KR101149001B1 - 포도당을 보조기질로 이용할 수 있는 자일리톨 생산 균주 및 고생산성 발효 방법 - Google Patents

포도당을 보조기질로 이용할 수 있는 자일리톨 생산 균주 및 고생산성 발효 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포도당을 보조기질로 이용할 수 있는 자일리톨 생산 균주 및 고생산성 발효 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주인 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 EMP 경로에 결정적인 역할을 하는, 포도당인산이성질화효소(phosphoglucoseisomerase, pgi), 과당인산키나아제 1(phosphofructokinase 1, pfk1) 또는 과당인산키나아제 2(phosphofructokinase 2, pfk2) 유전자를 녹아웃시켜 상기 유전자가 녹아웃된 균주의 자일리톨 생산속도를 비교한 결과, 상기 pfk2 유전자의 이배체가 모두 녹아웃된 균주의 자일리톨 생산속도가 현저히 증가하였음을 확인함으로써, 자일리톨의 제조 수율 및 생산속도를 향상시킬 수 있는 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

포도당을 보조기질로 이용할 수 있는 자일리톨 생산 균주 및 고생산성 발효 방법{Xylitol producing-strain using the glucose as the co-substrate and high-producing fermentation methods using the same}
본 발명은 포도당을 보조기질로 이용할 수 있는 자일리톨 생산 균주 및 고생산성 발효 방법에 관한 것이다.
자일리톨(Xylitol)은 오탄당 당알코올로서 높은 감미도를 가지고 있어 설탕을 대체하는 기능성 감미료로 널리 이용되고 있다. 자일리톨은 감미도가 설탕과 비슷하지만, 체내 섭취 후의 대사과정이 인슐린과 무관하기 때문에, 당뇨병 환자의 설탕 대용 감미료로 사용되고 있다. 특히, 충치유발균인 스트렙토코커스 뮤탄트(Streptococcus mutans)의 생육을 억제하는 특성을 가지고 있어, 충치억제성분으로서도 산업적으로 널리 이용되고 있다.
이러한 자일리톨은 현재 옥수수속대, 사탕수수대와 같이 자일로스(xylose)가 많이 함유된 반섬유소(hemicellulose) 가수분해물을 화학적으로 환원시키는 방법으로 생산되고 있다. 그러나 화학적 방법은 자일로스를 아라비노스, 포도당과 같은 다른 오탄당 및 육탄당 구성물들로부터 분리 및 정제하기가 어렵고 비용이 많이 들며, 이 과정에서 자일로스의 회수율이 50 ~ 60% 정도로 낮다. 또한, 수소가스 및 니켈촉매를 이용한 고온, 고압의 공정이므로 위험성이 높고 폐기물이 많아서 환경적 문제가 존재한다는 단점이 있다.
근래에는 이러한 단점을 보완하기 위한 생물학적인 방법에 의한 자일리톨 생산방법이 활발하게 연구되고 있다. 생물학적인 방법은 화학적인 방법에 비해 원료물질로서 상대적으로 낮은 순도의 자일로스를 이용할 수 있고, 자일리톨 생산이 끝나면 자일로스가 완전히 소모되기 때문에 자일리톨을 분리 정제하는 과정이 간단해져 생산비용을 낮출 수 있으며, 공정 자체가 상온 및 상압에서 이루어지므로 안전하며 친환경적인 생산공정이다. 고생산성, 고수율의 자일리톨 생산을 위해 다양한 세균(bacteria)과 효모 균주(yeast and fungi), 재조합 효모(recombinant yeast)를 통한 자일리톨 생산 연구가 진행되었다(Winkelhausen, E. et al., J. Ferment. Bioeng. 86:1-14, 1998; Granstrom, T. B. et al., Appl . Microbiol . Biotechnol. 74:277-281, 2007). 그러나 세균과 재조합 효모 균주는 자일로스를 이용하는 대사경로가 약하거나 효율이 좋지 못해 산업적인 자일리톨의 생산에 적합하지 않았다. 지금까지 연구된 바에 의하면, 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis), 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 등의 캔디다 속 균주는 세포 외부에서 흡수된 자일로스를 자일로스 환원효소(xylose reductase)에 의해 자일리톨로 변환시키고, 이를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)에 의해 자일룰로스(xylulose)로 전환시키며, 자일룰로스는 다시 자일룰로스 인산화효소(xylulokinase)에 의해 오인산 자일룰로스(xylulose-5-phosphate)로 전환되고, 이는 계속해서 오탄당 인산화 과정(pentose phosphate pathway)를 통해 세포성장과 유지에 이용되는 것으로 알려져 있다(Laplace, J. M. et al., Appl . Microbiol . Biotechnol., 36:158-162, 1991; Hahn-Hagerdal, B. et al., Enzyme Microb . Technol ., 16:933-943, 1994). 이때, 자일로스 환원효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADPH; Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)를 보조인자(cofactor)로 이용하고, 자일리톨 탈수소효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(Nicotinamide adenine dinucleotide; NAD+)를 보조인자로 이용한다. 자일로스 환원효소에 의해 자일로스로부터 전환된 자일리톨은 다시 자일리톨 탈수소효소에 의해 자일룰로스로 전환되는데, 배지 내에 산소의 공급이 제한되어 용존산소의 농도가 0.5% 내지 2.0%로 낮게 유지되면 세포 내의 산화환원력 불균형(redox imbalance)이 유발되어 자일리톨 탈수소효소가 필요로 하는 보조인자(cofactor)인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)의 공급이 부족하게 되고, 자일리톨이 자일룰로스로 전환되는 과정이 억제된다. 그 결과로 자일리톨이 세포 및 배지에 축적되게 되어 50 ~ 60%의 수율로 자일로스로부터 자일리톨이 생산되는 것이다.
상기와 같이, 현재까지는 자일리톨의 제조 수율이 50 ~ 60% 정도에 불과하여, 보다 제조 수율을 향상시키려는 노력이 계속되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다. 따라서, 생물학적 방법으로 자일리톨의 제조 수율을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되고 있다.
이에, 본 연구진은 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 자일로스 환원효소를 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 고활성으로 발현시키기 위하여 유전자 부호 최적화(codon optimization)을 수행하여 최적화된 자일로스 환원효소를 획득하였고, 상기 최적화된 유전자를 발현시키기 위해, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터와 터미네이터 부분을 클로닝하였으며, 이들을 이용하여 발현 카세트를 제조하여 이를 이용해 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스(대한민국특허 제 10-0730315호)에 도입하여 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주를 제조하였다(대한민국특허 출원번호 10-2009-0135380 호). 이때, 자일로스 환원효소의 항구적인 발현으로 자일리톨을 생산하는 상기 균주에 있어서, 더욱 빠른 자일리톨 생산속도를 갖는 고효율의 새로운 균주를 개발해야 할 필요성을 지각하게 되었다.
이에, 본 발명자들은 자일로스 환원효소는 배지 첨가 물질인 자일로스를 자일리톨로 변환시키는 반응 과정에서 NADPH를 조효소로 사용한다는 점에 착안하여, 세포 내의 NADPH의 공급을 주요하게 담당하는 글루코스 대사 경로의 PP 대사 경로로의 물질 흐름을 증가시키기 위해 EMP 경로를 제거하기 위한 포도당인산이성질화효소(phosphoglucoseisomerase), 과당인산키나아제 1(phosphofructokinase 1) 및 과당인산키나아제 2(phosphofructokinase 2)의 녹아웃 카세트를 각각 제작함으로써, 상기 유전자가 여러 조합으로 녹아웃된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 균주가 자일리톨을 향상된 속도로 생산할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 포도당을 보조기질로 이용할 수 있는 자일리톨 생산균주 및 고생산성 발효방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 과당인산키나아제 1(phosphofructokinase 1, pfk1) 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk1 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk1 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk1 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 13으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 14로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 15로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트를 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주에 도입하여 제조된, 자일리톨 생산속도가 증진된 자일리톨 생산 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 자일로스 환원효소(xylose reductase)가 항구적으로 발현(constitutive expression)되는 자일리톨(xylitol) 생산 균주에 상기 유전자 컨스트럭트를 도입하여 pfk1 유전자 이배체를 녹아웃하는 단계;
2) 단계 1)의 pfk1 유전자의 이배체가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주를 기질 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
3) 배양된 균주로부터 자일리톨을 생산하는 단계; 및
4) 배양액으로부터 자일리톨을 분리하는 단계를 포함하는, 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주의 자일리톨 생산속도 증진 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주에 상기 유전자 컨스트럭트를 도입하여 pfk2 유전자의 이배체를 녹아웃하는 단계;
2) 단계 2)의 pfk2 유전자의 이배체가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주를 기질 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
3) 배양된 균주로부터 자일리톨을 생산하는 단계; 및
4) 배양액으로부터 자일리톨을 분리하는 단계를 포함하는, 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주의 자일리톨 생산속도 증진 방법을 제공한다.
본 발명은 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주인 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 EMP 경로에 결정적인 역할을 하는 과당인산키나아제 2(phosphofructokinase 2, pfk2) 유전자의 이배체가 모두 녹아웃된 균주가, 자일로스 환원효소만을 발현하는 균주에 비해 자일리톨 생산속도가 현저히 증가하였음을 확인함으로써, 상기 유전자를 제거하여 EMP 경로를 차단하는 것은 자일리톨의 제조 수율 및 생산속도를 향상시킬 수 있는 방법으로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글루코스 대사 경로를 나타낸 그림이다.
도 2는 포도당인산이성질화효소(phosphoglucoseisomerase, pgi)의 녹아웃을 위해 구축한 카세트를 나타낸 그림이다.
도 3은 pgi의 녹아웃카세트를 만들기 위한 4개 영역의 PCR 및 벡터로의 삽입을 나타낸 그림이다:
A: pgi 유전자의 250bp 정도의 4개의 영역;
B: pgi의 첫 번째 일배체에 대한 녹아웃카세트 벡터; 및
C: pgi의 두 번째 일배체에 대한 녹아웃카세트 벡터.
도 4는 상기 도 3의 벡터의 PCR을 나타낸 그림이다:
A: pgi의 첫 번째 일배체에 대한 녹아웃카세트 벡터의 PCR;
B: pgi의 두 번째 일배체에 대한 녹아웃카세트 벡터의 PCR;
C: T 벡터 및 pgi의 첫 번째 일배체에 대한 녹아웃카세트 부분을 포함하는 PCR 산물; 및
D: T 벡터 및 pgi의 두 번째 일배체에 대한 녹아웃카세트 부분을 포함하는 PCR 산물.
도 5는 blank - URA3 - blank 형태의 URA3 팝아웃 모듈을 나타낸 그림이다.
도 6은 URA3 팝아웃 모듈의 제작 과정을 나타낸 그림이다:
A: URA3 유전자가 있는 플라스미드 벡터에 순차적으로 상기 URA3 유전자의 왼쪽 및 오른쪽에 1.5kb 서열의 삽입; 및
B: 제한효소에 의해 절단된, URA3 유전자가 포함된 단편.
도 7은 pgi의 첫 번째 일배체에 대한 녹아웃카세트의 제조 과정을 나타낸 그림이다:
A: 도 4의 C와 도 6의 B 유전자 단편의 라이게인션(ligation); 및
B: 상기 두 단편의 라이게이션 산물.
도 8은 pgi의 첫 번째 일배체에 대한 녹아웃카세트를 나타낸 그림이다.
도 9는 pgi의 두 번째 일배체에 대한 녹아웃카세트의 제조 과정을 나타낸 그림이다:
A: 도 4의 D와 URA3 유전자 단편의 라이게인션(ligation); 및
B: 상기 두 단편의 라이게이션 산물.
도 10은 pgi의 두 번째 일배체에 대한 녹아웃카세트를 나타낸 그림이다.
도 11은 과당인산키나아제 1(phosphofructokinase alpha unit, pfk1)의 녹아웃을 위해 구축한 카세트를 나타낸 그림이다.
도 12는 과당인산키나아제 2(phosphofructokinase beta unit, pfk2)의 녹아웃을 위해 구축한 카세트를 나타낸 그림이다.
도 13는 pgi, pfk1 또는 pfk2 유전자가 여러 가지 조합으로 녹아웃된 균주에서 PCR을 통해 유전자 녹아웃을 확인한 그림이다.
도 14은 pgi, pfk1 또는 pfk2 유전자가 여러 가지 조합으로 녹아웃된 균주의 유전자형을 나타낸 그림이다.
도 15는 pfk1의 이배체가 녹아웃된 균주에서의 자일리톨 생산속도를 나타낸 그림이다.
도 16은 pfk2의 이배체가 녹아웃된 균주에서의 자일리톨 생산속도를 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 과당인산키나아제 1(phosphofructokinase alpha unit, pfk1) 또는 과당인산키나아제 2(phosphofructokinase beta unit, pfk2) 유전자 단편, 및 마커로서 사용되는 URA3 유전자를 포함하는, 캔디다 트로피칼리스에서 상기 유전자를 녹아웃할 수 있는 녹아웃카세트(유전자 컨스트럭트)를 제공한다.
pfk1의 첫 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk1 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 10으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk1 유전자 단편으로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
pfk1의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk1 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk1 유전자 단편으로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
pfk2의 첫 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 13으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 14로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편으로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
pfk2의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 15로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편으로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 하나의 실시태양에서는, 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주에 추가적으로 EMP 대사 경로를 제거하여 자일리톨 생산속도를 증진시킨 자일리톨 생산 균주를 제조하였다. 구체적으로, 상기 자일로스 환원효소가 자일로스를 자일리톨로 변환시키는 반응 과정에서 NADPH를 조효소로 사용한다는 것에 기초하여, 세포 내의 NADPH의 공급을 주요하게 담당하는 글루코스 대사 경로의 PP 경로로의 물질 흐름을 증가시키기 위해, 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주의 EMP 경로에 관여하는 유전자(pgi, pfk1 또는 pfk2)를 녹아웃하였다(도 1 참조). 이때, 상기 유전자를 녹아웃하기 위한 녹아웃카세트를 구축하여(도 2 내지 도 12 참조), 이를 세포 내로 도입함으로써 각 유전자가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주를 제조하였다(도 13 및 도 14 참조).
본 발명자들은 상기와 같이 제조한 EMP 경로에 관여하는 유전자가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주의 자일리톨 생산속도의 변화를 확인하기 위하여, pgi, pfk1 및 pfk2 유전자가 모두 발현되는 대조군 균주(L10_NXR), pfk1의 이배체가 모두 녹아웃된 균주(A12_KXR), pfk2의 이배체가 모두 녹아웃된 균주(B12_KXR)를 자일로스 및 글루코스가 함유된 배지에서 탄소원으로서 포도당을 첨가하여 유가식 배양을 통해 생산되는 자일리톨의 양을 측정하였다. 그 결과, 대조군에 비해 pfk 유전자를 녹아웃한 균주에서 자일리톨 생산속도가 증가하는 것을 확인하였고(도 15 및 도 16 참조), 특히, pfk2의 이배체가 모두 녹아웃된 균주의 자일리톨 생산속도가 가장 현저하게 증가된 것으로 나타났다(도 16 참조).
따라서, pfk1 또는 pfk2 유전자의 녹아웃카세트는, 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 균주의 자일리톨 생산속도의 증진을 위한 유전자 컨스트럭트로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트를 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주에 도입하여 제조된, 자일리톨 생산속도가 증진된 자일리톨 생산 균주를 제공한다.
상기 자일리톨 생산속도가 증진된 자일리톨 생산 균주는 상기 pfk1의 첫 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트 및 pfk1의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트를 도입하여 제조되는 것이 바람직하고, 상기 pfk2의 첫 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트 및 pfk2의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트를 도입하여 제조되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 자일리톨 생산속도가 증진된 자일리톨 생산 균주는 상기 pfk1의 첫 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트 및 pfk1의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트가 도입되어, 서열번호 1로 기재되는 pfk1 유전자의 이배체가 녹아웃된 것이 바람직하고, 상기 pfk2의 첫 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트 및 pfk2의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트가 도입되어, 서열번호 2로 기재되는 pfk2 유전자의 이배체가 녹아웃된 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)인 것이 바람직하고, 본 발명자들에 의해 이전 문헌(대한민국특허 출원번호 10-2009-0135380호)에 기재된, 자일리톨 탈수소효소가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 균주(기탁번호: KCTC 11137bp)를 이용하여 제조한, 자일리톨 생산 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 자일리톨을 생산할 수 있는 균주이면 어느 것이든지 사용가능하다.
자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주에 pfk1 또는 pfk2 녹아웃카세트를 도입하여 제조한, 상기 유전자가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주는 자일로스 환원효소만을 발현하는 균주에 비해 자일리톨 생산속도가 현저히 증가하였고, 특히 pfk2 유전자가 녹아웃된 균주에서 현저히 증가한 자일리톨 생산속도를 확인함으로써, 자일리톨의 제조 수율 및 생산속도를 향상시킬 수 있는 균주로서 유용하게 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 유전자 컨스트럭트를 이용하여, 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주의 자일리톨 생산속도 증진 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 자일리톨 생산속도 증진 방법은 하기의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 자일로스 환원효소(xylose reductase)가 항구적으로 발현(constitutive expression)되는 자일리톨(xylitol) 생산 균주에, 상기 pfk1의 첫 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트 및 pfk1의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트를 도입하여 pfk1 유전자의 이배체를 녹아웃하는 단계;
2) 상기 pfk1 유전자의 이배체의 녹아웃 여부를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 확인된, pfk1 유전자의 이배체가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주를 기질 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
4) 배양된 균주로부터 자일리톨을 생산하는 단계; 및
5) 배양액으로부터 자일리톨을 분리하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고,
1) 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주에 상기 pfk2의 첫 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트 및 pfk2의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트를 도입하여 pfk2 유전자의 이배체를 녹아웃하는 단계;
2) 상기 pfk2 유전자의 이배체의 녹아웃 여부를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 확인된, pfk2 유전자의 이배체가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주를 기질 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
4) 배양된 균주로부터 자일리톨을 생산하는 단계; 및
5) 배양액으로부터 자일리톨을 분리하는 단계를 포함하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)인 것이 바람직하고, 상기 캔디다 트로피칼리스 균주는 기탁번호 KCTC 11137bp로 기재되는 균주를 이용하여 본 발명자들에 의해 이전 문헌(대한민국특허 출원번호 10-2009-0135380호)에서 제조한, 자일리톨 생산 균주인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 이배체의 녹아웃 여부의 확인은 PCR 또는 유전자 염기서열분석으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 기질은 자일로스 환원효소의 기질인 자일로스 및 글루코스인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 탄소원은 포도당인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 균주 배양에 사용되는 모든 탄소원이 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 배양은 25시간 이상 배양하는 것이 바람직하며, 40 ~ 60시간 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주인 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 EMP 경로에 결정적인 역할을 하는 pfk1 또는 pfk2 유전자의 녹아웃카세트를 제조하여, 이를 이용하여 상기 유전자의 이배체가 모두 녹아웃된 균주를 각각 제조하였고, 이와 같이 제조한 균주는 자일로스 환원효소만을 발현하는 균주에 비해 자일리톨 생산속도가 현저히 증가하였음을 확인함으로써, 상기 유전자를 제거하여 EMP 경로를 차단하는 것은 자일리톨의 제조 수율 및 생산속도를 향상시킬 수 있는 방법으로서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
EMP 경로를 제거하기 위한 유전자의 선별
캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글루코스 대사 경로에 있어서, NADPH 생성에 관련된 PP 경로로의 물질 흐름을 증가시키기 위하여, 대사 경로를 탐색하여 EMP 경로의 녹아웃을 위한 두 종류의 유전자를 선별하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 과당인산키나아제 1(phosphofructokinase 1, pfk1), 과당인산키나아제 2(phosphofructokinase 2, pfk2) 및 포도당인산이성질화효소(phosphoglucoseisomerase, pgi) 유전자를 선정하였다.
캔디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis ) 유전체로부터 포도당인산이성질화효소( phosphoglucoseisomerase ), 과당인산키나아제 1( phosphofructokinase 1) 및 과당 인산키나아제 2(phosphofructokinase 2) 유전자 서열 분석
자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 변이주 BSXDH3(I1)는 서열 전체가 밝혀져 있지 않아서 표적이 되는 유전자 서열을 밝히는 일을 우선 수행하였다. 원하는 유전자 서열을 얻기 위해 유연종의 해당 유전자 서열을 바탕으로 프라이머를 제작하여 PCR을 통해 서열을 증폭한 후, 시퀀스 분석을 통해 서열을 분석하였다. C. tropicalis의 포도당인산이성질화효소(phosphoglucoseisomerase, pgi), 과당인산키나아제 1(phosphofructokinase 1, pfk1) 및 과당인산키나아제 2(phosphofructokinase 2, pfk2) 유전자의 서열을 C. albican , P. stipitis , S. cerevisiae 등 유연종의 유전자 데이터베이스를 바탕으로 프라이머 제작 및 PCR, 서열분석으로 확보하였다. 구체적으로, 하기 표 1의 각각의 프라이머를 상기 유연종 간에 유전자 상동성이 높은 부위를 선택하여 제작하였으며, 상기 PCR은 칸디다 트로피칼리스의 게놈 DNA를 주형으로 하여 10×완충용액(MgCl2), 2.5 mM dNTPs, 10× MgCl2, Taq DNA 중합효소(Stratagene, 미국) 및 각각의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 4분, 94℃에서 1분간 변성, 58.1℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장의 조건으로 25회 반복한 다음, 72℃에서 5분 동안 최후신장을 수행하는 조건으로 수행하였다. 상기 PCR을 통해 수득한 각 유전자의 PCR 산물 및 pcDNA3.1 벡터(invitrogen, 미국)를 EcoRI 및 HindⅢ 제한효소로 각각 절단한 후 정제하였다. 상기 정제한 벡터 및 PCR 산물을 약 100 ng씩 사용하여, Roche 사의 리가아제(ligase) 1 unit을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션(ligation) 반응 후 XL1-Blue(Stratagene)에 형질전환하여 앰피실린이 함유된 플레이트에서 선별한 후 적절한 제한효소로 절단하여 원하는 DNA 절편이 든 플라스미드를 확보하였으며 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 최종적으로 상기 유전자의 서열을 확인하였으며, 이를 GenBank에 등록하였다(FJ380922; pgi, FJ380926; pfk1). 상기 과당인산키나아제 1(phosphofructokinase 1, pfk1) 유전자는 서열번호 1로, 과당인산키나아제 2(phosphofructokinase 2, pfk2) 유전자는 서열번호 2로, 포도당인산이성질화효소(phosphoglucoseisomerase, pgi) 유전자는 서열번호 3으로 기재하였다.
프라이머 이름 정방향/역방향 서열 서열번호
pgi
 정방향 tggtagttgctattgaatcgagggag 17
역방향 tagatgggctatacttgacacagcacatc 18
pfk1
 정방향 gaaggtacaattgcttgggcaggagg 19
역방향 ctaatgtacagctaacacatacaaacaactcc 20
pfk2
 정방향 gctgtcttaccagtggatggagg 21
역방향 cacccaaggagtattcagtacctgg 22
유전자 녹아웃카세트의 제조
<3-1> 포도당인산이성질화효소의 녹아웃카세트
이배체의 포도당인산이성질화효소를 녹아웃하기 위하여 URA3를 마커로 하는 카세트를 도 2에 나타낸 바와 같이 제조하였다(도 2). 구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 확보한 pgi의 서열에서 카세트를 만드는데 이용하기 위한 250 bp 정도의 영역 4곳을 선정하였다. 첫 번째 카세트와 두 번째 카세트를 만들기 위해 사용한 영역을 포함하도록 PCR을 한 후 벡터에 삽입하여(도 3), 상기 벡터를 PCR하였다(도 4). 또한, 1.7 kb 정도의 URA3 마커 유전자를 준비하였다.
첫 번째 일배체의 녹아웃카세트에서 URA3 유전자 영역을 팝아웃(상동성 재조합을 통한)하기 위해, 1.5 kb 정도의 의미 없는 시퀀스(발현되지 않는 부분, 단백질을 만들지 않는 부분)를 확보하였다. 이러한 팝아웃 방법을 이용한 균주에는 유전자의 녹아웃 후 1.5 kb 정도의 의미 없는 시퀀스가 유전자상에 남아있게 되기 때문에 후에 이 균주를 산업적으로 사용할 시 문제가 되는 것을 방지하기 위해 안전하다고 알려진 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis){GRAS(Generally Recognized As Safe) organism}의 아미노산 생합성 오페론 서열의 일부를 PCR을 통해 제조하였다(트립토판, 트레오닌, 아르기닌, 글루타민산, 류신의 영역). 상기 제조한 1.5 kb의 서열과 URA3 유전자를 이용하여 URA3 팝아웃 모듈을 완성하였다(blank - URA3 - blank 형태)(도 5). 구체적으로, 상기 URA3 팝아웃 모듈은 하기와 같은 방법으로 제조하였다. 3 kb의 플라스미드 벡터에 1.7 kb URA3 유전자가 존재하고, 순차적으로 URA3 유전자의 왼쪽 및 오른쪽에 1.5 kb의 서열을 삽입하였다(도 6). 그런 다음, 도 4의 C와 도 6의 B의 두 단편을 라이게이션(ligation)하여 첫 번째 일배체의 녹아웃벡터를 제조하였고(도 7), 상기 벡터를 Sma Ⅰ 효소로 절단하여 첫 번째 일배체의 녹아웃카세트를 제조하였다(도 8). 또한, 도 4의 D와 UR3 유전자의 두 단편을 라이게이션하여 두 번째 일배체의 녹아웃벡터를 제조하였고(도 9), 상기 벡터를 Dra Ⅰ 효소로 절단하여 두 번째 일배체의 녹아웃카세트를 제조하였다(도 10).
<3-2> 과당인산키나아제 1의 녹아웃카세트
상기 실시예 <3-1>과 같은 방법으로 과당인산키나아제 1의 녹아웃을 위하여 URA3를 마커로 하는 카세트를 제조하였다(도 11).
<3-3> 과당인산키나아제 2의 녹아웃카세트
상기 실시예 <3-1>과 같은 방법으로 과당인산키나아제 2의 녹아웃을 위하여 URA3를 마커로 하는 카세트를 제조하였다(도 12).
<4-1> 녹아웃카세트를 이용한 캔디다 트로피칼리스( Candida tropicalis )의 유전자 녹아웃
상기 <실시예 3>에서 제조한 각각의 유전자 녹아웃카세트를 여러 가지 조합으로, 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주인 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)(대한민국특허 출원번호 10-2009-0135380 호)에 처리하여 포도당인산이성질화효소, 과당인산키나아제 1 및/또는 과당인산키나아제 2가 녹아웃된 균주를 제조하였다. 구체적으로, 상기 <실시예 3>에서 제조된 선형의 녹아웃카세트를 잘 알려진 효모의 유전자도입법인(YEAST TRANSFORMATION-LIAC METHOD) 리튬아세테이트법을 이용하여 캔디다 트로피칼리스 변이주 BSXDH-3(기탁번호: KCTC 11137bp)에 도입하였고, 이를 우라실(Uracil)이 결핍된 선별용 고체배지(효모 질소 베이스(무아미노산) 6.7 g/ℓ, 포도당 20 g/ℓ, 한천 가루 20 g/ℓ)에 도말한 후 30℃에서 2일간 정치 배양하였다. 우라실 결핍 배지에서 생존한 균주들을 대상으로 PCR을 수행하였으며 상기의 카세트들이 유전체에 정상적으로 삽입된 균주를 선별하여 캔디다 트로피칼리스 변이주들을 수득하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, I1 및 L10_NXR 균주는 pgi, pfk1, 및 pfk2가 모두 발현되는 것으로 나타났고, B21_NXR 균주는 pfk2 이배체가 모두 녹아웃된 것으로 나타났으며, G12B1A12_NXR 균주는 이배체의 pfk1과 일배체의 pfk2가 녹아웃된 것으로 확인되었으며(도 13), 도 14에 나타낸 바와 같이, 각 균주는 여러 가지 조합의 녹아웃카세트를 통하여 각각의 유전자형(genotype)을 나타냈다(도 14).
유전자 녹아웃 캔디다 트로피칼리스의 자일리톨 생산속도의 확인
상기 <실시예 4>에서 유전자형을 확인한, L10_NXR, A12_NXR 및 B12_NXR 균주의 자일리톨 생산속도를 비교하기 위하여, 자일로스 50 g/ℓ, 글루코스 20 g/ℓ, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/ℓ, 황산마그네슘(MgSO4?7H2O) 0.2 g/ℓ 및 효모추출물 10 g/ℓ가 포함된 배지에서 30℃, 200 rpm에 50시간 동안 배양하였다. 이때, 탄소원으로는 포도당 1.25 g/ℓ를 배양 후 13시간 뒤부터 1시간 간격으로 총 8회 첨가하였다.
그 결과, 도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, pgi, pfk1 및 pfk2를 모두 발현하는 대조군으로서의 L10_NXR 균주에 비해, pfk1 이배체가 녹아웃된 균주인 A12_NXR, 또는 pfk2 이배체가 녹아웃된 균주인 B12_NXR 균주의 자일리톨 생산속도가 증가된 것을 확인하였고(도 15), 특히, pfk2 이배체가 녹아웃되어 제거된 균주가 가장 효과적인 자일리톨 생산성을 나타내고 생산속도가 가장 증가한 것으로 확인되었다(도 16).
상기와 같이, 과당인산키나아제 유전자를 녹아웃시켜, 자일로스 환원효소를 생산하는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 EMP 회로를 차단함으로써 상기 균주의 자일리톨 생산속도가 증가되었으므로, 생산성이 향상된 고수율의 자일리톨 생산에 유용하게 사용할 수 있다.
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Claims (14)

  1. 삭제
  2. 삭제
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  5. 서열번호 2로 기재되는 pfk2 유전자의 이배체가 녹아웃된 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산속도가 증진된 자일리톨 생산 균주.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 자일리톨 생산속도가 증진된 자일리톨 생산 균주는 서열번호 13으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 14로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트, 및 서열번호 15로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트를 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주에 도입하여 제조된 것을 특징으로 하는 균주.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 5항에 있어서, 상기 자일리톨 생산속도가 증진된 자일리톨 생산 균주는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)인 것을 특징으로 하는 균주.
  10. 1) 자일로스 환원효소(xylose reductase)가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주에 서열번호 2로 기재되는 pfk2 유전자의 이배체를 녹아웃하는 단계;
    2) 단계 1)의 pfk2 유전자 이배체가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주를 기질 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
    3) 배양된 균주로부터 자일리톨(xylitol)을 생산하는 단계; 및
    4) 배양액으로부터 자일리톨을 분리하는 단계를 포함하는, 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주의 자일리톨 생산속도 증진 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 단계 1)에서 pfk2 유전자의 이배체의 녹아웃은 서열번호 13으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 14로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트, 및 서열번호 15로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편, 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 pfk2 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트를 상기 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주에 도입하는 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산속도 증진 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 단계 1)의 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)인 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산속도 증진 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 단계 2)의 기질은 자일로스 및 글루코스인 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산속도 증진 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 단계 2)의 탄소원은 포도당인 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산속도 증진 방법.
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