为另一种带有酰胺基团的残基；将诸如赖氨酸和精氨酸的碱性残基替换为另一种碱性残基；以及将诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基替换为另一种芳香族残基。在一些实施方案中，所述多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。在一些实施方案中，所述多肽具有醇脱氢酶活性。

在一些实施方案中，所述方法还包括在所述宿主细胞中表达编码脂肪醛生物合成多肽的基因。在具体的实施方案中，所述脂肪醛生物合成多肽包含SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270或272的氨基酸序列或其以上的变体。

在另外的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达降低水平的脱水酶/异构酶，例如由fabA编码的酶。在其它的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达降低水平的酮酰-ACP合酶，例如由fabB编码的酶。在另外的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达改变水平的编码脱饱和酶的基因，例如desA。

在某些实施方案中，所述多肽是来自细菌。在一些实施方案中，所述细菌是选自耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛型分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、海洋分枝杆菌以及溃疡分枝杆菌的分枝杆菌。在其它的实施方案中，所述细菌是诺卡氏菌NRRL5646、皮疽诺卡氏菌、灰色链霉菌、砂嗜盐产孢菌或密执安棒状杆菌。

在一些实施方案中，所述方法还包括在所述脂肪醇生物合成多肽的至少一种生物底物存在下培养所述宿主细胞。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达编码脂肪醇生物合成多肽的基因，所述脂肪醇生物合成多肽包含与SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列是SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194。

在一些实施方案中，所述方法还包括在所述宿主细胞中表达编码脂肪醛生物合成多肽的基因。在具体的实施方案中，所述脂肪醛生物合成多肽包含SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270或272的氨基酸序列或以上的变体。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191或193的核苷酸序列的互补物或与所述互补物的片段杂交，其中所述多核苷酸编码具有醇脱氢酶活性的多肽。

在一些实施方案中，所述多核苷酸在低严紧性、中等严紧性、高严紧性或极高严紧性条件下与SEQIDNO:93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191或193的核苷酸序列的互补物或与所述互补物的片段杂交。

在其它的实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于野生型宿主细胞降低水平的脂肪酸降解酶。在一些实施方案中，将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于野生型宿主细胞降低水平的酰基辅酶A合酶。在具体的实施方案中，所述宿主细胞表达降低水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基辅酶A合酶。在某些实施方案中，所述基因工程化的宿主细胞包含一种或多种编码脂肪酸降解酶的基因(例如上述酰基辅酶A合酶基因)的敲除。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括在宿主细胞中表达包含脂肪醇生物合成核苷酸序列的重组载体，所述脂肪醇生物合成核苷酸序列与SEQIDNO:93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191或193的核苷酸序列具有至少约70％的序列一致性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191或193的核苷酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列一致性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191或193。

在一些实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞分离所述脂肪醇。在一些实施方案中，所述脂肪醇存在于细胞外环境中。在某些实施方案中，所述脂肪醇是分离自所述宿主细胞的细胞外环境。在一些实施方案中，所述脂肪醇是从所述宿主细胞分泌的。在可选实施方案中，所述脂肪醇被转运入细胞外环境中。在其它的实施方案中，所述脂肪醇是被动转运入细胞外环境中。

在一些实施方案中，所述重组载体是质粒。

在一些实施方案中，所述方法还包括在脂肪醇生物合成多肽的至少一种生物底物存在下培养所述宿主细胞。

在本文所述的本发明的任何方面中，所述宿主细胞可以选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞以及细菌细胞。

在一些实施方案中，所述宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞。在其它的实施方案中，所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。

在一些实施方案中，所述宿主细胞选自以下属：埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、根毛霉属(Rhizomucor)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、毛霉菌属(Mucor)、蚀丝霉属(Myceliophtora)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、金黄孢子菌属(Chrysosporium)、酵母属(Saccharomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophamonas)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)或链霉菌属(Streptomyces)。

在具体实施方案中，所述宿主细胞为迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)细胞、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)细胞、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)细胞、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)细胞、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)细胞、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)细胞、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)细胞、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)细胞、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞或解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)细胞。

在其他实施方案中，宿主细胞为康氏木霉(Trichodermakoningii)细胞、绿色木霉(Trichodermaviride)细胞、里氏木霉(Trichodermareesei)细胞、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)细胞、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)细胞、烟曲霉(Aspergillusfumigates)细胞、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)细胞、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)细胞、黑曲霉(Aspergillusniger)细胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞、特异腐质霉(Humicolainsolens)细胞、棉毛状腐质霉(Humicolalanuginose)细胞、混浊红球菌(Rhodococcusopacus)细胞、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)细胞或米黑毛酶(Mucormichei)细胞。

在其它实施方案中，所述宿主细胞是浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)细胞或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)细胞。

在其他实施方案中，所述宿主细胞是放线菌(Actinomycetes)细胞。

在一些实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母细胞。

在具体的实施方案中，所述宿主细胞是来自真核植物、藻类、蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫非硫细菌、嗜极生物、酵母、真菌、以上的基因工程化的生物或合成生物的细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是光依赖性的或固定碳。在一些实施方案中，所述宿主细胞是光依赖性的或固定碳。在一些实施方案中，所述宿主细胞具有自养活性。在一些实施方案中，所述宿主细胞具有光合自养活性，例如在存在光的情况下。在一些实施方案中，所述宿主细胞在不存在光的情况下是异养或兼养的。在某些实施方案中，所述宿主细胞是来自拟南芥(Avabidopsisthaliana)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、巨芒(Miscanthusgiganteus)、玉米(Zeamays)、葡萄藻(Botryococcusebraunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、杜氏盐藻(Dunalielasalina)、聚球蓝细菌(SynechococcusSp.)PCC7002、聚球蓝细菌PCC7942、集胞蓝细菌(SynechocystisSp.)PCC6803、细长嗜热聚球蓝细菌(Thermosynechococcuselongates)BP-1、绿硫菌(Chlorobiumtepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexusauranticus)、酒色着色菌(Chromatiummvinosum)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalusris)、扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、热纤梭菌(Clostridiuthermocellum)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的细胞。

在其它的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞。

在另外的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在某些实施方案中，所述大肠杆菌细胞是菌株B、菌株C、菌株K或菌株W的大肠杆菌细胞。

另一方面，本发明的特征是产生脂肪醇的方法。所述方法包括使底物与下述接触：(i)脂肪醇生物合成多肽，其包含SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列或以上的变体，或(ii)由核苷酸序列编码的脂肪醇生物合成多肽，所述核苷酸序列与SEQIDNO:93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191或193的核苷酸序列或以上的变体具有至少约70％的一致性。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化所述脂肪醇。

在一些实施方案中，所述脂肪醇生物合成多肽包含具有一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列，其中所述多肽具有醇脱氢酶活性。

在一些实施方案中，所述多肽具有与SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽具有SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191或193的核苷酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列一致性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191或193。

在本文所述的本发明的任何方面中，这些方法可以产生包含C₆-C₂₆脂肪醇的脂肪醇。在一些实施方案中，所述脂肪醇包含C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀、C₂₁、C₂₂、C₂₃、C₂₄、C₂₅或C₂₆脂肪醇。在具体的实施方案中，所述脂肪醇是C₆、C₈、C₁₀、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇或C₁₈脂肪醇。在某些实施方案中，所述脂肪醇的羟基是在伯位(C₁)。

在其它的实施方案中，所述脂肪醇包含直链脂肪醇。在其它的实施方案中，所述脂肪醇包含支链脂肪醇。在另外的实施方案中，所述脂肪醇包含环状部分。

在一些实施方案中，所述脂肪醇是不饱和脂肪醇。在其它的实施方案中，所述脂肪醇是单不饱和脂肪醇。在某些实施方案中，所述不饱和脂肪醇是C6:1、C7:1、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20:1、C21:1、C22:1、C23:1、C24:1、C25:1或C26:1的不饱和脂肪醇。在另外的实施方案中，所述脂肪醇在ω-7位置是不饱和的。在某些实施方案中，所述不饱和脂肪醇包含顺式双键。

在另外的实施方案中，所述脂肪醇是饱和脂肪醇。

在本文所述的本发明的任何方面中，脂肪醛生物合成多肽的底物可以是脂肪酸。在一些实施方案中，所述脂肪酸包含C₆-C₂₆脂肪酸。在一些实施方案中，所述脂肪酸包含C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀、C₂₁、C₂₂、C₂₃、C₂₄、C₂₅或C₂₆脂肪酸。在具体的实施方案中，所述脂肪酸是C₆、C₈、C₁₀、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇或C₁₈脂肪酸。

在其它的实施方案中，所述脂肪酸包含直链脂肪酸。在其它的实施方案中，所述脂肪酸包含支链脂肪酸。在另外的实施方案中，所述脂肪酸包含环状部分。

在一些实施方案中，所述脂肪酸是不饱和脂肪酸。在其它的实施方案中，所述脂肪酸是单不饱和脂肪酸。在另外的实施方案中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸。

另一方面，本发明的特征在于基因工程化的微生物，所述微生物包含外源控制序列，所述外源控制序列被稳定合并入所述微生物的基因组DNA中并且位于包含与SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、263、265、267、269或271的核苷酸序列具有至少约70％的序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸的上游，其中所述微生物相对于野生型微生物产生升高水平的脂肪醇。

在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、263、265、267、269或271的核苷酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列一致性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、263、265、267、269或271。

在一些实施方案中，所述多核苷酸对于所述微生物而言是内源性的。

在其它的实施方案中，将所述微生物进行基因工程，使其在宿主细胞中表达改变水平的编码脂肪酸合酶的基因。在某些实施方案中，所述微生物表达编码脂肪酸合酶的重组基因或表达升高水平的内源性脂肪酸合酶。在可选实施方案中，所述微生物在宿主细胞中表达降低水平的编码脂肪酸合酶的基因和/或内源性脂肪酸合酶的降低的表达或活性。在一些实施方案中，所述脂肪酸合酶是硫酯酶。在具体的实施方案中，所述硫酯酶是由tesA、没有前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码的。

在其它的实施方案中，将所述微生物进行基因工程，使其表达相对于野生型微生物降低水平的脂肪酸降解酶。在一些实施方案中，所述微生物表达相对于野生型微生物降低水平的酰基辅酶A合酶。在具体的实施方案中，所述微生物表达降低水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基辅酶A合酶。在某些实施方案中，所述微生物包含一个或多个编码脂肪酸降解酶的基因(例如上述酰基辅酶A合酶基因)的敲除。

在另外的实施方案中，将所述微生物进行基因工程，使其表达降低水平的脱水酶/异构酶，例如由fabA或由图15中列出的基因编码的酶。在一些实施方案中，所述微生物包括fabA或图15中列出的基因的敲除。在其它的实施方案中，将所述微生物进行基因工程，使其表达降低水平的酮酰-ACP合酶，例如由fabB或由图16中列出的基因编码的酶。在某些实施方案中，所述微生物包括fabB或图16中列出的基因的敲除。在另外的实施方案中，将所述微生物进行基因工程，使其表达改变水平的编码脱饱和酶的基因，例如desA。

在一些实施方案中，所述微生物是细菌。在某些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。

在一些实施方案中，所述微生物是选自耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛型分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、海洋分枝杆菌以及溃疡分枝杆菌的分枝杆菌。

在其它的实施方案中，所述微生物是诺卡氏菌NRRL5646、皮疽诺卡氏菌、灰色链霉菌、砂嗜盐产孢菌或密执安棒状杆菌。

另一方面，本发明的特征在于利用本文所述的任何方法或任何微生物产生的脂肪醇或包含利用本文所述的任何方法或任何微生物产生的脂肪醇的表面活性剂。

在一些实施方案中，所述脂肪醇的δ¹³C为约-15.4或更大。在某些实施方案中，所述脂肪醇的δ¹³C为约-15.4至约-10.9、或约-13.92至约-13.84。

在一些实施方案中，所述脂肪醇的f_M ¹⁴C为至少约1.003。在某些实施方案中，所述脂肪醇的f_M ¹⁴C为至少约1.01或至少约1.5。在一些实施方案中，所述脂肪醇的f_M ¹⁴C为约1.111至约1.124。

在本文所述的任何方面中，产生的脂肪醇的产量为约25mg/L、约50mg/L、约75mg/L、约100mg/L、约125mg/L、约150mg/L、约175mg/L、约200mg/L、约225mg/L、约250mg/L、约275mg/L、约300mg/L、约325mg/L、约350mg/L、约375mg/L、约400mg/L、约425mg/L、约450mg/L、约475mg/L、约500mg/L、约525mg/L、约550mg/L、约575mg/L、约600mg/L、约625mg/L、约650mg/L、约675mg/L、约700mg/L、约725mg/L、约750mg/L、约775mg/L、约800mg/L、约825mg/L、约850mg/L、约875mg/L、约900mg/L、约925mg/L、约950mg/L、约975mg/L、约1000g/L、约1050mg/L、约1075mg/L、约1100mg/L、约1125mg/L、约1150mg/L、约1175mg/L、约1200mg/L、约1225mg/L、约1250mg/L、约1275mg/L、约1300mg/L、约1325mg/L、约1350mg/L、约1375mg/L、约1400mg/L、约1425mg/L、约1450mg/L、约1475mg/L、约1500mg/L、约1525mg/L、约1550mg/L、约1575mg/L、约1600mg/L、约1625mg/L、约1650mg/L、约1675mg/L、约1700mg/L、约1725mg/L、约1750mg/L、约1775mg/L、约1800mg/L、约1825mg/L、约1850mg/L、约1875mg/L、约1900mg/L、约1925mg/L、约1950mg/L、约1975mg/L、约2000mg/L或更多。

另一方面，本发明的特征是产生本文所述的脂肪醇的方法。所述方法包括在如本文所述的足以产生脂肪醇的条件下、在具有低水平的铁的培养基中培养本文所述的宿主细胞。在具体的实施方案中，所述培养基含有少于约500μM的铁、少于约400μM的铁、少于约300μM的铁、少于约200μM的铁、少于约150μM的铁、少于约100μM的铁、少于约90μM的铁、少于约80μM的铁、少于约70μM的铁、少于约60μM的铁、少于约50μM的铁、少于约40μM的铁、少于约30μM的铁、少于约20μM的铁、少于约10μM的铁或少于约5μM的铁。在某些实施方案中，所述培养基不含铁。

在本文所述的任何方面中，脂肪醇是在本文所述的宿主细胞或微生物中从碳源产生的。

以下提供的附图仅仅是说明性的目的，并非意图限制。

附图简要说明

图1是用各种质粒转化的重组大肠杆菌菌株产生的脂肪醇的图示。

图2是用各种质粒转化的重组大肠杆菌菌株产生的有机化合物的两个GC/MS追踪的图示。

图3是脂肪醇产生的新途径的示意图。

图4是来自MG1655野生型细胞、ΔfadD::cm细胞以及ΔfadD细胞的PCR产物的凝胶的图示。

图5A是MG1655(DE3,ΔfadD)/pETDUet-1-tesA+pHZ1.140B细胞中的脂肪醇产生的GC/MS追踪。图5B是MG16655(DE3,ΔfadD,yjgB::kan)/pETDUet-1-tesA+pHZ1.140B细胞中的脂肪醇产生的GC/MS追踪。图5C是MG16655(DE3,ΔfadD,yjgB::kan)/pDF1+pHZ1.140B细胞中的脂肪醇产生的GC/MS追踪。图5A、图5B以及图5C中的箭头表明C12:0脂肪醛的缺乏。

图6是诺卡氏菌NRRL5646car基因的核苷酸序列以及对应的氨基酸序列的列表。

图7是CAR同系物的氨基酸基序的列表。

图8是car同系物基因的核苷酸和氨基酸序列的列表。

图9中的表格鉴定了可以被表达、过表达或减弱来增加特定底物的产生的示例性基因。

图10是醇脱氢酶基因的核苷酸和氨基酸序列的列表。

图11是大肠杆菌的各种缺失突变体中的脂肪醇产生的图示。

图12是大肠杆菌的各种缺失突变体中的脂肪醇产生的图示。

图13是大肠杆菌中的饱和脂肪醇产生的GC/MS追踪。

图14A是各种Hu9培养基中的脂肪醇产生的图示。图14B是各种Hu9培养基中的脂肪醇产生的图示。

图15是fabA相关基因的核苷酸和氨基酸序列的列表。

图16是fabB相关基因的核苷酸和氨基酸序列的列表。

图17是本公开的其它核苷酸和氨基酸序列的列表。

发明详细说明

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义一样。尽管在本发明的实践或测定中可以使用与本文所述相似或等同的方法和材料，但在下文中描述了合适的方法和材料。对于本文提及的包括GenBank数据库序列在内的所有出版物、专利申请、专利以及其它参考文献，通过引用将其全部内容并入本文。在产生矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法以及实施例仅仅是说明性的而并非意图限制。

根据以下详细说明以及权利要求书，本发明的其它的特征和优势将变得清楚。

定义

在整个说明书中，可以使用缩写基因名称或多肽名称进行引用，但是应当理解，该缩写基因或多肽名称表示基因或多肽的种类。这些基因名称包括编码相同多肽和具有相同生理功能的同源多肽的所有基因。多肽名称包括具有相同活性(例如催化相同基础化学反应的活性)的所有多肽。

除非另外指明，本文引用的登录号来自美国国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth,U.S.A)所维护的NCBI数据库(国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation))。除非另作说明，提供的登录号截止到2008年10月的数据库中。

EC号由国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(NC-IUBMB))(可获取自http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)制定。本文引用的EC号来自东京大学部分资助的京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomics)所维护的KEGG配体数据库。除非另作说明，提供的EC号截止到2008年10月的数据库。

本文所用冠词“a”和“an”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。作为实例，“元件(anelement)”表示一个元件或多于一个元件。

本文所用术语“约”表示给定数值的±20％的值。因此，“约60％”表示在60±(60的20％)之间的值(即48至70)。

本文所用的术语“醇脱氢酶”(EC1.1.1.*)是能够催化脂肪醛转化成醇(例如脂肪醇)的肽。此外，本领域技术人员应当意识到，一些醇脱氢酶也能催化其它的反应。例如，一些醇脱氢酶能接受除脂肪醛之外的其它的底物。因此，这样的非特异性醇脱氢酶也被包含在这个定义中。编码醇脱氢酶的核酸序列是本领域已知的，并且公众可获知这样的醇脱氢酶。示例性的GenBank登录号提供在图9中。

本文所用的术语“减弱”表示削弱、降低或缩小。例如，可以通过修饰多肽来减弱多肽以降低其活性(例如，通过修饰编码所述多肽的核苷酸序列)。

本文所用的术语“生物柴油”表示可以作为来源于石油的柴油的替代品的生物燃料。生物柴油可以以被称为“纯(neat)”生物柴油的纯品形式或作为以任何浓度与基于石油的柴油的混合物用于内燃柴油发动机。生物柴油可以包括酯类或烃类，例如醇。

本文所用的术语“生物燃料”是指来源于生物质的任何燃料。生物燃料可以替代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括运输工具燃料(例如汽油、柴油、喷气燃料等)、燃用燃料和发电燃料。生物燃料是可再生能源。

本文所用的术语“生物质”是指碳源所来源于的任何生物材料。在一些情况下，生物质被加工成适合于生物转化的碳源。在其它的情况下，所述生物质可以不需要被进一步加工成碳源。碳源可以被转化为生物燃料。生物质的一个示例性来源是植物物质或植被。例如，玉米、甘蔗或柳枝稷可以用作生物质。生物质的另一非限制性实例是代谢废物，例如动物物质，例如牛粪。此外，生物质还可以包括藻类或其它海洋植物。生物质还包括来自工业、农业、林业和家庭的废品。可以用作生物质的这些废品的实例是发酵废渣、青贮饲料、秸秆、无用杂物、污水、垃圾、含纤维素的城市废物和剩余食物。生物质还包括例如碳水化合物(例如单糖、二糖或多糖)的碳源。

本文所用的短语“碳源”是指适于用作原核或简单真核细胞生长的碳源的底物或化合物。碳源可以是不同形式的，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽和气体(例如CO和CO₂)。这些包括，例如各种单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如木糖和阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖、麦芽糖和松二糖；纤维素材料，例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；饱和或不饱和脂肪酸酯，例如琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯；醇，例如乙醇、甲醇、丙三醇或其混合物。碳源还可以是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。优选的碳源是生物质。另一优选的碳源是葡萄糖。

如果两个序列的每个碱基都匹配(即能够形成WatsonCrick碱基对)，则其中一个核苷酸序列与另一核苷酸序列是“互补的”。术语“互补链”在本文中与术语“互补物”互换使用。核酸链的互补物可以是编码链的互补物或非编码链的互补物。

本文所用的“降低浊点的添加剂”是添加到组合物以减少或降低溶液的浊点的添加剂。

本文所用的短语“液体的浊点”表示溶解的固体不再完全可溶的温度。在该温度以下，固体开始作为第二相沉淀，给予液体浑浊的外观。在石油工业中，浊点是指这样的温度：在该温度以下，固化物质或其它重碳氢化合物在原油、提炼油或燃料中结晶从而形成浑浊的外观。固化物质的存在影响该液体的流动特性、该液体堵塞燃料过滤器、喷嘴等的倾向、固化物质在冷表面(例如管道或热交换器污垢)上的累积以及该液体与水的乳化特性。

本文所用的术语“足以允许表达的条件”表示允许宿主细胞产生诸如本文所述的多肽或脂肪醛的所需产物的任何条件。合适的条件包括，例如发酵条件。发酵条件可以包含很多参数，例如温度范围、通气水平和培养基组分。这些条件中的每一个单独地并联合地允许宿主细胞生长。示例性的培养基包括培养液或胶。通常，所述培养基包括诸如葡萄糖、果糖、纤维素等的碳源，该碳源可以直接被宿主细胞代谢。此外，培养基中可以使用酶以便于碳源的动员(例如淀粉或纤维素解聚为可发酵的糖)和随后的代谢。

为了确定条件是否足以允许表达，可以将宿主细胞进行培养例如约4、8、12、24、36或48小时。培养中和/或培养后，可以获取样品并分析样品以确定该条件是否允许表达。例如，可以测试样品中的宿主细胞或宿主细胞所生长的培养基中所需产物的存在。当测试产物的存在时，可以使用诸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS的检测。

应当理解，本文所述的多肽可以具有另外的对多肽功能没有本质影响的保守型或非必需氨基酸取代。可以按照Bowieetal.,Science(1990)247:13061310中所述确定特定取代是否会被允许(即不会不利地影响所需生物学性质，例如羧酸还原酶活性)。“保守型氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

本文所用的“控制元件”表示转录控制元件。控制元件包括启动子和增强子。术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指作为激活基因表达的开关发挥功能的DNA序列。如果基因被激活，认为其被转录或参与转录。转录涉及由基因合成mRNA。因此，启动子作为转录调节元件并且还提供基因转录为mRNA的起始位点。控制元件与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用(Maniatisetal,Science236:1237,1987)。

本文使用的术语“脂肪酸”表示具有式RCOOH的羧酸。R表示脂肪族基团，优选地表示烷基。R可以包含约4到约22个碳原子。脂肪酸可以为饱和的、单不饱和的或多不饱和的。在优选的实施方案中，所述脂肪酸由脂肪酸生物合成途径产生。

本文所用的术语“脂肪酸生物合成途径”表示产生脂肪酸的生物合成途径。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸合酶，可以按照本文所述将所述脂肪酸合酶进行基因工程来产生脂肪酸，并且在一些实施方案中脂肪酸合酶可以与其它酶一起表达来产生具有所需碳链特征的脂肪酸。

本文所用的术语“脂肪酸降解酶”表示参与脂肪酸或脂肪酸衍生物分解或转化成另一产物的酶。脂肪酸降解酶的非限制性实例是酰基辅酶A合酶。脂肪酸降解酶的另外的实例如本文所述。

本文所用的术语“脂肪酸衍生物”表示部分地产生于生产宿主生物体的脂肪酸生物合成途径的产物。“脂肪酸衍生物”还包括部分地产生于酰基-ACP或酰基-ACP衍生物的产物。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸合酶，可以按照本文所述将所述脂肪酸合酶进行基因工程来产生脂肪酸衍生物，并且在一些实施例中，脂肪酸合酶可以与其它酶一起表达以产生具有所需碳链特征的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括，例如脂肪酸、酰基辅酶A、脂肪醛、短和长链醇、烃类、脂肪醇和酯(例如蜡、脂肪酸酯或脂肪酯)。

本文所用的术语“脂肪酸衍生酶”表示在脂肪酸衍生物的产生中可以被表达或过表达的所有酶。这些酶可以是脂肪酸生物合成途径的一部分。脂肪酸衍生酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、酰基辅酶A合酶、酰基辅酶还原酶、醇脱氢酶、醇酰基转移酶、脂肪醇形成酰基辅酶还原酶、脂肪酸(羧酸)还原酶、酰基-ACP还原酶、脂肪酸羟化酶、酰基辅酶A脱饱和酶、酰基-ACP脱饱和酶、酰基辅酶A氧化酶、酰基辅酶A脱氢酶、酯合酶以及烷生物合成多肽等。脂肪酸衍生物酶可以将底物转化成脂肪酸衍生物。在一些实施例中，所述底物可以是脂肪酸衍生物，该衍生物被脂肪酸衍生酶转化为不同的脂肪酸衍生物。

本文所用的“脂肪酸酶”表示参与脂肪酸生物合成的任何酶。可以将宿主细胞中脂肪酸酶进行修饰以产生脂肪酸。脂肪酸酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶和硫酯酶。脂肪酸酶的另外的实例如本文所述。

本文所用的“脂肪酸合酶”表示参与脂肪酸生物合成的任何酶。可以将宿主细胞中的脂肪酸合酶表达或过表达以产生脂肪酸。脂肪酸合成酶的非限制性实例是硫酯酶。脂肪酸合成酶的另外的实例如本文所述。

本文所用的“脂肪醛”表示具有式RCHO的的醛，其特征为具有不饱和羰基(C＝O)。在优选的实施方案中，脂肪醛是从脂肪酸或脂肪酸衍生物得到的任何醛。在一个实施方案中，所述R基的长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳。

R可以是直链或支链。所述支链可以具有一个或多个分支点。此外，所述支链可以包括环状分支。

此外，R可以是饱和的或不饱和的。如果是不饱和的，则所述R可以具有一个或多个不饱和点。

在一个实施方案中，所述脂肪醛通过生物合成产生。

脂肪醛具有许多用途。例如，脂肪醛可以用于生产许多特种化学品。例如，脂肪醛用于生产聚合物、树脂、染料、调味料、增塑剂、香水、药物以及其它的化学品。一些脂肪醛被用作溶剂、防腐剂或消毒剂。一些天然的和合成的化合物是醛类，例如维生素和激素。

术语“脂肪醛生物合成多肽”、“羧酸还原酶”以及“CAR”在本文可交换地使用。

本文所用的“脂肪醇”表示具有式ROH的醇。在优选的实施方案中，所述脂肪醇是从脂肪酸或脂肪酸衍生物得到的任何醇。在一个实施方案中，所述R基的长度为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳。

在一个实施方案中，所述脂肪醇通过生物合成产生。

脂肪醇具有许多用途。例如，脂肪醇可以用于生产许多特种化学品。例如，脂肪醇被用作生物燃料；作为脂肪、蜡、胶、树脂的溶剂；用在药物软膏、润滑剂和洗剂中；作为润滑油添加剂；用在去垢剂和乳化剂中；作为织物防静电和整理剂；作为增塑剂；作为非离子表面活性剂；以及例如作为增稠剂用于美容用品中。

本文所用的“现代碳比例(fractionofmoderncarbon)”或“f_M”与分别由称为草酸标准HOxI和HOxII的国家标准技术研究院(NationalInstituteofStandardsandTechnology(NIST))标准参考物(SRM)4990B和4990C所定义的具有相同意义。基本定义涉及0.95倍的¹⁴C/¹²C同位素比例HOxI(参考AD1950)。这粗略地等于衰变校正的工业革命前树木(decay-correctedpre-IndustrialRevolutionwood)。对于现今有生命生物圈(植物物质)而言，f_M为约1.1。

本文所用的“基因敲除”是指这样的操作：通过该操作，编码靶蛋白的基因被修饰或失活从而降低或消除完整蛋白的功能。可以通过一般方法来进行基因的失活，例如通过UV照射或用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍的诱变、位点定向诱变、同源重组、插入-缺失诱变或“红色驱动整合(Red-drivenintegration)”(Datsenkoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-45,2000)。例如，在一个实施方案中，将构建体引入宿主细胞中，使得能够选择所述宿主细胞中的同源重组事件。本领域技术人员可以容易地设计敲除构建体，所述敲除构建体包括用于有效选择经历与所述构建体的同源重组事件的转染细胞的阳性和阴性选择基因。例如，通过单交叉重组或双交叉重组，用含有改变的DNA序列替换野生型DNA序列可以获得所述宿主细胞中的改变。为了便于转化体的选择，所述改变可以是，例如编码抗生素抗性标记的DNA序列或弥补了所述宿主细胞可能的营养缺陷型的基因。突变包括但不限于缺失-插入突变。此类改变的实例包括基因扰乱，即基因干扰，使得从该基因正常产生的产物不能以功能形式产生的。这可以归因于完全缺失、选择标记的缺失和插入、选择标记的插入、移码突变、框内缺失或导致过早终止的点突变。在一些情况下，所述基因的全部mRNA是不存在的。在其它的情形下，所产生的mRNA的量是变化的。

可以按照以下计算两个序列之间的“同源性”。序列以最佳比较目的进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入空位用于最佳比对，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。在优选的实施方案中，为比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少约30％、优选地至少约40％、更优选地至少约50％、更优选地至少约60％并且更优选地至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。然后比较位于对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“一致性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的一致性百分比是序列所共享的相同位置数的函数，这考虑到空位数和每个空位的长度，为了两个序列的最佳比对需要引入空位。

可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同源性百分比的测定。在优选的实施方案中，使用以下测定两个氨基酸序列之间的同源性百分比：NeedlemanandWunsch(1970)、J.Mol.Biol.48:444453的算法，该算法被并入GCG软件包中的GAP程序中，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一优选的实施方案中，使用以下测定两个核苷酸序列之间的同源性百分比：GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的参数组(和如果操作者不确定应当应用哪些参数确定分子是否在要求的同源性限制内而应该使用的参数组)是具有12的空位罚分、4的空位延伸罚分和5的移码空位罚分的Blossum62评分矩阵。

本文所用的“宿主细胞”是用于产生本文所述的产物(例如本文所述的脂肪醇)的细胞。可以修饰宿主细胞，使其表达或过表达所选择的基因或具有所选择的基因的减弱的表达。宿主细胞的非限制性实例包括植物、动物、人、细菌、酵母或丝状真菌细胞。

本文所用的术语“在低严紧性、中等严紧性、高严紧性或极高严紧性条件下杂交”描述杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可以见于CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物学实验技术),JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。该参考资料中描述了水性和非水性方法并且可以使用任一方法。本文涉及的具体杂交条件如下：1)低严紧性杂交条件在约45℃下、在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，然后是在至少50℃下、在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严紧性条件，洗涤温度可以升至55℃)；2)中等严紧性杂交条件在约45℃下、在6×SSC中，然后是在60℃下、0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严紧性杂交条件在约45℃下、6×SSC中，然后是在65℃下、在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及优选地4)极高严紧性杂交条件为65℃下、0.5M磷酸钠、7％SDS中，然后是在65℃下、在0.2×SSC、1％SDS中洗涤一次或多次。除非另作规定，极高严紧性条件(4)是优选的条件。

本文中涉及诸如DNA或RNA的核酸时，所用的术语“分离的”是指分别从所述核酸的天然来源中存在的其他DNA或RNA分离的分子。此外，“分离的核酸”包括核酸片段，所述片段不是作为片段天然存在的并且不会见于天然状态。本文所用的术语“分离的”还指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且包括纯化的多肽和重组多肽两者。当核酸或多肽是通过重组DNA技术产生时，本文使用的术语“分离的”还指基本上游离于细胞物质、病毒物质或培养基的核酸或多肽。当核酸或多肽是化学合成时，本文所用的术语“分离的”还指基本上游离于化学前体或其他化学品的核酸或多肽。当涉及诸如脂肪醇的产物时，本文所用的术语“分离的”是指从细胞组分、细胞培养基或化学前体或合成前体分离的产物。

本文所用的“细胞中基因的表达水平”是指由所述细胞中的基因编码的mRNA、前体mRNA新生转录物、转录加工中间体、成熟mRNA和降解产物的水平。

本文所用的术语“微生物”表示来自古菌域、细菌域和真核域的原核和真核微生物种类，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物。术语“微生物细胞”(即来自微生物的细胞)和“微生物”可交换地使用，并且是指必须借助显微镜才能观察到的细胞或小生物。

本文所用的术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)以及适当情况下，指核糖核酸(RNA)。该术语还应当被理解为等同地包括产生自核苷酸类似物的RNA或DNA的类似物，以及适用于所描述的实施方案的单链(有义或反义)和双链多核苷酸、EST、染色体、cDNA、mRNA和rRNA。

本文所用的术语“可操作地连接”表示所选择的核苷酸序列(例如编码本文所述的多肽)与启动子接近，从而允许所述启动子调节该选择的DNA的表达。此外，按照转录和翻译的方向，启动子位于所述选择的核苷酸序列的上游。“可操作地连接”表示将核苷酸序列和调节序列连接，以便当合适的分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时允许基因表达。

本文所用术语“或”表示术语“和/或”并且与术语“和/或”可交换地使用，除非上下文明确表示并非如此。

本文所用的“过表达”表示在细胞中以高于对应野生型细胞中正常表达浓度的浓度表达或被导致表达核酸、多肽或烃类。例如，当在重组宿主细胞中多肽存在的浓度比其在相同物种的非重组宿主细胞中的浓度更高时，所述多肽在所述重组宿主细胞中可以是“过表达”的。

本文所用的“分配系数”或“P”定义为化合物在有机相中的平衡浓度除以在水相中(例如发酵液)平衡时的浓度。在本文所述的两相系统的一个实施方案中，在生产过程中所述有机相是由脂肪醛形成的。但是，在一些实施例中，可以例如通过提供辛烷层来提供有机相以便于产物分离。当描述两相系统时，化合物的分配特性可以描述为logP。例如，logP为1的化合物会10:1分配到有机相。logP为-1的化合物会1:10分配到有机相。通过选择合适的发酵液和有机相，在发酵容器中具有高logP值的脂肪醛可以离到有机相中，即使处于很低的浓度。

本文所用的术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”表示通过例如分离或隔离从分子的环境中移出或分离所述分子。“基本上纯化的”分子为至少约60％、优选地至少约75％以及更优选地至少约90％游离于与其相关的其他组分。本文所用的这些术语还指从样品中去除污染物。例如，污染物的去除可以导致样品中脂肪醇的百分比增加。例如，当在宿主细胞中产生脂肪醇时，可以通过去除宿主细胞蛋白纯化脂肪醇。纯化后，样品中脂肪醇的百分比增加。

术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”不需要绝对纯。它们是相对的术语。因此，例如当在宿主细胞中产生脂肪醇时，纯化的脂肪醇是基本与其他细胞组分(例如核酸、多肽、脂质、碳水化合物或其他碳氢化合物)分离的脂肪醇。在另一实例中，纯化的脂肪醇制剂是这样的：在该制剂中，所述脂肪醇基本不含污染物，例如发酵后可能存在的那些污染物。在一些实施方案中，当样品重量的至少约50％是由脂肪醇组成时，所述脂肪醇是纯化的。在其他实施方案中，当样品重量的至少约60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多是由脂肪醇组成时，所述脂肪醇是纯化的。

本文使用的术语“重组多肽”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常将编码所表达的蛋白或RNA的DNA插入合适的表达载体，并且所述表达载体接下来用于转化宿主细胞以产生多肽或RNA。

本文所用的术语“基本相同”(或“基本同源”)是用于指第一氨基酸或核苷酸序列含有足够数量的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同的(例如具有相似侧链，例如保守型氨基酸取代)氨基酸残基或核苷酸，使得所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。

本文所用的术语“合酶”表示催化合成过程的酶。本文所用的术语合酶包括合酶、合成酶和连接酶。

本文所用的术语“转染”表示将核酸通过核酸介导的基因转移而引入(例如通过表达载体)到接受体细胞。

本文所用的“转化”是指这样的过程，在该过程中，细胞的基因型由于细胞摄入外源DNA或RNA而改变。这可以导致表达重组形式的RNA或多肽的转化的细胞。在由转移的基因反义表达的情况下，天然存在形式的多肽的表达被干扰。

本文所用的“转运蛋白”是便于一种或多种化合物移入和/或移出细胞器和/或细胞的多肽。

本文所用的多肽X的“变体”是指具有改变了一个或多个氨基酸残基的多肽X的氨基酸序列的多肽。所述变体可以具有保守型改变或非保守型改变。使用本领域公知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR)，可以确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不影响生物活性。

在用于多核苷酸序列的情况下，术语“变体”可以包括与基因或其编码序列的多核苷酸序列相关的多核苷酸序列。该定义还可以包括，例如“等位基因”变体、“剪接”变体、“物种”变体或“多态性”变体。剪接变体可以与参考多核苷酸具有显著的一致性，但是由于在mRNA加工中的外显子备选剪接而通常会具有更多或更少的多核苷酸数。对应的多肽可以具有另外的功能结构域或结构域缺失。物种变体是在物种之间彼此不同的多核苷酸序列。得到的多肽通常会具有相对于彼此的显著的氨基酸一致性。多态性变体是在给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列中的变异。

本文所用的术语“载体”是指能够转运另一核酸的核酸分子，所述核酸分子连接到所述另一核酸。一种有用的载体是附加体(即能够进行染色体外复制的核酸)。有用的载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体在本文被称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中，有用的表达载体通常是“质粒”的形式，所述“质粒”通常是指在其载体形式时不与染色体结合的环状双链DNA环。在本说明书中，因为质粒是最通常使用的载体形式，所以“质粒”和“载体”是可交换地使用的。但是，还包括发挥等同功能并随后至今成为本领域已知的表达载体的其他形式。

本发明至少部分地基于大肠杆菌中脂肪醇生物合成的新途径的发现，所述大肠杆菌部分地利用编码脂肪醛生物合成多肽的基因。可以通过图3中描述的生物合成途径来产生脂肪醇。在这个途径中，首先用ATP活化脂肪酸进而用羧酸还原酶(CAR)样酶进行还原从而产生脂肪醛。然后，可以用诸如alrAadp1或yjgB的醇脱氢酶将所述脂肪醛进一步还原成脂肪醇。如本文所证实，yjgB可以是假定的醇脱氢酶，其底物包括脂肪醛，例如碳链长度为C₁₀至C₁₈的脂肪醛。

脂肪醛生物合成基因、脂肪醇生物合成基因以及变体

本文所述的方法可以用来产生脂肪醇，例如从脂肪醛产生脂肪醇。在一些情形下，通过表达具有图6和图8中所列出的核苷酸序列及其多核苷酸变体的脂肪醛生物合成基因来产生脂肪醛，所述脂肪醛生物合成基因例如羧酸还原酶基因(car基因)。在一些情形下，所述脂肪醛生物合成基因编码一种或多种图7中所描述的氨基酸基序。例如，所述基因可以编码包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9以及SEQIDNO:10；SEQIDNO:11；SEQIDNO:12；SEQIDNO:13；SEQIDNO:14；和/或SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10以及SEQIDNO:11的多肽。SEQIDNO:7包含还原酶结构域；SEQIDNO:8和SEQIDNO:14包含NADP结合结构域；SEQIDNO:9包含磷酸泛酰巯基乙胺连接位点；并且SEQIDNO:10包含AMP结合结构域。

在其它的情形下，通过表达例如具有图10中所列出的核苷酸序列或其变体的脂肪醇生物合成基因来产生脂肪醇。

变体可以是天然存在的或体外创造的。具体而言，可以使用基因工程技术来创造这样的变体，例如位点定向诱变、随机化学诱变、核酸外切酶III缺失步骤或标准克隆技术。或者，可以使用化学合成或修饰步骤来创造这样的变体、片段、类似物或衍生物。

制备变体的方法在本领域是共知的。这些方法包括这样的步骤，其中，将从天然分离物获得的核酸序列进行修饰从而产生编码多肽的核酸，所述多肽具有提高它们在工业或实验室应用中的价值的特性。在这样的步骤中，产生并且表征了大量的相对于从天然分离物获得的序列具有一个或多个核苷酸差异的变体序列。通常，这些核苷酸差异导致了相对于由来自天然分离物的核酸所编码的多肽的氨基酸改变。

例如，可以使用易错PCR(参见，例如Leungetal.,Technique1:11-15,1989；和Caldwelletal.,PCRMethodsApplic.2:28-33,1992)产生变体。在易错PCR中，在DNA聚合酶的复制保真度低的条件下进行PCR，使得沿着PCR产物的整个长度获得了高效点突变。简单地说，在这些操作中，将待诱变的核酸(例如脂肪醛生物合成多核苷酸序列)与PCR引物、反应缓冲液、MgCl₂、MnCl₂、Taq聚合酶和适当浓度的dNTP混合，以实现沿着PCR产物的整个长度的高效点突变。例如，可以使用20fmole的待诱变的核酸(例如脂肪醛生物合成多核苷酸序列)、30pmole的每种PCR引物、包含50mMKCl、10mMTrisHCl(pH8.3)和0.01％明胶的反应缓冲液、7mMMgCl₂、0.5mMMnCl₂、5单位的Taq聚合酶、0.2mMdGTP、0.2mMdATP、1mMdCTP和1mMdTTP进行反应。PCR可以进行30个以下循环：94℃持续1分钟、45℃持续1分钟和72℃持续1分钟。但是，应当理解，这些参数可以视情况变化。然后，将诱变后的核酸克隆到合适的载体中并且评价所述诱变后的核酸编码的多肽的活性。

还可以使用寡核苷酸定向诱变在任何目的克隆DNA中产生位点特异性突变来产生变体。寡核苷酸诱变描述于，例如Reidhaar-Olsonetal.,Science241:53-57,1988。简单地说，在这些操作中，合成大量带有一个或多个待被引入克隆DNA中的突变的双链寡核苷酸，并且将其插入待诱变的克隆DNA(例如脂肪醛生物合成多核苷酸序列)。回收含有诱变后的DNA的克隆，并且评价其编码的多肽的活性。

产生变体的另一方法是组合PCR(assemblyPCR)。组合PCR涉及来自小DNA片段混合物的PCR产物的组合。大量的不同PCR反应在相同小管中平行发生，其中一个反应的产物作为另一反应的产物的引物。组合PCR描述于例如美国专利第5,965,408号。

生成变体的又一方法是有性PCR诱变。在有性PCR诱变中，由于基于序列同源性的DNA分子的随机片段化，在具有不同但高度相关的DNA序列的DNA分子之间体外发生了被迫的同源重组。然后是通过PCR反应中的引物延伸固定交换。有性PCR诱变描述于例如Stemmer,PNAS,USA91:10747-10751,1994。

还可以通过体内诱变产生变体。在一些实施方案中，通过在携带一个或多个DNA修复途径中的突变的例如大肠杆菌菌株的细菌菌株中扩增所述序列来生成核酸序列中的随机突变。这些“致突变(mutator)”菌株具有比野生型菌株更高的随机突变率。在这些菌株的一个菌株中扩增DNA序列(例如脂肪醛生物合成多核苷酸序列)会最终在所述DNA中产生随机突变。适用于体内诱变的致突变菌株描述于例如PCT公布第WO91/16427号。

还可以使用盒诱变产生变体。在盒诱变中，双链DNA分子的小的区被不同于天然序列的合成的寡核苷酸“盒”替换。该寡核苷酸经常含有完全和/或部分随机化的天然序列。

回归整体诱变(Recursiveensemblemutagenesis)也可以用于产生变体。回归整体诱变是开发用于产生表型相关的突变体的多样性群体的蛋白工程(即蛋白诱变)的算法，所述群体成员的氨基酸序列是不同的。该方法使用反馈机制来控制连续轮的组合盒诱变。回归整体诱变描述于例如Arkinetal.,PNAS,USA89:7811-7815,1992。

在一些实施方案中，使用指数整体诱变(exponentialensemblemutagenesis)产生变体。指数整体诱变是产生具有高百分比的独特并且有功能的变体的组合文库的过程，其中小组残基被平行随机化以鉴定每个改变的位置上导致功能性蛋白的氨基酸。指数整体诱变描述于例如Delegraveetal.,Biotech.Res.11:1548-1552,1993。随机诱变和位点定向诱变描述于例如Arnold,Curr.Opin.Biotech.4:450-455,1993。

在一些实施方案中，按照例如美国专利第5,965,408号和第5,939,250号中所述，使用改组操作产生变体，其中许多编码不同多肽的核酸中的一部分融合在一起来产生编码嵌合多肽的嵌合核酸序列。

多核苷酸变体还包括核酸类似物。可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链修饰核酸类似物以改善例如核酸的稳定性、杂交或溶解性。碱基部分的修饰包括将脱氧胸苷修饰为脱氧尿苷和将脱氧胞苷修饰为5-甲基-2'-脱氧胞苷或5-溴-2'-脱氧胞苷。糖部分的修饰包括修饰核糖糖的2'羟基以形成2'-O-甲基糖或2'-O-烯丙基糖。可以修饰脱氧核糖磷酸主链以产生吗啉核酸，其中每个碱基部分连接到六元吗啉环，或产生肽核酸，其中脱氧磷酸主链被假肽主链代替并保留4种碱基(参见，例如Summertonetal.,AntisenseNucleicAcidDrugDev.(1997)7:187-195；和Hyrupetal.,Bioorgan.Med.Chem.(1996)4:5-23.)。此外，脱氧磷酸主链可以被例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、亚磷酰胺、或烷基磷酸三酯主链所代替。

编码图6和图8中列出的同系物的任何多核苷酸序列或其变体可以在本文所述的方法中用作脂肪醛生物合成多核苷酸。图10中列出的任何多核苷酸序列或其变体可以在本文所述的方法中用作脂肪醇生物合成多核苷酸。

脂肪醛生物合成多肽、脂肪醇生物合成多肽以及变体

本文所述的方法还可以用来产生脂肪醇，例如从脂肪醛产生脂肪醇。在一些情形下，由具有图6和图8中所列出的氨基酸序列及其多肽变体的脂肪醛生物合成多肽产生脂肪醛。在一些情形下，脂肪醛生物合成多肽包括一种或多种图7中描述的氨基酸基序。例如，所述多肽可以包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9以及SEQIDNO:10的氨基酸序列。在其它的情形下，所述多肽包含SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13以及SEQIDNO:14中的一种或多种。在另外的情形下，所述多肽包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10以及SEQIDNO:11的氨基酸序列。SEQIDNO:7包含还原酶结构域；SEQIDNO:8和SEQIDNO:14包含NADP结合结构域；SEQIDNO:9包含磷酸泛酰巯基乙胺连接位点；并且SEQIDNO:10包含AMP结合结构域。

在其它的情形下，使用具有图10中所列出的氨基酸序列及其多肽变体的脂肪醇生物合成多肽，可以将本文所述的方法用来产生脂肪醇。

生物合成多肽变体可以是其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)所取代的变体。这些取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码所编码的残基。

保守型取代为由具有相似性质的另一氨基酸取代多肽中给定氨基酸的那些取代。典型的保守型取代是以下替换：诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的脂肪族氨基酸被另一脂肪族氨基酸替换；丝氨酸被苏氨酸替换，或反之亦然；诸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基被另一酸性残基替换；诸如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺基的残基被另一携带酰胺基的残基替换；诸如赖氨酸和精氨酸的碱性残基与另一碱性残基交换；以及诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基被另一芳香族残基替换。

其他多肽变体是其中一个或多个氨基酸残基包含取代基的那些变体。另外的多肽变体是其中所述多肽与另一化合物相联的那些变体，所述化合物例如增加多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。

另外的多肽变体是其中另外的氨基酸被融合到所述多肽的那些变体，所述另外的氨基酸例如前导序列、分泌序列、前蛋白序列或便于所述多肽的纯化、富集或稳定的序列。

在一些情形下，所述多肽变体保留了与具有图6和图8中所列出的氨基酸序列的多肽相同的生物学功能(例如保留了脂肪醛生物合成活性，例如羧酸或脂肪酸还原酶活性)或保留了与具有图10中列出的氨基酸序列的多肽相同的生物学功能(例如保留了脂肪醇生物合成活性，例如脂肪醇脱氢酶活性)，并且所述多肽变体具有与具有图6和图8或图10中所列出的氨基酸序列的多肽基本相同的氨基酸序列。

在其它的情形下，所述多肽变体与图6、8和/或10中列出的氨基酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或大于约95％的同源性。在另一个实施方案中，所述多肽变体包含片段，所述片段包含它的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续的氨基酸。

所述多肽变体或其片段可以通过使用本文所述的技术分离编码它们的核酸或通过表达编码它们的合成核酸而获得。或者，可以通过生物化学富集或纯化步骤获得多肽变体或其片段。可以通过蛋白水解消化、凝胶电泳和/或微测序来确定多肽变体或片段的序列。然后，可以使用本文所述的任何程序，将多肽变体或片段的序列与图6、8和/或10中列出的氨基酸序列进行比较。

可以使用常规的方法对多肽变体及其片段的脂肪醛产生活性和/或脂肪醇产生活性进行测定。例如，可以在允许所述多肽变体发挥功能的条件下，使多肽变体或片段与底物(例如脂肪酸、脂肪酸衍生物底物或本文所述的其它底物)进行接触。可以测量所述底物水平的下降或脂肪醛水平的增加来确定脂肪醛产生活性。可以测量所述底物水平的下降或脂肪醇水平的增加来确定脂肪醇产生活性。

生物合成多肽的抗体

本文所述的脂肪醛生物合成多肽还可以用来产生针对脂肪醛生物合成多肽的抗体。这样的抗体可以用于，例如使用本领域已知的方法检测脂肪醛生物合成多肽或脂肪醇生物合成多肽的表达。所述抗体可以是，例如多克隆抗体；单克隆抗体或其抗原结合片段；修饰后抗体，例如嵌合抗体、重构抗体、人源化抗体或以上的片段(例如Fab'、Fab、F(ab')₂)；或生物合成抗体，例如单链抗体、单结构域抗体(DAB)、Fv、单链Fv(scFv)等。

制造和使用多克隆和单克隆抗体的方法描述于，例如Harlowetal.,UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolI(抗体的使用：实验室指南：操作手册I).ColdSpringHarborLaboratory(1998年12月1日)。制造修饰的抗体和抗体片段(例如嵌合抗体、重构抗体、人源化抗体或以上的片段，所述片段例如Fab'、Fab、F(ab')₂片段)或生物合成抗体(例如单链抗体、单结构域抗体(DAB)、Fv、单链Fv(scFv)等)的方法是本领域已知的并且可以见于，例如Zola,MonoclonalAntibodies:Preparationand UseofMonoclonalAntibodiesandEngineeredAntibodyDerivatives(单克隆抗体：单克隆抗体和工程化抗体衍生物的制备和使用),施普林格(SpringerVerlag)(2000年12月15日；第一版)。

底物

本文所述的组合物和方法可以用来产生脂肪醇，例如从脂肪醛产生脂肪醇，所述脂肪醛本身可以从合适的底物产生。尽管不希望受限于理论，但认为本文所述的脂肪醛生物合成多肽通过还原机制从底物产生脂肪醛。在一些情形下，所述底物是脂肪酸衍生物(例如脂肪酸)，并且具有特定的分支模式和碳链长度的脂肪醛可以从具有会得到特定脂肪醛的那些特征的脂肪酸衍生物产生。通过另外的反应机制，脂肪醛可以被转化成所希望的脂肪醇(例如通过本文所述的脂肪醇生物合成多肽)。

因此，可以将导致脂肪酸衍生物底物产生的生物合成途径中的每一步骤进行修改以产生或过量产生目的底物。例如，可以在宿主细胞中表达、过表达或减弱参与脂肪酸生物合成途径或脂肪醛途径的已知基因以产生所希望的底物(参见例如PCT/US08/058788)。示例性的基因提供在图9中。

底物的合成

脂肪酸合酶(FAS)是催化酰基链的起始和延长的一组多肽(Marrakchietal.,BiochemicalSociety,30:1050-1055,2002)。酰基载体蛋白(ACP)连同FAS途径中的酶控制所产生的脂肪酸衍生物的长度、饱和度以及分支情况。脂肪酸生物合成途径涉及前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。这个途径中的步骤是由脂肪酸生物合成的酶类(fab)和乙酰辅酶A羧化酶(acc)基因家族催化的(参见例如Heathetal.,Prog.LipidRes.40(6):467-97(2001))。

可以通过重组表达或过表达一种或多种脂肪酸合酶基因，例如乙酰辅酶A和/或丙二酰辅酶A合酶基因，将宿主细胞进行基因工程，使其表达脂肪酸衍生物底物。例如，为了增加乙酰辅酶A产生，可以在宿主细胞中表达一个或多个以下基因：pdh(包含aceEF(编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)和lpd的多酶复合物)、panK、fabH、fabB、fabD、fabG、acpP和fabF。这些基因的示例性GenBank登录号为：pdh(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK(也称为辅酶A、AAC76952)、aceEF(AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabB(P0A953)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。此外，可以通过用含有相应基因的无效或缺失突变的条件复制或非复制质粒进行转化或通过取代启动子或增强子序列，在工程化的宿主细胞中减弱或敲除fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB的表达水平。这些基因的示例性GenBank登录号为：fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。得到的宿主细胞当在合适的环境中生长时，会具有增加的乙酰辅酶A产生水平。

可以通过将accABCD(例如登录号AAC73296、EC6.4.1.2)引入宿主细胞来实现丙二酰辅酶A过表达。可以通过将编码脂肪酶(例如，登录号CAA89087、CAA98876)的DNA序列引入宿主细胞，在宿主细胞中进一步过表达脂肪酸。

此外，抑制PlsB可以导致长链酰基ACP水平的增加，这会抑制途径中的早期步骤(例如，accABCD、fabH和fabI)。plsB(例如，登录号AAC77011)D311E突变可以用于增加可用脂肪酸的量。

此外，可以将宿主细胞进行基因工程，使其过表达sfa基因(fabA的抑制基因，例如，登录号AAN79592)，从而增加单不饱和脂肪酸的产生(Rocketal.,J.Bacteriology178:5382-5387,1996)。

可以通过修饰所选择的硫酯酶的表达来选择脂肪酸衍生物底物的链长度。硫酯酶影响所产生的脂肪酸的链长度。因此，可以将宿主细胞进行工程化，使其表达、过表达、减弱表达、或不表达一种或多种所选择的硫酯酶，从而增加优选的脂肪酸衍生物底物的产生。例如，可以通过表达具有产生C₁₀脂肪酸偏好的硫酯酶并且减弱具有产生除C₁₀脂肪酸外的脂肪酸偏好的硫酯酶(例如，偏好产生C₁₄脂肪酸的硫酯酶)来产生C₁₀脂肪酸。这将导致碳链长度为10的脂肪酸的相对同种的群体。在其他的情形下，可以通过减弱产生非C₁₄脂肪酸的内源性硫酯酶并且表达利用C₁₄-ACP的硫酯酶来产生C₁₄脂肪酸。在一些情形下，可以通过表达利用C₁₂-ACP的硫酯酶并且减弱产生非C₁₂脂肪酸的硫酯酶来产生C₁₂脂肪酸。可以使用本领域已知的方法来核实乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、以及脂肪酸的过量产生，例如通过在细胞溶解后使用放射性前体、HPLC或GC-MS。在本文所述方法中可以使用的硫酯酶的非限制性实例列于表1中。

表1：硫酯酶

*Mayeretal.,BMCPlantBiology7:1-11,2007

在其它的情形中，在宿主细胞中表达脂肪醛生物合成多肽、其变体或片段，所述宿主细胞包含天然存在的突变，所述突变导致所述宿主细胞中脂肪酸的水平增加。在一些实例中，将所述宿主细胞进行基因工程，从而使所述宿主细胞中脂肪酸的水平相对于对应的野生型宿主细胞增加。例如，可以将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于对应的野生型宿主细胞降低水平的酰基辅酶A合酶。在一个实施方案中，通过基因工程“敲除”宿主细胞来降低一个或多个基因(例如酰基辅酶A合酶基因)的表达水平。

可以降低或敲除宿主细胞中任何已知的酰基辅酶A合酶基因。酰基辅酶A合酶基因的非限制性实例包括：fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因。酰基辅酶A合酶基因的具体实例包括：来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv的fadDD35[NP_217021]、来自结核分枝杆菌H37Rv的fadDD22[NP_217464]、来自大肠杆菌的fadD[NP_416319]、来自大肠杆菌的fadK[YP_416216]、来自不动杆菌(Acinetobacter)ADP1的fadD[YP_045024]、来自流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)RdkW20的fadD[NP_438551]、来自沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)BisB18的fadD[YP_533919]、来自耐碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)C-125[NP_243969]的BH3101、来自荧光假单胞菌Pfo-1的Pfl-4354[YP_350082]、来自睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosterone)KF-1的EAV15023[ZP_01520072]、来自枯草芽孢杆菌的yhfL[NP_388908]、来自绿脓杆菌(P.aeruginosa)PAO1的fadD1[NP_251989]、来自茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)GM11000的fadD1[NP_520978]、来自绿脓杆菌PAO1的fadD2[NP_251990]、编码来自嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)R551-3的蛋白ZP_01644857的基因、来自酿酒酵母的faa3p[NP_012257]、来自酿酒酵母的faa1p[NP_014962]、来自枯草芽孢杆菌的lcfA[CAA99571]或描述于Shockeyetal.,Plant.Physiol.129:1710-1722,2002；Cavigliaetal.,J.Biol.Chem.279:1163-1169,2004；Knolletal.,J.Biol.Chem.269(23):16348-56,1994；Johnsonetal.,J.Biol.Chem.269:18037-18046,1994；以及Blacketal.,J.BiolChem.267:25513-25520,1992中的那些基因。

分支脂肪醇的形成

通过使用分支脂肪酸衍生物作为本文所述的脂肪醛生物合成多肽的底物，可以从包含分支点的脂肪醛产生脂肪醇。例如，虽然大肠杆菌天然产生直链脂肪酸(sFA)，但是可以通过在大肠杆菌中引入并且表达或过表达提供分支前体的基因(例如bkd、ilv、icm和fab基因家族)来将大肠杆菌进行基因工程，使其产生支链脂肪酸(brFA)。此外，可以将宿主细胞进行基因工程，使其表达或过表达编码用于brFA的延长的蛋白的基因(例如ACP、FabF等)，和/或使其缺失或减弱通常导致sFA的对应宿主细胞基因。

形成brFA的第一步骤是利用支链氨基酸氨基转移酶产生对应的α-酮酸。宿主细胞可以内源性地包含编码这些酶的基因，或可以重组引入这些基因。例如，大肠杆菌内源性地表达此酶I1vE(EC2.6.1.42；GenBank登录号YP_026247)。在一些宿主细胞中，可能不表达异源支链氨基酸氨基转移酶。但是，对于大肠杆菌I1vE或任何其他支链氨基酸氨基转移酶(例如，来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的I1vE(GenBank登录号AAF34406)、来自恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的I1vE(GenBank登录号NP_745648)或来自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)的I1vE(GenBank登录号NP629657))，如果不是内源性的，可以将它们引入。

在另一个实施方案中，可以通过使用Atsumietal.,Nature451:86-89,2008中所描述的方法实现α-酮酸的产生。例如，可以通过过表达编码IlvI、IlvH、IlvC或IlvD的基因来产生2-酮异戊酸酯。在另一个实例中，可以通过过表达编码IlvA和IlvI、IlvH(或枯草芽孢杆菌的AlsS)、IlvC、IlvD或它们的对应同系物的基因来产生2-酮-3-甲基-戊酸酯。在其它实施方案中，可以通过过表达编码IlvI、IlvH、IlvC、IlvD和LeuA、LeuB、LeuC、LeuD或它们的对应同系物的基因来产生2-酮-4-甲基-戊酸酯。

第二步骤是将α-酮酸氧化脱羧为对应的支链酰基CoA。该反应可以由支链α-酮酸脱氢酶复合物(bkd；EC1.2.4.4.)(Denoyaetal.,J.Bacteriol.177:3504,1995)催化，该复合物由E1α/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酸转酰酶)和E3(二氢硫辛酸脱氢酶)亚基组成。这些支链α-酮酸脱氢酶复合物与丙酮酸和α-酮戊二酸脱氢酶复合物相似。具有brFA和/或生长在支链氨基酸上的任何微生物可以用作分离用于在例如大肠杆菌的宿主细胞中表达的bkd基因的来源。此外，大肠杆菌具有E3组分作为其丙酮酸脱氢酶复合物的一部分(lpd、EC1.8.1.4、GenBank登录号NP_414658)。因此，仅表达E1a/β和E2bkd基因就足够了。表2列出了来自几种微生物的、可以在宿主细胞中重组引入并表达以提供支链酰基CoA前体的bkd基因的非限制性实例。

表2：来自所选择的微生物的Bkd基因

在另一个实例中，可以通过在宿主细胞中(例如在大肠杆菌中)共表达丁烯酰辅酶A还原酶(Ccr,EC1.6.5.5,1.1.1.1)与异丁酰基辅酶A变位酶(大亚基IcmA，EC5.4.99.2；小亚基IcmB，EC5.4.99.2)来产生异丁酰辅酶A(HanandReynolds,J.Bacteriol.179:5157,1997)。丁烯酰辅酶A是大肠杆菌和其它的微生物中脂肪酸生物合成中的中间体。表3中列出了来自所选择的微生物的ccr和icm基因的非限制性实例。

表3：来自所选择的微生物的ccr和icm基因

除bkd基因的表达外，brFA生物合成的起始利用对支链酰基辅酶A具有特异性的β-酮酰-酰基-载体蛋白合酶III(FabH、EC2.3.1.41)(Lietal.,J.Bacteriol.187:3795-3799,2005)。这些FabH酶的非限制性实例在表4中列出。可以在宿主细胞中表达参与任何含有brFA的微生物的脂肪酸生物合成的fabH基因。来自不天然产生brFA的宿主细胞的Bkd和FabH酶可能不支持brFA产生。因此，可以重组表达bkd和fabH。可以将含有bkd和fabH基因的载体插入这样的宿主细胞中。同样，Bkd和FabH的内源性产生水平可能不足以产生brFA。这种情况下，可以将它们过表达。此外，可以表达或过表达脂肪酸生物合成途径的其他组分，例如酰基载体蛋白(ACP)和β-酮酰-酰基-载体蛋白合酶II(fabF、EC2.3.1.41)(候选者的非限制性实例在表4中列出)。除表达这些基因外，可以减弱宿主细胞中内源性脂肪酸生物合成途径中的一些基因(例如，大肠杆菌基因fabH(GenBank登录号NP_415609)和/或fabF(GenBank登录号NP_415613))。

表4：来自所选择的具有brFA的微生物的FabH、ACP和fabF基因

环状脂肪醇的形成

可以使用环状脂肪酸衍生物作为本文所述的脂肪醛生物合成多肽的底物，从环状脂肪醛产生环状脂肪醇。为了产生环状脂肪酸衍生物底物，可以将提供环状前体的基因(例如ans、chc和plm基因家族)引入宿主细胞并使其表达，以允许从环状前体起始脂肪酸生物合成。例如，为了将例如大肠杆菌的宿主细胞转变为能够合成ω-环状脂肪酸衍生物(cyFA)的细胞，可以在宿主细胞中引入并表达提供环状前体环己基羰基辅酶A(CHC辅酶A)的基因(Croppetal.,NatureBiotech.18:980-983,2000)。在大肠杆菌中提供CHC辅酶A的基因的非限制性实例包括：来自山丘链霉菌(Streptomycescollinus)的安莎三烯(ansatrienin)基因簇的ansJ、ansK、ansL、chcA和ansM(Chenetal.,Eur.J.Biochem.261:98-107,1999)或来自链霉菌(Streptomycessp.)HK803的磷内酯霉素B(phoslactomycinB)基因簇的plmJ、plmK、plmL、chcA和plmM(Palaniappanetal.,J.Biol.Chem.278:35552-35557,2003)，以及来自山丘链霉菌、除虫链霉菌(S.avermitilis)或天蓝色链霉菌的chcB基因(Pattonetal.,Biochem.39:7595-7604,2000)(参见表5)。然后，可以表达表4中所列的基因，以允许ω-环状脂肪酸的起始和延长。或者，可以从产生cyFA的微生物中分离同源基因并在宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达该同源基因。

表5：用于CHC-辅酶A合成的基因

*GenBank条目U72144中只注释了chcA，ansJKLM是根据Chenetal.(Eur.J.Biochem.261:98-107,1999)。

表4中所列的基因(fabH、acp、和fabF)允许ω-环状脂肪酸的起始和延伸，这是因为它们具有宽的底物特异性。若任何这些基因与表5中所列的基因共表达没有产生cyFA，那么可以从产生cyFA的微生物(例如表6中列出的那些微生物)中分离fabH、acp和/或fabF同系物(例如通过使用简并PCR引物或异源的DNA序列探针)并且将其共表达。

表6：包含ω-环状脂肪酸的微生物的非限制性实例

*使用环庚基羰基辅酶A而非环己基羰基辅酶A作为cyFA生物合成的前体。

脂肪醇饱和度

可以通过调节脂肪酸中间体的饱和度来控制脂肪酸(然后可以将其转变为脂肪醛并且然后转变为本文所述的脂肪醇)的饱和度。例如，可以使sfa、gns、和fab基因家族表达、过表达或以降低的水平表达以控制脂肪酸的饱和度。图9列出了在本文所述的方法和宿主细胞中可以使用的基因家族中的基因的非限制性实例。

例如，可以通过将生产宿主进行基因工程，使其过表达fabB或通过使生产宿主在低温(例如低于37℃)下生长而将宿主细胞进行基因工程，使其产生不饱和脂肪酸。FabB具有对于cis-δ3癸烯酰-ACP的偏向性并导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸的产生。fabB的过表达导致显著百分比的不饱和脂肪酸的产生(deMendozaetal.,J.Biol.Chem.258:2098-2101,1983)。可以在不是天然具有基因fabB的宿主细胞中插入该基因并使其表达。然后，在被进行基因工程从而产生诸如脂肪醛的脂肪酸衍生物的宿主细胞中，这些不饱和脂肪酸可以被用作中间体。

在其他情况下，可以缺失脂肪酸生物合成的阻抑物，例如fabR(GenBank登录号NP_418398)，这也可以导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸产生的增加(Zhangetal.,J.Biol.Chem.277:15558,2002)。可以在其他宿主细胞中进行相似的缺失。例如，通过过表达fabM(反式-2,顺式-3-癸烯酰-ACP异构酶、GenBank登录号DAA05501)和来自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的fabK(反式-2-烯酰-ACP还原酶II，GenBank登录号NP_357969)的受控表达(Marrakchietal.,J.Biol.Chem.277:44809,2002)，同时缺失大肠杆菌fabI(反式-2-烯酰-ACP还原酶，GenBank登录号NP_415804)，可以实现不饱和脂肪酸的进一步增加。在一些实例中，可以减弱内源fabF基因，从而增加所产生的棕榈油酸酯(C16:1)的百分比。

在另外的实例中，可以通过降低sfa、gns、和/或fab基因的表达而将宿主细胞进行基因工程，使其产生饱和脂肪酸。

在一些实例中，可以将宿主细胞进行基因工程，使其表达降低水平的脱水酶/异构酶和/或酮酰-ACP合酶。例如，可以将宿主细胞进行基因工程，使其表达降低水平的fabA和/或fabB。在一些实例中，可以使宿主细胞在不饱和脂肪酸的存在下生长。在其它的实例中，可以将宿主细胞进一步进行基因工程，使其表达或过表达编码脱饱和酶的基因。脱饱和酶的一个非限制性的实例是枯草芽孢杆菌DesA(AF037430)。编码脱饱和酶的其它基因在本领域是已知的，并且可以被用于本文所述的宿主细胞和方法中，诸如使用酰基-ACP(诸如十六烷酰-ACP或十八烷酰-ACP)的脱饱和酶。可以使用饱和脂肪酸产生脂肪酸衍生物，诸如脂肪醛类，并且随后产生如本文所述的饱和脂肪醇类。

脂肪醇的产生

可以利用醇脱氢酶将本文所述的脂肪醛转变成脂肪醇。在一些实例中，可以在宿主细胞中表达编码本文所述的脂肪醛生物合成多肽的基因，所述宿主细胞表达能够将通过脂肪醛生物合成多肽产生的脂肪醛转变为对应得脂肪醇的内源性醇脱氢酶。在其它的实例中，可以在宿主细胞中表达编码本文所述的脂肪醇生物合成多肽的基因，例如图10中所列的氨基酸序列或其变体。示例性的脂肪醇生物合成基因包括但不限于：不动杆菌M-1的AlrA或AlrA同系物；以及内源性大肠杆菌醇脱氢酶，诸如DkgA(NP_417485)、DkgB(NP_414743)、YjgB(AAC77226)、YdjL(AAC74846)、YdjJ(NP_416288)、AdhP(NP_415995)、YhdH(NP_417719)、YahK(NP_414859)、YphC(AAC75598)以及YqhD(Q46856)。在其它的实例中，可以在宿主细胞中共表达编码脂肪醇生物合成多肽的基因与编码本文所述的脂肪醛生物合成多肽的基因。

将宿主细胞进行基因工程化使其产生脂肪醇

如本文所述，可以将不同的宿主细胞用于产生脂肪醇。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，编码本文所述的多肽(例如脂肪醛生物合成多肽和/或脂肪醇生物合成多肽)的基因可以在以下细胞中表达：细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞)。其他示例性的宿主细胞包括来自以下属的成员的细胞：埃希氏菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、曲霉属、木霉属、脉孢菌属、镰刀菌属、腐质霉属、根毛霉属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、毛霉菌属、蚀丝霉属、青霉属、平革菌属、侧耳属、栓菌属、金黄孢子菌属、酵母属、裂殖酵母属、耶氏酵母属或链霉菌属。其他示例性的宿主细胞可以是迟缓芽孢杆菌细胞、短芽孢杆菌细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、嗜碱芽孢杆菌细胞、凝结芽孢杆菌细胞、环状芽孢杆菌细胞、短小芽孢杆菌细胞、苏云金芽孢杆菌细胞、克劳氏芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞、康氏木霉细胞、绿色木霉细胞、里氏木霉细胞、长枝木霉细胞、泡盛曲霉细胞、烟曲霉细胞、臭曲霉细胞、构巢曲霉细胞、黑曲霉细胞、米曲霉细胞、特异腐质霉细胞、棉毛状腐质霉细胞、米黑根毛霉细胞、米黑毛酶细胞、浅青紫链霉菌细胞、鼠灰链霉菌细胞或放线菌细胞。其它的宿主细胞是蓝细菌宿主细胞。

在优选的实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞、酿酒酵母细胞或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的实施方案中，宿主细胞来自大肠杆菌菌株B、C、K或W。其它适宜的宿主细胞是本领域技术人员已知的。

在本文所述的方法中可以使用的其它宿主细胞描述于WO2009/111513和WO2009/111672。

本领域公知的各种方法可用于将宿主细胞进行基因工程，使其产生脂肪醇。所述方法可以包括使用包含编码本文所述的脂肪醛生物合成多肽和/或脂肪醇生物合成多肽、多肽变体或以上的片段的核酸的载体，优选表达载体。本领域技术人员应当理解，多种病毒载体(例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体以及腺相关病毒载体)和非病毒载体可以用于本文所述的方法中。

本文所述的重组表达载体包括适于宿主细胞中核酸表达的形式的本文所述的核酸。所述重组表达载体可以包括一个或多个基于将被用于表达的宿主细胞所选择的控制序列。所述控制序列被可操作地连接到待表达的核酸序列。这些控制序列描述于，例如Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表达技术：酶学方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)。控制序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些控制序列和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些控制序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应当理解到，表达载体的设计可以取决于，例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。可以将本文所述的表达载体引入宿主细胞，以产生本文所述核酸所编码的多肽，包括融合多肽。

可以设计重组表达载体用于在原核或真核细胞(例如，诸如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达编码脂肪醛生物合成多肽(或变体)的基因和/或编码脂肪醇生物合成多肽的基因。适合的宿主细胞在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表达技术：酶学方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)中进一步作了详细讨论。可选地，所述重组表达载体可以在体外进行转录和翻译，例如通过使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。

最经常用含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体在诸如大肠杆菌的原核生物中进行多肽表达。融合载体将许多氨基酸添加到其编码的多肽，通常添加到重组多肽的氨基末端。这些融合载体通常担任3个用途：(1)增加重组多肽的表达；(2)增加重组多肽的可溶性；和(3)通过作为亲和纯化中的配体，帮助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点。这使得在融合多肽纯化后，重组多肽能够从融合部分分离。这些酶及其同源识别序列的实例包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。示例性的融合表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smithetal.,Gene(1988)67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.)和pRITS(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到靶重组多肽。

诱导型、非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amannetal.,Gene(1988)69:301-315)和pET11d(Studieretal.,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表达技术：酶学方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)60-89)。从pTrc载体表达靶基因依赖于来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。从pET11d载体表达靶基因依赖于共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)所介导的来自T7gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由来自携带T7gn1基因的定居λ原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，所述T7gn1基因受lacUV5启动子的转录控制。

使重组多肽表达最大化的一种策略是，在蛋白水解切割重组多肽的能力受损的宿主细胞中表达多肽(参见Gottesman,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表达技术：酶学方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)119-128)。另一策略是改变待插入表达载体中的核酸序列，使得每个氨基酸的单独密码子是所述宿主细胞偏好使用的那些密码子(Wadaetal.,NucleicAcidsRes.(1992)20:2111-2118)。通过标准DNA合成技术可以进行该核酸序列的改变。

在另一实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。在该实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldarietal.,EMBOJ.(1987)6:229-234)、pMFa(Kurjanetal.,Cell(1982)30:933-943)、pJRY88(Schultzetal.,Gene(1987)54:113-123)、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)和picZ(InvitrogenCorp,SanDiego,Calif.)。

可选地，使用杆状病毒表达载体，可以在昆虫细胞中表达本文所述的多肽。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括，例如pAc系列(Smithetal.,Mol.CellBiol.(1983)3:2156-2165)和pVL系列(Lucklowetal.,Virology(1989)170:31-39)。

在另一实施方案中，可以使用哺乳动物表达载体，在哺乳动物细胞中表达本文所述的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,Nature(1987)329:840)和pMT2PC(Kaufmanetal.,EMBOJ.(1987)6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能可以由病毒调节元件提供。例如，通常使用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于原核和真核细胞都合适的其他表达系统描述于Sambrooketal.,eds.,MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd(分子克隆：实验手册，第2版),ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989的16和17章中。

通过常规转化或转染技术可以将载体引入原核或真核细胞。本文所用的术语“转化”和“转染”是指许多领域公认的用于将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适的方法可以见于例如Sambrooketal.(同上)。

对于细菌细胞的稳定转化，已知的是，根据所用的表达载体和转化技术，仅小部分的细胞会摄入并复制所述表达载体。为了鉴定和选择这些转化体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目的基因一同引入宿主细胞中。选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，所述药物诸如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素。编码选择标记的核酸可以在与编码本文所述多肽的载体相同的载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可以通过药物选择鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，具有并入的选择标记基因的细胞会存活，而其他细胞死亡)。

对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是，根据使用的表达载体和转染技术，仅小部分的细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目的基因一同引入宿主细胞中。优选的选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，所述药物诸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。编码选择标记的核酸可以在与编码本文所述的多肽的载体相同的载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可以通过药物选择鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，具有并入的选择标记基因的细胞会存活，而其他细胞死亡)。

转运蛋白

转运蛋白可以将多肽和有机化合物(例如脂肪醇)输出宿主细胞。很多转运和外排蛋白用于分泌多种化合物并且可以被天然修饰，从而对于特定类型的碳氢化合物具有选择性。

合适的转运蛋白的非限制性实例是ATP结合盒(ABC)转运蛋白、外排蛋白和脂肪酸转运蛋白(FATP)。合适的转运蛋白的其他非限制性实例包括来自诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、拟南芥(Arabidopsisthalania)、真养产碱杆菌(Alkaligeneseutrophus)和红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)的生物体的ABC转运蛋白。示例性的可以使用的ABC转运蛋白在图9中列出(例如CER5、AtMRP5、AmiS2和AtPGP1)。也可以根据宿主细胞分泌有机化合物的内源能力来选择宿主细胞。有机化合物产生和分泌进入宿主细胞环境(例如培养基、发酵液)的效率可以表达为细胞内产物与细胞外产物的比值。在一些实施例中，该比值可以为约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。

发酵

通过使用有益发酵技术，可以增强脂肪醇的产生和分离。使产量最大化同时降低费用的一种方法是增加被转变为碳氢化合物产物的碳源的百分比。

在正常的细胞生命周期中，碳被用于细胞功能，例如产生脂质、糖类、蛋白质、有机酸和核酸。降低生长相关活性所必需的碳的量可以增加碳源转变为产物的效率。可以通过例如首先使宿主细胞生长到所需密度(例如，达到对数生长期高峰的密度)来实现这点。在这点上，可以使用复制检查点基因(replicationcheckpointgene)阻止细胞生长。具体而言，群体感应机制(quorumsensingmechanisms)(综述于Camillietal.,Science311:1113,2006；VenturiFEMSMicrobio.Rev.30:274-291,2006；和Readingetal.,FEMSMicrobiol.Lett.254:1-11,2006)可以用于激活例如p53、p21的检查点基因或其他检查点基因。

可以被激活以阻止大肠杆菌中细胞复制和生长的基因包括umuDC基因。umuDC基因的过表达阻止从静止期到指数性生长的进展(Murlietal.,J.ofBact.182:1127,2000)。UmuC是可以对非编码损伤进行跨损伤修复(translesionsynthesis)的DNA聚合酶，所述非编码损伤是大部分UV和化学诱变的机制基础。umuDC基因产物参与跨损伤修复的过程并且还作为DNA序列损伤检查点。umuDC基因产物包括UmuC、UmuD、umuD'、UmuD'₂C、UmuD'₂和UmuD₂。同时，可以激活产生产物的基因，从而在产生脂肪醛的同时，使复制和保持待使用的途径的需要最小化。通过umuC和umuD与合适的终产物产生基因的重新合成，可以将宿主细胞进行基因工程，使其在prpBCDE启动子系统下的pBAD24中从大肠杆菌表达umuC和umuD。

转变为脂肪醇的输入碳的百分比可以是成本动因。该过程的效率更高(即转变为脂肪醇的输入碳的百分比越高)，该过程的耗费越小。对于含氧碳源(例如葡萄糖和其他基于碳水化合物的来源)，氧必须以二氧化碳的形式释放。对于每2个释放的氧原子，碳原子也被释放，这导致约34％(w/w)的最大理论代谢效率(对于脂肪酸来源的产物)。但是，这个数字对于其他有机化合物产物和碳源会变化。文献中的通常效率约低于5％。进行基因工程从而产生脂肪醇的宿主细胞可以具有大于约1、3、5、10、15、20、25和30％的效率。在一个实例中，宿主细胞可以表现出约10％至约25％的效率。在其他实例中，这些宿主细胞可以表现出约25％至约30％的效率。在其他实例中，宿主细胞可以表现出大于30％的效率。

另外，可以将宿主细胞进行基因工程，使其表达重组纤维小体，例如PCT申请第PCT/US2007/003736号中描述的那些。这些纤维小体可以允许宿主细胞使用纤维素原料作为碳源。例如，可以另外将宿主细胞进行基因工程，使其表达转化酶(EC3.2.1.26)，使得蔗糖可以被用作碳源。相似地，可以使用美国专利第5,000,000号、第5,028,539号、第5,424,202号、第5,482,846号和第5,602,030号中描述的教导将宿主细胞进行基因工程，使得宿主细胞可以有效地吸收碳并使用纤维素原料作为碳源。

在一个实例中，发酵室可以将正在进行连续还原的发酵封闭。这种情况下，可以创造稳定的还原环境。通过二氧化碳的释放(以气体形式)可以保持电子平衡。提高NAD/H和NADP/H平衡的努力也可以有助于稳定电子平衡。通过将宿主细胞进行基因工程，使其表达NADH:NADPH转氢酶，也可以增强细胞内NADPH的可利用性。一个或多个NADH:NADPH转氢酶的表达将糖酵解中产生的NADH转变为NADPH，NADPH可以增强脂肪醇的产生。

对于小规模生产，可以使工程化的宿主细胞批量生长，例如约100mL、500mL、1L、2L、5L或10L；进行发酵；并且基于适当的质粒中编码的具体基因，诱导表达所希望的脂肪醛生物合成基因和/或醇脱氢酶基因。对于大规模生产，可以使工程化的宿主细胞批量生长，约10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、1,000,000L或更大；进行发酵；并且基于适当的质粒中编码的或合并入宿主细胞基因组中的具体基因，诱导表达所希望的脂肪醛生物合成基因和/或醇脱氢酶基因。

例如，可以将携带包含所需基因的质粒的或具有合并入染色体中的基因的合适的生产宿主(例如大肠杆菌细胞)在合适的反应器(例如1L的反应器)中、在37℃下、在补充有2％葡萄糖、羧苄西林以及氯霉素的M9培养基中孵育20小时。当培养物的OD600达到0.9时，可以用IPTG醇诱导生产宿主。在孵育之后，可以提取出消耗过的培养基并且可以使用GC-MS检测有机相中脂肪醇的存在。

在一些实例中，第一小时的诱导后，可以每小时移除不多于10％的全部细胞体积的部分并允许其静置而不摇动以允许脂肪醇上升至表面并经历自发的相分离或沉淀。然后可以收集脂肪醇组分，并且将水相返回到反应室。可以连续操作反应室。当OD₆₀₀下降至0.6以下时，可以用生长自种子培养物的新批次替换细胞。

使用无细胞的方法产生脂肪醇

本文所述的一些方法中，可以使用本文所述的纯化的多肽(例如脂肪醇生物合成多肽)和例如通过本文所述的方法产生的底物(例如脂肪醛)产生脂肪醇。例如，可以将宿主细胞进行基因工程，使其表达本文所述的脂肪醇生物合成多肽或变体。可以在适合于允许多肽表达的条件下培养宿主细胞。然后可以使用已知的方法生成无细胞提取物。例如，可以使用去垢剂或通过超声处理裂解宿主细胞。可以使用已知的方法纯化表达的多肽。在获得无细胞提取物以后，可以将本文所述的底物加入无细胞提取物中并且保持在允许底物(例如脂肪醛)转变成为脂肪醇的条件下。然后可以使用已知的技术分离并且纯化脂肪醇。

在一些实例中，通过使本文所述的脂肪醛与图10中列出的脂肪醇生物合成多肽或其变体接触可以将脂肪醛转变成脂肪醇。

产生后加工

可以从发酵培养基中分离发酵中产生的脂肪醇。可以使用从水性培养基分离脂肪醇的任何已知技术。一个示例性分离过程是两相(twophase)(两相(bi-phasic))分离过程。该过程涉及使基因工程化的宿主细胞在足以产生脂肪醇的条件下发酵，允许脂肪醇收集在有机相中并从水性发酵液分离该有机相。可以在批次发酵过程和连续发酵过程中实施该方法。

两相分离利用脂肪醇的相对不混溶性来促进分离。不混溶是指化合物相对不溶于水的能力并且由化合物的分配系数所限定。本领域技术人员应当理解到，通过选择发酵液和有机相，使产生的脂肪醇具有高logP值，这样即使脂肪醇在发酵容器中处于非常低的浓度也可以被分离到有机相。

通过本文所述的方法产生的脂肪醇在发酵液以及细胞质中可以是相对不混溶的。因此，无论在细胞内或细胞外，脂肪醇可以收集在有机相中。有机相中产物的收集可以减轻脂肪醇对细胞功能的影响并可以允许宿主细胞产生更多产物。

本文所述的方法可以导致同质化合物的产生，其中至少约60％、70％、80％、90％或95％的产生的脂肪醇所具有的碳链长度变化少于约6个碳、少于约4个碳或少于约2个碳。产生的这些化合物也可以具有相对一致的饱和度。这些化合物可以直接用作燃料、燃料添加剂、用于生产其他化学化合物(例如聚合物、表面活性剂、塑料、纺织品、溶剂、粘合剂等)的起始原料或个人护理产品添加剂。这些化合物也可以用作例如氢化、催化裂解的后续反应(通过氢化、热解或两者)的原料以制造其他产品。

在一些实施方案中，使用本文所述的方法产生的脂肪醇可以含有约50％至约90％的碳；或约5％至约25％的氢。在其他实施方案中，使用本文所述的方法产生的脂肪醇可以含有约65％至约85％的碳；或约10％至约15％的氢。

表面活性剂和去垢剂组合物以及生物产品

可以将本文所述的这些脂肪醇用作或转变成表面活性剂或去垢剂组合物。本领域技术人员应当理解到，根据表面活性剂或去垢剂的预期用途，可以生产并使用不同的脂肪醇。例如，在将本文所述的脂肪醇用作表面活性剂或去垢剂生产的原料时，本领域技术人员应当理解到，脂肪醇原料的特征将影响所生产的表面活性剂或去垢剂的特征。因此，可以通过产生为用作原料的特定脂肪醇来选择表面活性剂或去垢剂产品的特征。

包含生物学上产生的有机化合物，特别是使用脂肪酸生物合成途径生物学上产生的脂肪醇的生物产品(例如脂肪醇)不是从可再生的来源产生的，并且因此是新的物质组合物。基于双重碳同位素指纹法(dualcarbon-isotopicfingerprinting)或¹⁴C年代测定，可以将这些新的生物产物与来源于石油化学碳的有机化合物区别开。此外，可以通过双重碳同位素指纹法(例如参见美国专利第7,169,588号，通过引用将其并入本文)确定生物来源碳的具体来源(例如葡萄糖与甘油相比)。

在商业中，区别生物产品与基于石油的有机化合物的能力在追踪这些材料方面是有益的。例如，包含基于生物学的和基于石油的碳同位素谱二者的有机化合物或化学品可以区别于仅由基于石油的材料制成的有机化合物和化学品。因此，在商业中，可以基于现有材料的独特的碳同位素谱来追踪它们。

通过比较各燃料中稳定碳同位素比(¹³C/¹²C)，可以将生物产品区别于基于石油的有机化合物。给定的生物产品中¹³C/¹²C比是大气二氧化碳中该二氧化碳被固定时的¹³C/¹²C比的结果。它还反映了准确的代谢途径。还存在区域性差异。石油，C₃植物(阔叶树)，C4植物(草)以及海产的碳酸盐类在¹³C/¹²C以及相应的δ¹³C值中全部表现出显著差异。此外，C₃和C₄植物的脂质分析不同于来源于相同植物的作为代谢途径结果的碳水化合物组分的材料。

在测量精度之内，由于同位素分馏效应¹³C表现出大的差异，对于生物产品最显著的效应是光合机制。植物中碳同位素比中差异的主要原因与植物中光合碳代谢通路的差异紧密相关，特别是在初级羧化(即大气CO₂的初始固定)期间发生的反应。两大类植物是涉及“C₃”(或Calvin-Benson)光合循环以及涉及“C₄”(或Hatch-Slack)光合循环的植物。

在C₃植物中，初级CO₂固定或羧化反应涉及酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶，并且第一稳定产物是3-碳化合物。诸如阔叶树和针叶树的C₃植物在温带气候地带中是最主要的。

在C₄植物中，涉及另一个酶(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)的其它羧化反应是初级羧化反应。第一稳定的碳化合物是4-碳的酸，所述4-碳的酸随后被脱羧基。如此释放的CO₂被C₃循环再固定。C₄植物的实例是热带牧草、玉米和甘蔗。

C₄和C₃植物都表现出一定范围的¹³C/¹²C同位素比，但是对于C₄植物，通常的值是约-7‰至约-13‰，并且对于C₃植物，是约-19‰至约-27‰(例如参见Stuiveretal.,Radiocarbon19:355,1977)。煤和石油通常落在后一范围内。¹³C测量标准最初由皮迪箭石(PeeDeeBelemnite(PDB))石灰石设定的零所定义，其中给出的值是与该材料的偏差的千分比。“δ¹³C”值被表达为千分比(千分之一)，缩写为‰，并且按照以下进行计算：

δ¹³C(‰)＝[(¹³C/¹²C)_样品-(¹³C/¹²C)_标准品]/(¹³C/¹²C)_标准品×1000

因为PDB参考物(RM)已经被耗尽，已经与IAEA、USGS、NIST和其它选定的国际同位素实验室合作开发了一系列备选RM。与PDB的偏差的千分比的记号为δ¹³C。通过对质量44、45以及46的分子离子的高精度稳定比率质谱(IRMS)对CO₂进行测量。

本文所述的组合物包括通过本文所述的任何方法产生的生物产品。具体而言，所述生物产品的δ¹³C可以为约-28或更大、约-27或更大、约-20或更大、约-18或更大、约-15或更大、约-13或更大、约-10或更大或约-8或更大。例如所述生物产品的δ¹³C可以为约-30至约-15、约-27至约-19、约-25至约-21、约-15至约-5、约-13至约-7或约-13至约-10。在其它的实例中，所述生物制品的δ¹³C可以为约-10、-11、-12或-12.3。

也可以通过比较每种化合物中¹⁴C的量，将生物产品区别于基于石油的有机化合物。因为¹⁴C具有5730年的核半衰期，所以包含“较老的”碳的基于石油的燃料可以区别于包含“较新的”碳的生物产品(参见例如Currie,“SourceApportionmentofAtmosphericParticles”,CharacterizationofEnvironmentalParticles,J.Buffle以及H.P.vanLeeuwen,Eds.,1ofVol.IoftheIUPACEnvironmentalAnalyticalChemistrySeries(LewisPublishers,Inc)(1992)3-74)。

放射性碳年代测定的基本假设是大气中¹⁴C浓度的恒定性导致活生物中¹⁴C的恒定性。然而，由于1950年以来的大气层核试验以及1850年以来的化石燃料的燃烧，¹⁴C已经获得了继发的地球化学时间特征(geochemicaltimecharacteristic)。大气CO₂中以及生物圈中¹⁴C的浓度在19世纪60年代中期核试验的高峰时几乎翻倍。此后，¹⁴C的浓度逐渐地返回到约1.2×10^-12的稳态宇宙发生(大气)基线同位素率(¹⁴C/¹²C)，大致的驰豫“半衰期”(relaxation“half-life”)为7至10年。(后一半衰期必须不能按照字面理解；而是必须使用详细的大气核输入/衰变函数来追踪核时代开始以来的大气和生物圈¹⁴C的变化。)

该后一生物圈¹⁴C时间特征支持每年年代测定近代生物圈碳。可以通过加速器质谱(AMS)测量¹⁴C，给出的结果的单位为“现代碳比例”(f_M)。f_M是由国家标准与技术协会(NIST)标准参照物质(SRM)4990B和4990C所定义的。本文使用的“现代碳比例”或“f_M”具有相同意义，都是按照国家标准与技术协会(NIST)标准参照物质(SRM)4990B和4990C定义的，4990B和4990C分别被称为草酸标准品HOxI和HOxII。基本的定义涉及0.95倍的¹⁴C/¹²C同位素比HOxI(参考AD1950)。这粗略地等于衰变校正的工业革命前树木(decay-correctedpre-IndustrialRevolutionwood)。对于现今生命生物圈(植物物质)而言，f_M约为1.1。

本文所述的组合物包括的生物产品的f_M ¹⁴C可以为至少约1。例如，所述生物产品的f_M ¹⁴C可以为至少约1.01、约1至约1.5、约1.04至约1.18或约1.111至约1.124。

¹⁴C的另一种测量被称为现代碳百分比，pMC。对于使用¹⁴C年代测定的考古学家或地质学家，AD1950等于“旧的零年”。这还代表100pMC。在1963年热核武器的顶峰，大气中的“炸弹碳”达到正常水平的几乎两倍。“炸弹碳”在大气中的分布自其出现以来是一致的，对于自从AD1950生活的植物和动物，表现出大于100pMC的值。随着时间它已经逐渐降低，当今的值是接近107.5pMC。这意味着诸如玉米的新生物质材料应当给出接近107.5pMC的¹⁴C特征。基于石油的化合物应具有零的pMC值。化石碳与现代碳的组合会导致当代pMC含量的稀释。通过假定107.5pMC代表当代生物质材料的¹⁴C含量并且0pMC代表基于石油的产品的¹⁴C含量，该材料所测量的pMC值会反映两种组分类型的比例。例如，100％来源于当代大豆的材料应当给出接近107.5pMC的放射性碳特征。若用基于石油的制品将该材料稀释50％，它应当给出约54pMC的放射性碳特征。

通过将107.5pMC指定为“100％”并且将0pMC指定为“0％”而衍生得到基于生物学的碳含量。例如，测量为99pMC的样品会给出93％的等同的基于生物学的碳含量。该值被称为平均的基于生物学的碳结果并且假定在所分析的材料之内全部组分起源于当代的生物材料或基于石油的材料。

本文所述的生物产品的pMC可以为至少约50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100。在其它的实例中，本文所述的生物产品的pMC可以为约50-约100；约60-约100；约70-约100；约80-约100；约85-约100；约87-约98；或约90-约95。在其它的实例中，本文所述的生物产品的pMC可以为约90、91、92、93、94或94.2。

燃料添加剂被用于增强燃料或发动机的性能。例如，燃料添加剂可以用于改变冻/凝点、浊点、润滑性、粘性、氧化稳定性、点火性能、辛烷水平和/或闪点。在美国，所有的燃料添加剂必须在环境保护署(EnvironmentalProtectionAgency)注册。通过联系EPA或通过浏览EPA的网站可公开获取燃料添加剂的名称和销售该燃料添加剂的公司。本领域技术人员应当理解到，本文所述的基于脂肪醇的生物燃料可以与一种或多种燃料添加剂混合以赋予所需品质。

可以将本文所述的基于脂肪醇的表面活性剂和/或去垢剂与本领域中公知的其它的表面活性剂和/或去垢剂混合。

在一些实例中，所述混合物可以包括至少以重量计约10％、15％、20％、30％、40％、50％或60％的脂肪醇。在其它的实例中，可以制造包括至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％脂肪醇的表面活性剂或去垢剂组合物，所述脂肪醇包含碳链的碳长度为8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22。所述表面活性剂或去垢剂组合物可以额外地包含至少一种选自以下的添加剂：表面活性剂；微乳液；至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的来自诸如植物油或石油的非微生物来源的表面活性剂或去垢剂。

通过以下实施例进一步说明本发明。所提供的这些实例只是用于说明性的目的。它们不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。

实施例

实施例1

羧酸还原酶(CAR)同系物的鉴定

来自诺卡氏菌菌株NRRL5646的羧酸还原酶(CAR)可以将羧酸(例如脂肪酸)还原为它们对应的醛，而不利用单独的活化酶，例如酰基辅酶A合酶)(Lietal.,J.Bacteriol.179:3482-3487,1997；Heetal.,Appl.Environ.Microbiol.70:1874-1881,2004)。

使用NRRL5646CAR氨基酸序列(Genpept登录号AAR91681)(SEQIDNO:16)作为查询序列的BLAST搜索鉴定了约20个同源序列。评价了表7中列出的3个同系物在大肠杆菌中表达时它们在体内将脂肪酸转变成为脂肪醛的能力。

在核苷酸序列水平，carA(SEQIDNO:19)、carB(SEQIDNO:21)以及fadD9(SEQIDNO:17)分别表现出与诺卡氏菌NRRL5646的car基因(AY495697)(SEQIDNO:15)的62.6％、49.4％以及60.5％的同源性。在氨基酸水平，CARA(SEQIDNO:20)、CARB(SEQIDNO:22)以及FadD9(SEQIDNO:18)分别表现出与诺卡氏菌NRRL5646的CAR(SEQIDNO:16)的62.4％、59.1％以及60.7％的一致性。

表7：CAR样蛋白和对应的编码序列。

实施例2

醇脱氢酶基因的鉴定

反向基因工程(ReverseEngineering)

大肠杆菌含有至少一个催化脂肪醛和脂肪醇的可逆的氧化还原的酶(即脂肪醛还原酶/醇脱氢酶)。反向基因工程被用于在表达来自细长聚球蓝细菌(Synpcc7942_1594)的酰基-ACP还原酶YP_400611(SEQIDNO:196)的大肠杆菌MG1655细胞中鉴定这类脂肪醛还原酶/脂肪醇脱氢酶。将4个3mLLB培养物在37℃下生长过夜，并且将55μL的静止相培养物用来接种4个独立的5.5mLLB。然后，使那些5.5mL培养物生长至0.8-1.0的OD₆₀₀并然后用于接种相应编号的2L振荡培养瓶，每个培养瓶具有500mLHu-9基础培养基。诱导后20小时，将细胞以4,000g离心20分钟。将细胞团重新悬浮在30mL具有1×BacterialProteaseArrest(GBiosciences)、pH7.2的100mM磷酸盐缓冲液中。然后，在弗氏细胞压碎器中以15,000psi使这些细胞破碎，使细胞穿过仪器两次。然后，通过以10,000g离心20分钟去除细胞碎片。将细胞裂解液上样到两个串联的HiTrapQ柱上(GEHealthcare)。将以下缓冲液用于洗脱蛋白：(A)50mMTris、pH7.5以及(B)50mMTris、pH7.5、具有1MNaCl。以3mL/分钟的流速，以从0％B至100％B的梯度运行5倍柱体积，同时收集4mL流分。

通过取用190μL的蛋白流分并且加入5μL20mMNADPH(Sigma)溶液和5μL20mM十二烷醛(Fluka)DMSO溶液，测定流分的醇脱氢酶活性。在37℃下将反应孵育1小时。然后，用100μL乙酸乙酯萃取它们并且通过GC/MS分析十二烷醇。350mMNaCl附近洗脱的流分包含醇脱氢酶活性。

收集包含醇脱氢酶活性的流分并且上样到1mLResourceQ柱上(GEHealthcare)。使用与HiTrapQ柱相同的条件，但是只收集0.5mL流分。然后，收集表现出醇脱氢酶活性的蛋白流分并且使用Amicon(Milipore)蛋白浓缩器(截取值10,000kDa)将其浓缩到1mL体积。然后，将溶液上样到HiPrep200尺寸排阻柱上(GEHealthcare)。使含有pH7.5的50mMTris和150mMNaCl的缓冲液以每分钟0.3mL的速率通过柱子。收集2mL流分。两个蛋白流分包含醇脱氢酶活性。将这两个流分和这两个流分之前和之后的流分上样到聚丙烯酰胺凝胶，并且用SimplySafeCommassie染色剂(invitrogen)染色。

比较有活性和无活性流分的条带，在有活性的流分中出现了一个在无活性的流分中未观察到的蛋白条带。将该蛋白条带从凝胶上剪下，并且送到斯坦福质谱学实验中心(StanfordMassSpectroscopyFacility)进行LC/MS/MS蛋白测序。该分析中鉴定出的蛋白之一是YahK。

为证实YahK的确是醇脱氢酶，在大肠杆菌MG1655(DE3、ΔfadD、ΔyjgB)(对照菌株)中将yahK敲除(描述于实施例4中)。使用lamdaredsystem(描述于实施例4中)、使用以下引物构建yahK敲除的菌株MG1655(DE3、ΔfadD、ΔyjgB、ΔyahK)：

yahK_F

(CATATCAGGCGTTGCCAAATACACATAGCTAATCAGGAGTAAACACAATG)(SEQIDNO:197)和

yahK_R

(AATCGCACACTAACAGACTGAAAAAATTAATAAATACCCTGTGGTTTAAC)(SEQIDNO:198)。

将表达酰基-ACP还原酶YP_400611的ΔyahK菌株和对照菌株在上述条件下进行培养。从两个菌株制备无细胞的裂解液，并且如以上所讨论的测定每个裂解液的醇脱氢酶活性。

ΔyahK菌株未将十二烷醛转变成十二烷醇，而野生型菌株具有该活性。为了另外证实，如上文所述将每个裂解液在HiTrapQ柱上运行。在350mMNaCl附近洗脱的流分中野生型裂解液具有醇脱氢酶活性，而ΔyahK裂解液在该区域内没有醇脱氢酶活性。

生物信息学

有根据认为，大肠杆菌中可能的乙醇脱氢酶是以下四个蛋白家族的成员：Zn依赖性醇脱氢酶(Pfam00107and08240)、Fe依赖性醇脱氢酶(Pfam00465)、醛-酮还原酶(Pfam00248)以及短链脱氢酶(Pfam00106)(Pfam＝按照“pfam.sanger.ac.uk”的蛋白家族)。使用Pfam基序，鉴定出大肠杆菌中这四个蛋白家族的全部成员(图10中列出)。在该列表中，挑选以下8个候选者用于实验分析：yahK、yjgB、adhP、dkgA、dkgB、yhdH、ydjL以及yqhD。

为确定这些基因是否可以将脂肪醛还原成脂肪醇，将这8个基因连同大肠杆菌‘tesA克隆进pET-Duet载体。然后，将这些基因转化进入大肠杆菌(DE3)MG1655ΔyjgBΔyahK细胞。然后，使3mL过夜起始培养物生长在37℃下具有羧苄西林(carbanecillin)(100mg/L)的LB中。实验中还包括缺乏候选醇脱氢酶的对照菌株。将1mL每种过夜培养物用于接种具有羧苄西林的50mL新鲜LB中。在37℃下振荡培养物直到达到0.8-1的OD₆₀₀。然后将培养物转移到18℃，用1mMIPTG诱导并且振荡过夜。

然后，通过以4,000g将培养物离心20分钟来制备无细胞裂解液。然后，将培养物重悬在1mL的Bugbuster(Novagen)中并且轻轻地在室温下振荡5分钟。通过15,000g离心10分钟将细胞碎片去除。通过混合88μL的裂解液、2μL的40mM顺式-11-十六烯醛DMSO溶液以及10μL的20mMNADPH，测定得到的裂解液的醇脱氢酶活性。在37℃将样品孵育30分钟，并且然后用100μL乙酸乙酯进行提取。使用GC/MS分析提取物。

与仅有‘TesA的对照相比，所有蛋白表现出顺式-11-十六烯醛到顺式-11-十六烷醇的显著的更好的转变(参见表8)。在使用十二烷醛而不是顺式-11-十六烯醛作为所述底物的测定中，证实了这些结果(参见表8)。

为研究这些酶在生产条件下如何贡献于大肠杆菌中的脂肪醇脱氢酶活性，首先通过用表达酰基-ACP还原酶YP_400611的质粒转化MG1655(DE3，ΔfadD)中的yjgByahK双敲除菌株(如上文所述)并且分析脂肪醛和脂肪醇滴定度来测试该菌株。受试菌株还包含表达脱羰酶的质粒。在若干实验中，这种双敲除突变株显示出轻微更高的脂肪醛滴度(例如见图11)，证实这两个推定的醇脱氢酶在生产条件下对大肠杆菌中的脂肪醇脱氢酶活性有贡献(还可参见实施例4，MG1655(DE3，ΔfadDΔyjgB)菌株也得到的相似结果)。然后，在yjgByahK双突变株中将两个其它基因yncB和ydjA缺失。YdjA不是上述四个蛋白家族的一员，其表现出轻微升高的脂肪醛水平(参见图11)，这表明它在生产条件下对大肠杆菌中的脂肪醇脱氢酶活性也有贡献。

此外，还在MG1655(DE3,ΔfadD,ΔyjgBΔyahK)中将表8的活性脂肪醇脱氢酶缺失并且按照上文所述进行测试。这些缺失菌株中的一些表现出轻微升高的脂肪醛水平，这表明它们在生产条件下对大肠杆菌中的脂肪醇脱氢酶活性也有贡献(参见图12)。

表8：推定的脂肪醇脱氢酶基因的过表达

实施例3

大肠杆菌中CAR同系物和醇脱氢酶的表达：

A.CAR质粒构建

构建三个大肠杆菌表达质粒以表达编码表7中列出的CAR同系物的基因。首先，使用引物fadD9F和FadDR(见表9)从结核分枝杆菌H37Rv(获自加拿大温哥华市不列颠哥仑比亚大学(TheUniversityofBritishColumbia,andVancouver,BCCanada))的基因组DNA扩增fadD9。首先将PCR产物克隆入PCR-blunt(Invitrogen)，然后以NdeI-AvrII片段释放。然后将所述NdeI-AvrII片段克隆在pACYCDuet-1(Novogen)的NdeI和AvrII的位点之间以产生pACYCDuet-1-fadD9。

使用引物CARMCaF和CARMCaR(见表9)从耻垢分枝杆菌MC2155(获自ATCC(ATCC23037D-5))的基因组DNA扩增carA基因。使用引物CARMCbF和CARMCbR(见表9)从耻垢分枝杆菌MC2155(获自ATCC(ATCC23037D-5))的基因组DNA扩增carB基因。首先将每种PCR产物克隆入PCR-blunt并且然后以NdeI-AvrII片段释放。然后将这两个片段中的每一个亚克隆在pACYCDuet-1(Novogen)的NdeI和AvrII的位点之间以产生pACYCDuet-1-carA和pACYCDuet-1-carB。

表9.用于扩增编码CAR同系物的基因的引物

B.醇脱氢酶质粒构建

质粒pETDuet-1-‘tesA-yjgB携带来自大肠杆菌K12菌株的‘tesA和yjgB(推定的醇脱氢酶；GenBank登录号：NP_418690；GenPept登录号AAC77226)。

使用以下引物从大肠杆菌K-12的基因组DNA扩增基因yjgB(GenBank登录号：NP_418690)。

通过使用以下引物的PCR产生yjgB插入物：

NcoIYjgB正向：

aatccTGGCATCGATGATAAAAAGCTATGCCGCAAAAG(SEQIDNO:199)

HindIIIYjgB反向：

ataaaagctTTCAAAAATCGGCTTTCAACACCACGCGG(SEQIDNO:200)

然后将PCR产物亚克隆入pETDuet-1-‘tesA的NcoI和HindIII位点以产生pETDuet-1-‘tesA-yjgB。

质粒pETDuet-1-‘tesA-alrAadp1携带来自AcinetobacterbaylyiADP1的‘tesA和alrAadp1(GenPept登录号CAG70248.1)。

通过两步法PCR步骤从AcinetobacterbaylyiADP1的基因组DNA扩增基因alrAadp1。第一组PCR反应使用以下引物对去除了bp632-636处的内部NcoI位点：

ADP1Alrmut1反向：

5’-GACCACGTGATCGGCCCCCATAGCTTTGAGCTCATC(SEQIDNO:201)

ADP1Alr1mut1正向：

5’-GATGAGCTCAAAGCTATGGGGGCCGATCACGTGGTC(SEQIDNO:202)

然后分离该PCR产物，使用Qiagen凝胶提取试剂盒进行纯化，并且将其用作第二PCR反应的输入物，其中使用以下引物来产生在位置633处具有C→T突变的全长AlrAadp1：

NcoIADP1Alr1正向：

5’-AATACCATGGCAACAACTAATGTGATTCATGCTTATGCTGCA(SEQIDNO:203)

HindIIIADP1Alr1反向：

5’-ATAAAAGCTTTTAAAAATCGGCTTTAAGTACAATCCGATAAC(SEQIDNO:204)

通过将AcinetobacterbaylyiADP1的同系物alrAadp1基因(基因座标签＝“ACIAD3612”)插入pETDuet-1-‘tesA的NcoI和HindIII位点来制备质粒pETDuet-1-‘tesA-alrAadp1。

B.脂肪醛和脂肪醇产生的评价

为了评价羧酸还原酶和醇脱氢酶对脂肪醇产生的影响，将所制备的质粒的不同组合转化入大肠杆菌菌株C41(DE3，ΔfadE)(描述于PCT/US08/058788)。

例如，将编码CAR同系物carA的质粒pACYCDuet-1-carA与pETDuet-1-‘tesA-alrAadp1共转化(例如见图1)。

将编码CAR同系物carB的质粒pACYCDuet-1-carB与pETDuet-1-‘tesA共转化。此外，还将pACYCDuet-1-carB分别与pETDuet-1-‘tesA-yjgB和pETDuet-1-‘tesA-alrAadp1共转化。作为对照，将pACYCDuet-1-carB与空载体pETDuet-1共转化(例如见图1)。

将编码CAR同系物fadD9的质粒pACYCDuet-1-fadD9与pETDuet-1-‘tesA共转化。此外，还将pACYCDuet-1-fadD9分别与pETDuet-1-‘tesA-yjgB和pETDuet-1-‘tesA-alrAadp1共转化。作为对照，将pACYCDuet-1-fadD9与空载体pETDuet-1共转化(例如见图1)。

作为另外的对照，将pETDuet-1-‘tesA-yjgB与空载体pETDuet-1共转化。

使大肠杆菌转化体生长在37℃下、3mL补充有羧苄西林(100mg/L)和氯霉素(34mg/L)的LB培养基中。在过夜生长之后，将15μL培养物转移进2mL补充有羧苄西林和氯霉素的新鲜LB培养基。在生长3.5小时之后，将2mL培养物转移进含有20mL具有2％葡萄糖和羧苄西林与氯霉素的M9培养基125mL烧瓶中。当培养物的OD₆₀₀达到0.9时，向每个烧瓶加入1mM的IPTG。在37℃下生长20小时之后，对每个烧瓶加入20mL乙酸乙酯(具有1％乙酸，v/v)，从而提取发酵期间产生的脂肪醇。如本文所述，用GC/MS直接分析粗的乙酸乙酯提取物。

对于顺式-5-十二烯-1-醇，测得的保留时间是6.79分钟；对于1-十二烷醇是6.868分钟；对于顺式-7-十四烯-1-醇是8.058分钟；对于1-十四烷醇是8.19分钟；对于顺式-9-十六烯-1-醇是9.208分钟；对于1-十六烷醇是9.30分钟；以及对于顺式-11-十八烯-1-醇是10.209分钟。

无前导序列的tesA与这三个car基因中的任何一个在大肠杆菌中的共表达产生高滴度的脂肪醇和可检测出的脂肪醛产生(图1、2、5)。carA或carB与无前导序列的tesA和alrAadp1的表达产生大于700mg/L的脂肪醇滴度和减少的脂肪醛产生。同样地，fadD9与无前导序列的tesA和alrAadp1的共表达产生超过300mg/L的脂肪醇。在没有无前导序列的tesA的情况下表达时，carB和fadD9都不能产生超过10mg/L的脂肪醇(可能是来源于由于内源性tesA而产生的细胞中游离脂肪酸的积累)。总之，该数据表明：脂肪酸是这些CAR同系物的底物，而且诸如‘tesA(从酰基-ACP释放脂肪酸)的硫酯酶的过表达实现了脂肪醇的大量产生。

在一个发酵中，用pACYCDuet-1-carB+pETDuet-1-tesA共转化的大肠杆菌菌株C41(DE3,ΔfadE)产生平均695mg/L的脂肪醇和120mg/L的脂肪醛。大量脂肪醛的存在与CAR作为生成醛的脂肪酸还原酶(AFAR)是一致的。这种机制不同于由JjFAR代表的生成醇的脂肪酰辅酶A还原酶(FAR)和由Acr1代表的脂肪酰辅酶A还原酶。

如上文所述的在大肠杆菌菌株中从脂肪醛产生脂肪醇可能由内源性醇脱氢酶催化。大肠杆菌产生能够将不同链长度的脂肪醛转变成为脂肪醇的醇脱氢酶(例如yjgB)(Naccaratoetal.,Lipids9:419-428(1974)；Reiseretal.,J.Bacteriol.179:2969-2975(1997)；Venkitasubramanianetal.,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))。

因此，醇脱氢酶还可以在除羧酸还原酶之外的脂肪醇生物合成途径中起作用。例如，与没有过表达yjgB或alrAadp1的菌株相比，yjgB或alrAadp1与carB和无前导序列的tesA的表达显著地降低了脂肪醛类的积累(图2)。

在将pACYCDuet-1-carB转化入大肠杆菌菌株C41(DE3，ΔfadE)的发酵之后，在用于重组大肠杆菌菌株的脂肪醇产生的烧瓶的底部中心观察到了白色、圆形、盘状沉积物。相比之下，在没有表达car同系物的对照烧瓶的底部没有观察到这样的沉积物。对溶解在乙酸乙酯(具有1％的乙酸，v/v)中的沉积物的GC/MS分析揭示该沉积物是脂肪醇沉积物。

C.不同CAR同系物产生的脂肪醇的类型

根据大肠杆菌菌株C41(DE3，ΔfadE)中表达的CAR同系物的不同，产生了不同的脂肪醇混合物。在所评价的三个CAR同系物中观察到了脂肪醇的不同组成(见表10)。FadD9产生的C₁₂脂肪醇多于碳链长度大于12的其它脂肪醇。与表达FadD9时观察到的结果相比，CarA和CarB产生的脂肪醇的链长度的范围更宽。

表10.重组大肠杆菌菌株产生的脂肪醇的酰基组成

*无前导序列的TesA。C12包括C12:0和C12:1脂肪醇。

D.脂肪醇的定量和鉴定

使用配备有30m×0.25mm(0.10μm薄膜)DB-5柱的Agilent5975BMSD系统进行GC-MS。柱温度为在100℃下3分钟等温。将柱的程序设计为以20℃/分钟的速率从100℃升高到320℃。在达到最终温度时，将柱在320℃下保持等温5分钟。注射容积为1μL。以1.3mL/分钟释放载气氦。质谱仪装备有电子轰击电离源。将电离源温度设为300℃。

在定量之前，使用两种方法鉴定各种醇。首先，将各化合物的GC保留时间与已知的标准品(比如鲸蜡醇、十二烷醇、十四烷醇、十八烷醇以及顺式-9-十八碳烯醇)的保留时间相比较。然后，通过将所述化合物的质谱与质谱文库(例如C12:0、C12:1、C13:0、C14:0、C14:1、C15:0.C16:0、C16:1、C17:0、C18:0以及C18:1醇)中标准品的质谱匹配而证实各化合物的鉴定。

实施例4

通过大肠杆菌MG1655(DE3,ΔfadD)中CAR同系物的异源表达产生脂肪醇

fadD缺失菌株的构建

按照下文所述，使用λ红系统(lambdaredsystem)(Datsenkoetal.,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645)缺失大肠杆菌MG1655的fadD基因：

使用以下引物扩增来自pKD3的氯霉素乙酰转移酶基因：fad1(5`-TAACCGGCGTCTGACGACTGACTTAACGCTCAGGCTTTATTGTCCACTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3`)(SEQIDNO:205)和fad2(5`-CATTTGGGGTTGCGATGACGACGAACACGCATTTTAGAGGTGAAGAATTGCATATGAATATCCTCCTTTAGTTCC-3`)(SEQIDNO:206)。

使该PCR产物电穿孔进入大肠杆菌MG1655(pKD46)。将细胞接种在L-氯霉素(30μg/mL)(L-Cm)上并且在37℃下生长过夜。将单独的菌落挑在另一个L-Cm板上并且在42℃下生长。然后将这些菌落贴到L-Cm和L-羧苄西林(100μg/mL)(L-Cb)板上并且在37℃下生长过夜。通过PCR进一步评价Cm^R和Cb^S的菌落，以确保PCR产物插入正确的位点。使用引物fadF(5`-CGTCCGTGGTAATCATTTGG-3`)(SEQIDNO:207)以及fadR(5`-TCGCAACCTTTTCGTTGG-3`)(SEQIDNO:208)对这些细菌的菌落裂解液进行PCR验证。ΔfadD::Cm缺失体的预期大小为约1200bp(图4)。使用FLP辅助质粒，按照Datsenkoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645(2000))中所述，去除氯霉素抗性基因。用引物fadF和fadR进行缺失的PCR验证(图4)。MG1655ΔfadD菌株不能在M9+油酸琼脂平板(油酸盐作为碳源)上生长。它也不能在M9+油酸液体培养基中生长。反式(在pCL1920-Ptrc中)提供的大肠杆菌fadD基因弥补了该生长缺陷。

MG1655(DE3,ΔfadD)菌株的构建

为产生T7反应性菌株，使用λDE3溶原化试剂盒(λDE3LysogenizationKit)(Novagen)，该试剂盒是设计用于将λDE3前噬菌体位点特异性地整合入大肠杆菌宿主染色体，使得溶原化的宿主可用于表达克隆在T7表达载体中的靶基因。λDE3是重组噬菌体，其携带用于受lacUV5控制的T7RNA聚合酶的克隆基因。简言之，在37℃下将宿主菌株培养在补充有0.2％麦芽糖、10mMMgSO₄以及抗生素的LB中，直到OD₆₀₀达到0.5。然后，将10⁸pfuλDE3、10⁸pfu辅助噬菌体以及10⁸pfu选择噬菌体与10μL宿主细胞孵育。将宿主/噬菌体混合物在37℃下孵育20分钟以允许噬菌体吸附到宿主上。最后，将混合物用移液管吸到补充有抗生素的LB板上。使用铺板珠将混合物均匀铺开，并且将板倒转并且在37℃下孵育过夜。

评价λDE3溶素原候选者的支持T7测试噬菌体生长的能力。T7测试噬菌体是T7噬菌体缺失突变体，它是完全缺陷的，除非宿主细胞能提供活性T7RNA聚合酶。T7测试噬菌体在IPTG的存在下在真正的λDE3溶原上产生非常大的斑块，而在没有诱导剂的情况下观察到非常小的斑块。在缺少IPTG的情况下的斑块的相对大小指示溶原中T7RNA聚合酶的基础水平表达，并且在不同宿主细胞背景之间可以明显不同。

以下过程被用于确定DE3溶原现象的存在。首先，在37℃下使候选菌落生长在补充有0.2％麦芽糖、10mMMgSO₄以及抗生素的LB中，直到OD₆₀₀达到0.5。然后将T7测试噬菌体的小份在1×噬菌体稀释缓冲液中稀释到2×10³pfu/mL的滴度。在两个平行管中，将100μL宿主细胞与100μL稀释的噬菌体混合。将宿主/噬菌体混合物在室温下孵育10分钟以允许噬菌体吸附到宿主上。然后，将3mL熔化的顶层琼脂糖加入包含宿主和噬菌体的各管中。将一个平行管的内容物接种在LB板上并且将另一个平行管的内容物接种在补充有0.4mMIPTG(异丙基-b-硫代半乳吡喃糖苷)的LB板上来评价T7RNA聚合酶的诱导。允许板静置5分钟直到顶层琼脂糖固化。然后将板在30℃下倒置过夜。

MG1655(DE3,ΔfadD,yjgB::kan)菌株的构建

通过使用以下λ红系统(lambdaredsystem)(Datsenkoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645(2000))构建yjgB敲除菌株MG1655(DE3,ΔfadD,yjgB::kan)：

使用以下引物扩增来自pKD13的卡那霉素抗性基因：yjgBRn(5`-GCGCCTCAGATCAGCGCTGCGAATGATTTTCAAAAATCGGCTTTCAACACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3`)(SEQIDNO:209)

和

yjgBFn(5`-CTGCCATGCTCTACACTTCCCAAACAACACCAGAGAAGGACCAAAAAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3`)(SEQIDNO:210)。

然后，使PCR产物电穿孔进入大肠杆菌MG1655(DE3，ΔfadD)/pKD46。将细胞接种在卡那霉素(50μg/mL)(L-Kan)上并且在37℃下生长过夜。将单独的菌落挑在另一个L-Kan板上并且在42℃下生长。然后将这些菌落贴到L-Kan和羧苄西林(100mg/mL)(L-Cb)板上并且在37℃下生长过夜。通过PCR进一步评价kan^R和Cb^S的菌落以确保PCR产物插入正确的位点。使用引物BF(5`-gtgctggcgataCGACAAAACA-3`)(SEQIDNO:211)以及BR(5`-CCCCGCCCTGCCATGCTCTACAC-3`)(SEQIDNO:212)对这些细菌的菌落裂解液进行PCR验证。yjgB::kan敲除体的预期大小是约1450bp。

使用MG1655(DE3，ΔfadD)菌株在脂肪醇产生的方面评价FadD

在实施例3中，将fadE缺失菌株用于大肠杆菌中‘TesA、CAR同系物以及内源性醇脱氢酶的脂肪醛和脂肪醇产生。为证明CAR同系物使用脂肪酸而不是酰基辅酶A作为底物，将在大肠杆菌中编码酰基辅酶A合酶的基因(fadD)缺失，使得辅酶A不能活化所产生的脂肪酸。用pETDuet-1-‘tesA和pACYCDuet-1-carB转化大肠杆菌菌株MG1655(DE3，ΔfadD)。使用本文所述的方法，评价转化体的脂肪醇产生。这些转化体产生约360mg/L的脂肪醇(十二烷醇、十二烯醇、十四烷醇、十四烯醇、鲸烷基、十六烯醇以及十八烯醇)。

YjgB是醇脱氢酶

为证实YjgB是负责将脂肪醛转变成它们对应的脂肪醇的醇脱氢酶，将pETDuet-1-‘tesA和pACYCDuet-1-fadD9共转化入MG1655(DE3，ΔfadD)或MG1655(DE3,ΔfadD,yjgB::kan)。同时，用pETDuet-1-‘tesA-yjgB和pACYCDuet-1-fadD9转化MG1655(DE3，ΔfadD，yjgB::kan)。

在37℃下使大肠杆菌转化体生长在3mL补充有羧苄西林(100mg/L)和氯霉素(34mg/L)的LB培养基中。在生长过夜之后，将15μL培养物转移进2mL补充有羧苄西林和氯霉素的新鲜LB培养基。在生长3.5小时之后，将2mL培养物转移进包含20mL具有2％葡萄糖、羧苄西林以及氯霉素的M9培养基的125mL的烧瓶中。当培养物的OD₆₀₀达到0.9时，向各烧瓶加入1mM的IPTG。在37℃下生长20小时之后，向各烧瓶加入20mL乙酸乙酯(具有1％的乙酸，v/v)以提取发酵期间产生的脂肪醇。如本文所述，用GC/MS直接分析粗的乙酸乙酯提取物。

yjgB敲除菌株导致十二烷醛的大量积累和较低的脂肪醇滴度(图5)。yjgB敲除菌株中质粒pETDuet-1-‘tesA-yjgB的yjgB表达有效地消除了十二烷醛的积累(图5)。该数据表明YjgB参与将十二烷醛转化成为十二烷醇，而且在大肠杆菌中可能存在其它的醇脱氢酶将其它的醛转化成为醇。十二烷醛在yjgB敲除菌株中积累，但在野生型菌株(MG1655(DE3，ΔfadD))或具有yjgB表达质粒的yjgB敲除菌株中都没有观察到该现象。箭头(图5中)表示十二烷醛(C12:0醛)的GC追踪。

实施例5

大肠杆菌中饱和脂肪醇类的产生

用于商业用途的脂肪醇是饱和的。然而，大肠杆菌在其膜中通常具有一定量(约20％至25％)的不饱和脂肪酸以保持流动性。将大肠杆菌菌株进行基因工程，使其能在未补充不饱和脂肪酸或环丙烷脂肪酸的培养基中专门产生饱和脂肪酸，并且能产生饱和脂肪醇。

分别由fabA和fabB编码的两种酶脱水酶/异构酶和酮酰合酶I(KASI)参与不饱和脂肪酸生物合成。通常，缺乏FabA或FabB的大肠杆菌菌株在不补充诸如油酸盐的不饱和脂肪酸的情况下不能存活。为了克服这一点，将fabB基因从大肠杆菌宿主菌株中敲除，并且通过将细胞进行基因工程使其表达来自枯草芽孢杆菌的重组脱饱和酶基因(AF037430，编码DesA)，该菌株能够在不补充不饱和脂肪酸的情况下生长。虽然第一代表达desA的菌株需要油酸盐来正常生长，但是随后将菌株在L琼脂平板上接种若干次后，得到了不需要油酸盐就能生长的菌株。

材料

大肠杆菌JWC280细胞(描述于Campbelletal.,Mol.Microbiol.47:793-805(2003))和大肠杆菌GRT23细胞(描述于Morgan-Kissetal.,Arch.Microbiol.190:427-437(2008))获自JohnCronan。

质粒构建

用引物Δ5Fn和Δ5Rn(列在表11中)从枯草芽孢杆菌菌株168的基因组DNA扩增desA基因(还称为Δ5des)，并且用AvrII和EcoRI进行消化。然后将desA基因克隆进pET-21(a)以产生pET-21a-Δ5，用AvrII-EcoRI将所述pET-21(a)线性化。然后将desA基因以pET-21a-Δ5的NdeI-EcoRI片段去除，并且将其插入OP180(pACYC衍生的质粒，携带trc启动子)的NdeI和EcoRI位点之间。得到的质粒被命名为pACYC-Δ5。

将desA_kan基因盒克隆在CDFDuet-1的AvrII-BamHI位点之间。使用引物kanF和kanR(见表11)从作为模板的pKD13(pKD13获自耶鲁大学大肠菌遗传保质中心，并且在Datsenkoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645(2000)中有描述)扩增PCR产物，通过用EcoRI和BamHI对该PCR产物进行消化产生kan基因盒。用AvrII和EcoRI消化扩增的desA基因(如上文所述)。然后将desA基因的AvrII-EcoRI片段和kan基因的EcoRI-BamHI片段插入pCDFDuet-1(来自EMDChemicals,Gibbstown,NJ)的AvrII-BamHI位点之间以产生质粒，它被命名为pCDFDuet-1-Δ5-kan。

通过若干亚克隆步骤，构建p84.17fabBΔ5kan质粒，从而用desA_kan盒替换fabB。首先，用引物fabBLF和fabBLR(见表11)从大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增位于fabB上游区侧翼的DNA片段(L-fabB)，并且用引物fabBRF和fabBRR(见表11)从大肠杆菌MG1655基因组DNA扩增位于fabB下游区侧翼的DNA片段(R-fabB)。然后，用XbaI和BglII消化L-fabB，并且用NotI和BglII消化R-fabB。将消化后的L-fabB和R-fabB片段从琼脂糖凝胶纯化并且用XbaI-NotI线性化的pKOV连接。将得到的质粒命名为pHZ1.186。然后，将desA_kan基因盒以AvrII-BamHI片段从pCDFDuet-1-Δ5-kan去除，并且将其插入pHZ1.186的AvrII和BglII位点之间，从而desA_kan基因盒被L-fabB和R-fabB夹在中间。最后，用fabBLF和fabBRR(见表11)从pHZ1.186扩增L-fabB-desA_kan-R-fabB片段，并且将其克隆入pMOD-4-MCS(EpicentreBiotechnologies,Madison,WI)的两个PvuII位点。将最终的质粒命名为p84.17fabB。

使用引物fabBup和fabBdowm(见表11)从GRT23细胞基因组扩增跨越fabB::cm的上游约1kb至下游约1kb的DNA。然后用PvuII消化所扩增的DNA片段，并且将其插入到pMOD-4-MCS的两个PvuII位点之间。将得到的质粒命名为p84.15。

将编码硫酯酶(‘TesA)和脂肪酸还原酶(CarB)的基因作为操纵子克隆，并且将该操纵子置于trc启动子和pCL1920载体下。将最终的质粒命名为pCL-Ptrc-carB_’tesA(该序列以SEQIDNO:213列在图17中)。

表11：引物序列

菌株构建

通过将p84.15fabB转化入MG1655(ΔfadEΔfhuA)/pACYC-Δ5构建了大肠杆菌MG1655(ΔfadEΔfhuAfabB::cm)/pACYC-Δ5菌株。将质粒p84.17fabB转化入MG1655(ΔfadEΔfhuAfabB::cm)/pACYC-Δ5以产生MG1655(ΔfadEΔfhuAfabB::desA_kan)/pACYC-Δ5。在每次转化以后，将转化体混合物接种于补充有1mMIPTG和适当的抗生素(17mg/L的氯霉素或50mg/L的卡那霉素)的L琼脂平板上。

MG1655(ΔfadEΔfhuAfabB::desA_kan)/pACYC-Δ5正常生长在补充有油酸盐(钾盐，50mg/L)的L培养液中。将细胞接种到补充有50mg/L油酸盐的L琼脂平板上并且在37℃下孵育2天。然后将菌落贴到补充有50mg/L的油酸盐和100mg/L羧苄西林的L琼脂平板上。将失去对羧苄西林的抗性但是保留了对卡那霉素的抗性的菌落中的一个画线到补充有50mg/L卡那霉素但是没有油酸盐的L琼脂平板上。从平板中选择一个菌落并且命名为ALC119A。

具有脂肪醇通路的ALC119A几乎专门产生饱和脂肪醇

将质粒pCL-Ptrc-carB_’tesA转化入ACL119A菌株。使ALC119A/pCL-Ptrc-carB_’tesA的三个转化体生长在3mL具有100mg/L大观霉素的L培养液中在37℃的摇床上过夜。将15μL的过夜培养物转移进2mL具有100mg/L大观霉素和2μL70％油酸钾的新鲜L培养液中。将新鲜的接种物置于37℃摇床中持续约3小时。然后将2mL培养物转移入125mL振荡培养瓶中的20mLV9培养基(不含氯化铁的Hu-9培养基)。当培养物的OD₆₀₀达到约0.9时，向各烧瓶加入1mM的IPTG。在37℃下生长20小时之后，向各烧瓶加入20mL的乙酸乙酯(具有1％的乙酸，v/v)提取发酵期间产生的脂肪醇。如WO2008/119082中所述，用GC/MS直接分析粗的乙酸乙酯提取物。鲸蜡醇被用作参照物用于脂肪醇的定量。

如图13所示，ALC119A/pCL-Ptrc-carB_’tesA菌株几乎专门产生饱和脂肪醇，包括十二烷醇、十四烷醇以及十六烷醇。

实施例6

蓝细菌聚球蓝细菌PCC7002中脂肪醇的产生

该实施例描述了使用carB-‘tesA-yahK通路，利用光合自养细菌从二氧化碳(而不是葡萄糖)产生脂肪醇。首先，使用对应于pAQ1的位置3301-3800和3801-4300的500bp的同源区构建了载体，用于聚球蓝细菌PCC7002质粒pAQ1(genbank登录号NC_0050525)中的同源重组。作为选择标记，将包含氨基糖苷3’腺苷转移酶、aad、启动子、基因和终止子(来自质粒pCL1920)的大观霉素抗性盒加到所述同源区之间。为了基因表达，添加氨基糖苷磷酸转移酶的启动子和核糖体结合位点aph(来自质粒pACYC177)，然后是用于插入异源基因或操纵子的独特的克隆位点NdeI和EcoRI。通过基因合成构建该完整的整合盒并且将其克隆入pUC19用于保持和递送。得到的质粒pLS9-7002允许(i)外源基因的克隆和表达，以及(ii)递送和体内稳定整合入聚球蓝细菌PCC7002质粒pAQ1。

按照下述构建用于聚球蓝细菌PCC7002中表达的脂肪醇通路。通过在‘tesA下游加入yahK并且然后克隆入aph启动子和核糖体结合位点下游的pLS9-7002NdeI和EcoRI位点，使carB-‘tesA操纵子从pCL-Ptrc-carB-‘tesA(如实施例4中所述)延长。按照Stevensetal.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:6052-6056(1980))所述，将得到的质粒转化入聚球蓝细菌PCC7002。在补充有15μg/mL大观霉素的ATCC1047培养基上选择稳定的整合体。1LATCC1047培养基包含40mgMgSO₄×7H₂O、20mgCaCl₂×2H₂O、750mgNaNO₃、2mgK₂HPO₄、3.0mg柠檬酸、3.0mg枸橼酸铁铵、0.5mgEDTA、20mgNa₂CO₃、2.86mgH₃BO₃、1.81mgMnCl₂、0.22mgZnSO₄、0.04mgNa₂MoO₄、0.08mgCuSO₄、0.05mgCo(NO₃)₂、0.02mg维生素B₁₂、10g琼脂以及750mL海水。将大观霉素抗性菌落在具有大观霉素的ATCC培养基1047上再画线若干次，并且通过使用引物pAQ1-U(atgtctgacaaggggtttgacccct)(SEQIDNO:224)和pAQ1-D(gcacatccttatccaattgctctag)(SEQIDNO:225)的PCR检测carB-‘tesA-yahK操纵子的同基因整合。然后，使完全同基因carB-‘tesA-yahK整合体生长在500mL摇瓶中的50mL具有大观霉素的液体ATCC1047培养基中，伴随适当的通气和光照，在30℃下培养五至七天。在不同时间点用等体积的乙酸乙酯提取培养物等份，并且按照实施例3中所述，分析提取物的脂肪醇产生。产生了脂肪醇。

实施例7

蓝细菌细长聚球蓝细菌(Synechococcuselongatus)PCC7942中脂肪醇的产生

该实施例描述了使用carB-‘tesA-yahK通路，利用光合自养细菌从二氧化碳(而不是葡萄糖)产生脂肪醇的第二种方法。首先，使用对应于CP_000100的位置2577844-2578659和2578660-2579467的800bp的同源区构建载体，用于细长聚球蓝细菌PCC7942基因组(genbank登录号CP_000100)中的同源重组。该染色体位置被称为中性位点1(NS1)(Mackeyetal.,Meth.Mol.Biol.362:115-129(2007))。作为选择标记，将包含氨基糖苷3’腺苷转移酶、aad、启动子、基因以及终止子(来自质粒pCL1920)的大观霉素抗性盒加入所述同源区之间。此外，添加独特的克隆位点NdeI和EcoRI，用于异源基因或操纵子的插入。通过基因合成构建该整合盒，并且克隆入pUC19用于保持和递送。得到的质粒pLS9-7942_NS1允许(i)外源基因的克隆和表达，和(ii)递送并体内稳定整合入细长聚球蓝细菌PCC7942基因组。

完整的carB-‘tesA-yahK操纵子(如实施例6中述)包括其ptrc启动子和核糖体结合位点，将该操纵子克隆入pLS9-7942_NS1的NdeI或EcoRI位点。按照Mackeyetal.,Meth.Mol.Biol.362:115-129(2007)中所述，将得到的质粒转化入细长聚球蓝细菌PCC7942。在补充有4μg/mL大观霉素的BG-11培养基上选择稳定整合体。1L的BG-11培养基包含75mgMgSO₄×7H₂O、36mgCaCl₂×2H₂O、1.5gNaNO₃、40mgK₂HPO₄、6.0mg柠檬酸、6.0mg枸橼酸铁铵、1.0mgEDTA、20mgNa₂CO₃、2.86mgH₃BO₃、1.81mgMnCl₂、0.22mgZnSO₄、0.04mgNa₂MoO₄、0.08mgCuSO₄、0.05mgCo(NO₃)₂以及10g琼脂。将大观霉素抗性菌落在具有大观霉素的BG-11培养基上再画线若干次，并且通过使用引物NS1-U(gatcaaacaggtgcagcagcaactt)(SEQIDNO:226)和NS1-D(attcttgacaagcgatcgcggtcac)(SEQIDNO:227)的PCR检测carB-‘tesA-yahK操纵子的同基因整合。然后使完全同基因carB-‘tesA-yahK整合体生长在500mL摇瓶中的50mL具有大观霉素的液体BG-11培养基中，伴随适当的通气和光照，在30℃下培养多至七天。在不同时间点用等体积的乙酸乙酯提取培养物等份，并且按照实施例3中所述，分析提取物的脂肪醇产生。产生了脂肪醇。

实施例8

大肠杆菌中不依赖丙二酰辅酶A的脂肪醇产生

诸如细小裸藻(Euglenagracilis)的某些原生生物能够进行不依赖丙二酰辅酶A的脂肪酸生物合成。该通路的生物合成结构位于线粒体中，并且被认为通过使用乙酰辅酶A作为启动以及延伸的底物来产生C₈至C₁₈脂肪酸而逆转β-氧化的方向(Inuietal.,Eur.J.Biochem.142:121-126(1984))。参与的酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶(TER)，其催化反式-2-烯酰基-辅酶A至酰基辅酶A的不可逆的还原，并且由此驱动还原方向的其它可逆途径(相反的确是β-氧化，其中不可逆的酰基辅酶A脱氢酶FadE驱动氧化方向的反应)。一个来自细小裸藻的TER基因以及其它真核和原核同系物是已知的(Hoffmeisteretal.,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005)；Tuccietal.,FEBSLett.581:1561-1566(2007))。唯一已知的来自细小裸藻的TER酶已经被证实能在体外将反式-2-丁烯酰基辅酶A(C4)和反式-2-已烯酰基辅酶A(C6)还原成对应的酰基辅酶A(未测试更长链的反式-2-烯酰基辅酶A)。目前，对细小裸藻中的其它通路酶所知极少。

可以使用不同组的具有以下四种酶活性的酶在大肠杆菌中进行基因工程，得到专门从酰基辅酶A前体到酰基辅酶A的通路(正如在细小裸藻线粒体中)：(i)非脱羧化缩合硫解酶、(ii)3-酮酰辅酶A还原酶(或3-羟酰辅酶A脱氢酶)、(iii)3-羟酰辅酶A水合酶(或烯酰辅酶A脱水酶)以及(iv)反式-2-烯酰辅酶A还原酶。全部四种酶可以具有充分宽松的链长特异性，从而允许合成较长链长度的酰基辅酶A，例如C₁₂或C₁₄。

按照以下构建编码全部四种活性的质粒。构建大肠杆菌fadA(YP_026272)(图17中显示为SEQIDNO:229)(非脱羧化硫解酶)和fadB(NP_418288)(图17中显示为SEQIDNO:231)(3-羟酰辅酶A脱氢酶和烯酰辅酶A脱水酶)和细小裸藻ter(Q5EU90)(图17中显示为SEQIDNO:228)(反式-2-烯酰辅酶A还原酶，密码子优化的，没有其编码转运肽的5'序列)的合成操纵子，并且将其克隆入具有羧苄西林或氯霉素抗性基因的pACYC质粒中，位于ptrc启动子的下游。或者，不使用大肠杆菌fadA和fadB基因，而使用大肠杆菌fadI(NP_416844)(图17中显示为SEQIDNO:223)和fadJ(NP_416843)(图17中显示为SEQIDNO:235)基因(或来自其它生物的相应直系同源物)。作为细小裸藻ter基因的替代方案，使用来自其它生物的直系同源物或大肠杆菌fadI(NP_415804)(图17中显示为SEQIDNO:237)基因。虽然FabI通常还原反式-2-烯酰-ACP，但是它也能作用于反式-2-烯酰辅酶A(Bergleretal.,J.Biol.Chem.269:5493-5496(1993))。

将pACYC-ptrc_fadAB-ter质粒或pACYC-ptrc_fadAB-fabI质粒与pCL-ptrc_carB-‘tesA质粒(如实施例4中所述)共转化入大肠杆菌ΔfadE菌株。按照实施例3中所述，将这些菌株培养、提取以及分析脂肪醇产生。两个不同的菌株产生具有不同链长分布的脂肪醇。

因为这些菌株表达‘TesA，所以产生的脂肪醇的一部分源自于丙二酰辅酶A依赖性酰基-ACP前体。虽然‘TesA在大肠杆菌过表达时能有效水解酰基-ACP，但是与酰基-ACP相比，‘TesA对酰基辅酶A具有更高的特异性活性。为了增加来源于不依赖丙二酰辅酶A的通路的脂肪醇的比例或专门产生来源于不依赖丙二酰辅酶A的通路的脂肪醇，使用具有对于酰基-ACP的较低水解活性的其它硫酯酶来代替‘TesA。一个实例是大肠杆菌TesB(NP_414986)，它偏向于酰基辅酶A超过酰基-ACP(Spenceretal.,J.Biol.Chem.253:5922-5926(1978))，并且在大肠杆菌中过表达时不会水解酰基ACP(Zhengetal.,App.Environ.Microbiol.70:3807-3813(2004))。在备选方法中，使用TesA和TesB的直系同源物或来自其它蛋白家族的高效水解酰基辅酶A而同时低效水解酰基-ACP的硫酯酶。

在一个方法中，如实施例4中所述，通过用tesB基因(NP_414986)(图17中显示为SEQIDNO:239)替代‘tesA基因来构建pCL-ptrc_carB-‘tesB质粒。将该质粒与pACYC-ptrc_fadAB-ter质粒或pACYC-ptrc_fadAB-fabI质粒共转化入大肠杆菌ΔfadE菌株。按照实施例3中所述，将这些菌株培养、提取以及分析脂肪醇产生。

在另一个方法中，用pCL-ptrc_acr1质粒替代pCL-ptrc_carB-‘tesA质粒，pCL-ptrc_acr1质粒表达来自AcinetobacterbaylyiADP1的酰基辅酶A还原酶Acr1(YP_047869)(图17中显示为SEQIDNO:241)。该还原酶特异性地将酰基辅酶A还原为对应的脂肪醇，而还原酰基-ACP(Reiseretal.,J.Bacteriol.179:2969-2975(1997))。将该质粒与pACYC-ptrc_fadAB-ter质粒或pACYC-ptrc_fadAB-fabI质粒共转化入大肠杆菌ΔfadE菌株。按照实施例3中所述，将这些菌株培养、提取以及分析脂肪醇产生。这些菌株不依赖丙二酰辅酶A而产生脂肪醇。

实施例9

铁被鉴定为脂肪醇产生的抑制剂

Hu9培养基是已知的发酵培养基，它包含6g/LNa₂HPO₄、3g/LKH₂PO₄、0.5g/LNaCl、1g/LNH₄Cl、0.1mMCaCl₂、1mMMgSO₄、15g/L琼脂、10mM葡萄糖、50mg/L尿嘧啶以及微量矿物质，所述微量矿物质包括100μMFeCl₃、500μMZnCl₂、200μMNa₂Mo₄、200μMCuSO₄、200μMH₃BO₃。然而，观察到当能够产生脂肪醇的重组大肠杆菌菌株生长在Hu9培养基中时，脂肪醇的产生大大减少。如在以下详述中所说明的，测量了大肠杆菌菌株在不同不完全Hu9培养基中不能产生脂肪醇的程度，并且发现，当培养基中存在铁时，重组细菌不能产生脂肪醇。然而，添加铁并没有抑制细菌的生长。

为了鉴定参与脂肪醇产生抑制的组分，制备了不同形式的不完全Hu9培养基，其中一些缺乏非必需的成分，并且然后评价脂肪醇的产生。

在第一步中，制备了以下培养基：完全Hu9培养基、缺乏尿嘧啶的不完全Hu9培养基以及缺乏微量元素的不完全Hu9培养基。将K6细胞(携带编码CAR同系物carB以及pETDuet-1-‘tesA的pACYCDuet-1-carB的重组细菌菌株C41(DE3，ΔfadE))培养在2mL含有适当抗生素的LB中。OD达到1.0之后，在125mL摇瓶(包含上述Hu9培养基中的一种)中将2mL培养物按比例扩大到22mL体积。通过添加终浓度1mM的IPTG诱导培养物。在37℃下生长20小时之后，向各烧瓶加入22mL乙酸乙酯(具有1％的乙酸，v/v)以提取发酵期间产生的脂肪醇。用GC/MS直接分析粗的乙酸乙酯提取物，并且对总的脂肪醇滴度进行定量。

如图14中所示，与向不完全Hu9培养基加入尿嘧啶相比，加入微量元素很大程度地抑制了脂肪醇产生。这表明抑制组分是微量矿物质溶液的一部分。

为了找出哪种微量元素引起脂肪醇产生抑制，制备了以下Hu9培养基：完全Hu9培养基；缺乏FeCl₃的Hu9；缺乏ZnCl₂的Hu9；缺乏Na₂Mo₄的Hu9；缺乏CuSO₄的Hu9；以及缺乏H₃BO₃的Hu9。使用上文所述的方法，评价这些不同的Hu9培养基中生长的K6细胞的脂肪醇产生。

如图14B所示，主要是向培养基中加入铁抑制了脂肪醇产生。因此，通过消除或减少培养基中铁的存在(例如柠檬酸铁、三氯化铁或硫酸亚铁)，可以产生脂肪醇。

优选实施方式：

1.产生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码多肽的基因，并且从所述宿主细胞中分离所述脂肪醇，所述多肽包含与SEQIDNO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、264、266、268、270或272的氨基酸序列具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列。

2.如项目1所述的方法，还包括修饰所述宿主细胞中编码脂肪酸合酶的基因的表达。

3.如项目2所述的方法，其中修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在所述宿主细胞中表达编码硫酯酶的基因。

4.如项目1所述的方法，还包括在所述宿主细胞中表达编码醇脱氢酶的基因。

5.如项目4所述的方法，其中所述醇脱氢酶包含与SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列具有至少80％的序列一致性的氨基酸序列。

6.如项目1所述的方法，其中将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于野生型宿主细胞的降低水平的脂肪酸降解酶。

7.如项目6所述的方法，其中所述脂肪酸降解酶是酰基辅酶A合酶。

8.产生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码多肽的基因，并且从所述宿主细胞中分离所述脂肪醇，所述多肽包含与SEQIDNO:16的氨基酸序列具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列。

9.如项目8所述的方法，还包括修饰所述宿主细胞中编码脂肪酸合酶的基因的表达。

10.如项目9所述的方法，其中修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在所述宿主细胞中表达编码硫酯酶的基因。

11.如项目8所述的方法，还包括在所述宿主细胞中表达编码醇脱氢酶的基因。

12.如项目11所述的方法，其中所述醇脱氢酶包含与SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列。

13.如项目8所述的方法，其中将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于野生型宿主细胞的降低水平的脂肪酸降解酶。

14.如项目13所述的方法，其中所述脂肪酸降解酶是酰基辅酶A合酶。

15.产生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达重组载体，并且从所述宿主细胞中分离所述脂肪醇，所述重组载体包含与SEQIDNO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、263、265、267、269或271的核苷酸序列具有至少约80％的序列一致性的核苷酸序列。

16.如项目15所述的方法，还包括修饰所述宿主细胞中编码脂肪酸合酶的基因的表达。

17.如项目15所述的方法，其中修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在所述宿主细胞中表达编码硫酯酶的基因。

18.如项目15所述的方法，还包括在所述宿主细胞中表达编码醇脱氢酶的基因。

19.如项目18所述的方法，其中所述醇脱氢酶包含与SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列具有至少80％的序列一致性的氨基酸序列。

20.如项目15所述的方法，其中将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于野生型宿主细胞的降低水平的脂肪酸降解酶。

21.如项目20所述的方法，其中所述脂肪酸降解酶是酰基辅酶A合酶。

22.产生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达重组载体，并且从所述宿主细胞中分离所述脂肪醇，所述重组载体包含与SEQIDNO:15的核苷酸序列具有至少约80％的序列一致性的核苷酸序列。

23.如项目22所述的方法，还包括修饰所述宿主细胞中编码脂肪酸合酶的基因的表达。

24.如项目23所述的方法，其中修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在所述宿主细胞中表达编码硫酯酶的基因。

25.如项目22所述的方法，还包括在所述宿主细胞中表达编码醇脱氢酶的基因。

26.如项目25所述的方法，其中所述醇脱氢酶包含与SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列具有约80％的序列一致性的氨基酸序列。

27.如项目22所述的方法，其中将所述宿主细胞进行基因工程，使其表达相对于野生型宿主细胞的降低水平的脂肪酸降解酶。

28.如项目27所述的方法，其中所述脂肪酸降解酶是酰基辅酶A合酶。

29.如项目1所述的方法，其中所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞以及细菌细胞。

30.如项目1所述的方法，其中所述脂肪醇分离自所述宿主细胞的细胞外环境。

31.如项目1所述的方法，其中所述脂肪醇包括C₆-C₂₆脂肪醇。

32.如项目31所述的方法，其中所述脂肪醇是C₆、C₈、C₁₀、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇或C₁₈脂肪醇。

33.如项目32所述的方法，其中羟基在伯位(C₁)。

34.如项目1所述的方法，其中所述脂肪醇是不饱和脂肪醇。

35.如项目34所述的方法，其中所述不饱和脂肪醇是C10:1、C12:1、C14:1、C16:1或C18:1。

36.如项目35所述的方法，其中所述脂肪醇在ω-7位置是不饱和的。

37.如项目34所述的方法，其中所述不饱和脂肪醇包括顺式双键。

38.如项目1所述的方法，其中所述脂肪醇是饱和脂肪醇。

39.如项目1所述的方法，还包括在所述多肽的至少一种生物底物的存在下培养所述宿主细胞。

40.如项目39所述的方法，其中所述底物是脂肪酸。

41.如项目40所述的方法，其中所述脂肪酸包括C₆-C₂₆脂肪酸。

42.如项目40所述的方法，其中所述脂肪酸是C₆、C₈、C₁₀、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇或C₁₈脂肪酸。

43.如项目40所述的方法，其中所述脂肪酸是不饱和脂肪酸。

44.如项目40所述的方法，其中所述脂肪酸是饱和脂肪酸。

45.通过项目1所述的方法产生的脂肪醇。

46.包含项目45所述的脂肪醇的表面活性剂。

47.如项目46所述的表面活性剂，其中所述脂肪醇的δ¹³C为约-15.4或更大。

48.如项目46所述的表面活性剂，其中所述脂肪醇的f_M ¹⁴C为至少约1.003。

49.产生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码多肽的基因，并且从所述宿主细胞中分离所述脂肪醇，所述多肽包含与SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192或194的氨基酸序列具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列。

50.产生脂肪醇的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达重组载体，并且从所述宿主细胞中分离所述脂肪醇，所述重组载体包含与SEQIDNO:93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191或193的核苷酸序列具有至少约80％的序列一致性的核苷酸序列。

其它实施方案

应理解的是，虽然已经详细描述了本发明，但以上的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围所限定。其它的方面、优点以及修改在以下权利要求的范围之内。

Claims

1.基因工程化以产生脂肪醇的细菌细胞，其包含：

编码具有EC3.1.2.14或EC3.1.1.5的硫酯酶活性的多肽的基因；和

编码具有羧酸还原酶(CAR)活性的多肽的基因，其中所述具有CAR活性的多肽是carA多肽、carB多肽或fadD9多肽。

2.权利要求1的细菌细胞，其中所述具有硫酯酶活性的多肽是由选自tesA、没有前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA和fatA1的基因编码的。

3.权利要求1的细菌细胞，其中所述具有硫酯酶活性的多肽是由tesA基因或没有前导序列的tesA基因编码的。

4.权利要求1的细菌细胞，其中所述carA多肽是由carA基因编码的。

5.权利要求1的细菌细胞，其中所述carB多肽是由carB基因编码的。

6.权利要求5的细菌细胞，其中所述carB基因是由SEQIDNO:22编码的。

7.权利要求1的细菌细胞，其中所述fadD9多肽是由fadD9基因编码的。

8.权利要求1的细菌细胞，其中所述细菌细胞进一步工程化以表达具有减弱的酰基辅酶A脱氢酶(FadE，EC1.3.99.3,1.3.99.-)活性的多肽。

9.权利要求1的细菌细胞，其中所述细菌细胞进一步工程化以表达具有缺失的或降低的酰基辅酶A脱氢酶(YdiO；EC1.3.99.-)活性的多肽。

10.权利要求1的细菌细胞，其中所述细菌细胞进一步工程化以表达具有缺失的或降低的3-酮酰基辅酶A硫解酶(FadA；EC2.3.1.16)活性的多肽。

11.权利要求1的细菌细胞，其中所述细菌细胞进一步工程化以表达具有缺失的或降低的FadB(EC4.2.1.17，EC5.1.2.3，EC5.3.3.8，EC1.1.1.35)活性的多肽。

12.权利要求1的细菌细胞，其中所述细菌细胞进一步工程化以表达具有缺失的或降低的β-酮酰基辅酶A硫解酶(FadI；EC2.3.1.16)活性的多肽。

13.权利要求1的细菌细胞，其中所述细菌细胞进一步工程化以表达具有缺失的或降低的差向异构酶(FadJ；EC5.1.2.3，EC4.2.1.17，EC1.1.1.35)活性的多肽。

14.权利要求1的细菌细胞，其中所述脂肪醇是C₆、C₈、C₁₀、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇或C₁₈脂肪醇。

15.权利要求1的细菌细胞，其中所述脂肪醇是含C₆-C₂₆脂肪醇。

16.权利要求1的细菌细胞，其中所述脂肪醇是饱和的或不饱和的。

17.权利要求16的细菌细胞，其中所述不饱和脂肪醇是C10:1、C12:1、C14:1、C16:1或C18:1。

18.权利要求1的细菌细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。