KR20110078548A - 자일로스 환원효소의 항구적 발현을 이용한 고생산성 자일리톨 생산방법 - Google Patents

자일로스 환원효소의 항구적 발현을 이용한 고생산성 자일리톨 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자일로스 환원효소(xylose reductase)가 항구적으로 발현(constitutive expression)되는 자일리톨 생산균주를 이용하여 포도당을 탄소원으로 하는 배지에서 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 자일로스 환원효소를 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 고활성으로 발현시키기 위하여 유전자 부호 최적화(codon optimization)을 수행하여 획득한 최적화된 자일로스 환원효소; 최적화된 유전자를 발현시키기 위해, 클로닝된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터와 터미네이터 부분; 및 선별마커인 URA3가 포함된 발현벡터, 상기 발현벡터를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스에 도입하여 제조된 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산균주, 및 상기 균주를 유가식 배양을 통해 탄소원인 포도당의 억제를 받지 않고 자일리톨을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 자일로스 환원효소의 항구적 고발현을 통한 자일리톨 생산방법은 포도당을 보조기질로 사용하여 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
자일로스 환원효소, 자일리톨, 항구적 발현, 캔디다 트로피칼리스.

Description

자일로스 환원효소의 항구적 발현을 이용한 고수율 자일리톨 생산방법{A mass―production method of xylitol using constitutive expression of xylose reductase}
본 발명은 자일로스 환원효소(xylose reductase)의 항구적 발현(constitutive expression)을 이용한 고수율 자일리톨 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산균주를 이용하여 포도당을 탄소원으로 하는 배지에서 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
자일리톨(xylitol)은 오탄당 당알코올로서 높은 감미도를 가지고 있어 설탕을 대체하는 기능성 감미료로 널리 이용되고 있다. 자일리톨은 감미도가 설탕과 비슷하지만, 체내 섭취 후의 대사과정이 인슐린과 무관하기 때문에, 당뇨병 환자의 설탕 대용 감미료로 사용되고 있다. 특히, 충치유발균인 스트렙토코커스 뮤탄트(Streptococcus mutans)의 생육을 억제하는 특성을 가지고 있어, 충치억제성분으 로서도 산업적으로 널리 이용되고 있다.
이러한 자일리톨은 현재 옥수수속대, 사탕수수대와 같이 자일로스(xylose)가 많이 함유된 반섬유소(hemicellulose) 가수분해물을 화학적으로 환원시키는 방법으로 생산되고 있다. 그러나 화학적 방법은 자일로스를 아라비노스, 포도당과 같은 다른 오탄당 및 육탄당 구성물들로부터 분리 및 정제하기가 어렵고 비용이 많이 들며, 이 과정에서 자일로스의 회수율이 50 ~ 60% 정도로 낮다. 또한, 수소가스 및 니켈촉매를 이용한 고온, 고압의 공정이므로 위험성과 환경적 문제가 존재한다는 단점이 있다.
근래에는 이러한 단점을 보완하기 위한 생물학적인 방법에 의한 자일리톨 생산방법이 활발하게 연구되고 있다. 생물학적인 방법은 화학적인 방법에 비해 원료물질로서 상대적으로 낮은 순도의 자일로스를 이용할 수 있고, 공정 자체가 상온 및 상압에서 이루어지므로 안전하며 친환경적인 생산공정이다. 그리하여 고생산성, 고수율의 자일리톨 생산을 위해 다양한 세균(bacteria)과 효모 균주(yeast and fungi), 재조합 효모(recombinant yeast)를 통한 자일리톨 생산 연구가 진행되었다(Winkelhausen, E. et al., J. Ferment. Bioeng. 86:1-14, 1998; Granstrom, T. B. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 74:277-281, 2007). 그러나 세균과 재조합 효모 균주는 자일로스를 이용하는 대사경로가 약하거나 효율이 좋지 못해 산업적인 자일리톨의 생산에 적합하지 않았다. 하지만 효모 균주 중 캔디다 속(Candida sp.) 균주들은 다른 미생물에 비해 자일로스를 이용하는 능력이 뛰어나기 때문에, 자일리톨의 생산성과 수율이 높아 생물학적 자일리톨 생산에 적합한 균 주로 알려져 있다.
지금까지 연구된 바에 의하면, 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis), 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 등의 캔디다 속 균주는 세포 외부에서 흡수된 자일로스를 자일로스 환원효소(xylose reductase)에 의해 자일리톨로 변환시키고, 이를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)에 의해 자일룰로스(xylulose)로 전환시키며, 자일룰로스는 다시 자일룰로스 인산화효소(xylulokinase)에 의해 오인산 자일룰로스(xylulose-5-phosphate)로 전환되고, 이는 계속해서 오탄당 인산화 과정(pentose phosphate pathway)를 통해 세포성장과 유지에 이용되는 것으로 알려져 있다(Laplace, J. M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36:158-162, 1991; Hahn-Hagerdal, B. et al., Enzyme Microb. Technol., 16:933-943, 1994).
이때, 자일로스 환원효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADPH; Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)를 보조인자(cofactor)로 이용하고, 자일리톨 탈수소효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(Nicotinamide adenine dinucleotide; NAD+)를 보조인자로 이용한다. 자일로스 환원효소에 의해 자일로스로부터 전환된 자일리톨은 다시 자일리톨 탈수소효소에 의해 자일룰로스로 전환되는데, 배지 내에 산소의 공급이 제한되어 용존산소의 농도가 0.5% 내지 2.0%로 낮게 유지되면 세포 내의 산화환원력 불균형(redox imbalance)이 유발되어 자일리톨 탈수소효소가 필요로 하는 보조인자(cofactor)인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)의 공급이 부족하게 되고, 자일리톨이 자일룰로스로 전환되는 과정이 억제된다. 그 결과로 자일리톨이 세포 및 배지에 축적되게 되어 50~60%의 수율로 자일로스로부터 자일리톨이 생산되는 것이다. 즉, 자일리톨 생산 균주를 이용하여 자일리톨을 생산하는 종래의 기술에서는 산소공급을 제한(limited aeration)함으로써 낮은 용존산소 농도로 조절하는 것이 필수적이다. 그리하여 배지 내의 산소공급을 제한하여 용존산소농도를 낮게 유지시켜 세포 내의 산화환원력 불균형을 의도적으로 유발시킴으로써 자일리톨의 생산성과 수율을 높이는 연구가 활발히 이루어졌다(Kim, S. Y. et. al., J. Ferment. Bioeng., 83(3):267-270, 1997; 대한민국특허 제1996-030577호).
대한민국특허 제10-0169061호에 따르면 농축된 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis) 균주를 이용해 용존산소(dissolved oxygen)농도를 0.8 % 내지 1.2 %로 조절하여 자일리톨을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 하지만, 산업적 규모의 대용량 발효기를 이용하여 자일리톨을 생산할 경우 용존산소 농도를 위와 같이 낮게 조절하는 것은 사실상 불가능하며, 설사 조절할 수 있다 하더라도 제조수율이 50 ~ 60 % 정도에 불과하다. 또한, 대한민국특허 제10-0259470호에서, 1% 미만의 DOT(배지내 산소농도를 백분율로 나타낸 수치)로 배지 산소조건을 조절하기 위한 교반속도를 제시하고 있듯이 공정상의 번거로움이 존재한다. 그리고, 대한민국특허출원 제95-37516호에는 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis)의 자연종으로부터 유발시킨 돌연변이종을 이용한 자일리톨 생산방법에서 배지 내 산소분압의 조절에 의한 자일리톨 최적화에 관하여 개시된 바 있으며, 대한민국특허출원 제 95-13638호에는 상기 돌연변이주의 자일리톨의 생산을 위한 최적 배지 및 배양조건에 관하여 개시된 바 있으나, 이러한 최적의 조건에서도 자일리톨 수율은 70%를 넘지 못하였다.
이에, 본 연구팀은 캔디다 속 균주에서 생성된 자일리톨이 자일리톨 탈수소효소에 의해서 다시 자일룰로스로 전환되어 감소된다는 점에 착안하여, 자일리톨 탈수소효소의 활성을 완전히 불활성화시킨 캔디다 트로피칼리스 변이주를 개발하였다(대한민국특허 제 10-0730315호). 이전까지는 자일리톨을 자일룰로스로 전환시키는 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)의 작용억제를 위해, 세포 내의 산화환원력 불균형을 유발시키기 위한 배지 내의 산소공급제한이 필요했지만, 자일리톨 탈수소효소의 활성이 완전히 불활화된 변이주는 자일로스로부터 생산된 자일리톨이 더 이상 세포성장에 이용되지 못하게 하여, 산화환원력 불균형 유발의 필요성이 없다. 이런 방법으로 97% 내지 98%의 수율로 자일로스를 자일리톨로 생물전환할 수 있다.
하지만, 자일리톨 탈수소효소가 불활성화된 변이주는 자일로스를 세포 성장 및 보조인자인 니코틴아미드 아데딘 디뉴클레이티드 인산(NADPH)의 재생성에 이용할 수 없기 때문에, 이를 위한 보조기질이 필요하다. 보조기질로 사용할 수 있는 탄소원 후보 중, 포도당이 가격이 낮을 뿐만 아니라, 생산 원료가 되는 반섬유소(hemicellulose) 가수분해물이 자체적으로 5 ~ 7%의 포도당을 함유하고 있기 때문에 자일리톨 생산에 가장 적합하다고 할 수 있다. 그러나 배지에 포함된 포도당 은 이화대사산물 억제작용(catabolic repression)에 의하여 자일로스 환원효소 합성을 저해하게 되며, 결과적으로 자일리톨 생산을 감소시키게 된다. 따라서 포도당의 자일로스 환원효소에 대한 이화대사산물 억제작용을 제거한 새로운 생산균주를 개발해야 할 필요성이 있다.
이에, 본 발명자들은 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 자일로스 환원효소를 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 고활성으로 발현시키기 위하여 유전자 부호 최적화(codon optimization)을 수행하여 최적화된 자일로스 환원효소를 획득하였고, 상기 최적화된 유전자를 발현시키기 위해, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터와 터미네이터 부분을 클로닝하였으며, 이들을 이용하여 발현 카세트를 제조하였으며, 상기 발현 카세트를 이용하여 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스에 도입하여 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산균주를 제조함으로써, 탄소원인 포도당의 억제를 받지 않고 자일리톨을 고수율, 고생산성으로 생산할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 최적화된 자일로스 환원효소(xylose reductase)가 항구적으로 발현(constitutive expression)되도록 제작된 유전자 컨스트럭트, 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산균주를 이용하여 포도당을 탄소원으로 하는 배지에서 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 자일로스 환원효소를 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 고활성으로 발현시키기 위하여 유전자 부호 최적화(codon optimization)를 수행하여 획득한 최적화된 자일로스 환원효소; 및
상기 최적화된 유전자를 발현시키기 위해 클로닝된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터 및 터미네이터 부분;을 포함하는 캔디다 트로피칼리스에서 발현할 수 있는 발현카세트(유전자 컨스트럭트)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트를 1개 또는 2개 이상 포함된 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 균주에 도입하여 제조된, 자일로스 환원효소(xylose reductase)가 항구적으로 발현(constitutive expression)되는 자일리톨 생산 균주를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산균주를 이용하여 포도당을 탄소원으로 하는 배지에서 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 자일리톨 생산방법은 포도당을 보조기질로 사용하여 자일리톨을 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 상기 방법은 기존의 자일로스 환원효소의 항구적 고발현 변이주를 이용한 자일리톨 생산방법에 비해 15% 내지 35% 이상의 자일리톨 생산성 증가를 야기하는 것을 확인함으로써, 고수율 및 고생산성으로 자일리톨을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 자일로스 환원효소를 캔디다 트로 피칼리스(Candida tropicalis)에서 고활성으로 발현시키기 위하여 유전자 부호 최적화(codon optimization)를 수행하여 획득한 최적화된 자일로스 환원효소; 및
상기 최적화된 유전자를 발현시키기 위해, 클로닝된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터 및 터미네이터 부분;을 포함하는 캔디다 트로피칼리스에서 발현할 수 있는 발현카세트(유전자 컨스트럭트)를 제공한다(도 2 참조).
본 발명에 따른 유전자 컨스트럭트에 있어서, 상기 최적화된 자일로스 환원효소는 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시태양에서는, 상기 최적화된 자일로스 환원효소를 제조하기 위해, Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)의 데이터를 이용하여, 뉴로스포라 크라사의 자일로스 환원효소의 유전자 코돈을 캔디다 트로피칼리스가 선호하는 코돈으로 교체하여 유전자 DNA를 합성하였다. 이런 유전자 부호 최적화(codon optimization)는 상기 특정 데이터 뿐만 아니라 공지된 다양한 데이터베이스를 이용하여 수행할 수 있는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
본 발명에 따른 유전자 컨스트럭트에 있어서, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터 및 터미네이터 부분은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시태양에서는, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터와 터미네이터 부분을 클로닝하였으며, 프로모터 길이에 따른 발현 강도를 분석한 결과, 고활성의 발현을 위해서는 최소한 1000bp 이상의 프로모터 부분이 있어야 80% 이상의 발현이 가능하다는 것이 확인하였다(표 2 및 도 3 참조).
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 유전자 컨스트럭트를 1개 또는 2개 이상을 작동가능하게 포함된 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 한가지 실시태양에서는, 최대 활성을 보장하는 프로모터 부분, 최적화된 자일로스 환원효소, 터미네이터, 선별마커인 URA3가 포함된 발현벡터를 구축하였으며, 상기 발현벡터는 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 균주에 도입하였다.
본 발명에 따른 발현벡터는 당업계 공지된 통상의 방법을 이용하여 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제작할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 발현벡터를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 균주에 도입하여 제조된 형질전환체인, 자일로스 환원효소(xylose reductase)가 항구적으로 발 현(constitutive expression)되는 자일리톨 생산 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 자일리톨 생산 균주에 있어서, 클로닝된 프로모터와 터미네이터, 합성된 NXRG 유전자 및 선별마커인 URA3 유전자를 이용하여 캔디다 트로피칼리스에서 발현할 수 있는 발현 카세트(프로모터-NXRG-터미네이터)를 구축(도 4 참조)할 수 있으며, 상기 발현 카세트를 1개 포함하는 발현벡터와 2개 포함하는 발현벡터를 각각 제조한 후, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 변이주에 도입한 발현 카세트가 각각 1개와 2개가 삽입된 캔디다 트로피칼리스 변이주를 수득할 수 있으나, 상기 방법에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시태양에서는, 본 발명에 따른 발현 카세트 개수 증가에 따른 발현강도 및 자일리톨 생산 증대 효과 여부를 확인한 결과, 상기 발현 카세트가 1개 삽입된 균주의 경우에는 포도당 배지에서 대조군 보다 50배 높은 효소 활성을 보였으며, 2개 삽입된 균주의 경우에는 1개가 삽입된 균주 보다도 4배 이상 높은 자일로스 환원효소 활성을 확인하였다(표 3 참조).
본 발명의 한가지 실시태양에서는, 본 발명에 따른 형질전환체(발현 카세트가 1개 또는 2개 포함된 균주)를 각각 자일로스 및 포도당을 포함하는 배지에 배양한 후, 시간에 따른 자일로스, 자일리톨 및 포도당 농도를 측정한 결과, 상기 발현 카세트가 1개 및 2개가 삽입된 균주의 경우에는 대조군에 비해 각각 15% 및 35%의 자일리톨 생산성 증가를 확인할 수 있었다(표 4, 및 도 5 내지 도 8 참조).
따라서, 자일로스 환원효소의 항구적 고발현을 통한 자일리톨 생산방법은 포도당을 보조기질로 사용하여 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 생산할 수 있음을 알 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 형질전환체를 이용하여 포도당을 탄소원으로 하는 배지에서 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 자일리톨 생산방법은 하기의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 본 발명에 다른 형질전환체를 바이오매스 가수분해물 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
2) 배양된 균주로부터 자일리톨(xylitol)을 생산하는 단계; 및
3) 배양액으로부터 자일리톨를 분리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 바이오매스 가수분해물은 옥수수속대 가수분해물, 사탕수수속대 가수분해물, 코코넛 부산물, 및 자작나무의 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 자일로스를 포함하는 모든 바이오매스가 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 탄소원은 포도당인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 균주 배양에 사용되는 모든 탄소원이 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 배양은 25시간 이상 배양하는 것이 바람직하며, 40 ~ 50시간 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 자일리톨 생산방법은 포도당을 보조기질로 사용하여 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소의 프로모터와 터미네이터 서열 클로닝
캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 프로모터와 터미네이터를 클로닝하기 위해, 캔디다 트로피칼리스 유전체 DNA와 하기의 프라이머쌍을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 1455bp의 프로모터 서열(서열번호: 1)과 309bp의 터미네이터 서열(서열번호: 2)을 확보하였다.
프로모터 PCR[94℃ 30초, 30회 반복(94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 1분 30초), 72℃ 7분]:
PGAP-F(BglII): 5'-agatctaacgtggtatggttgtaagaaac-3'(서열번호: 3); 및
PGAP-R(XbaI_BamHI): 5'-ggatccgcgtctagatgtttaaattctttaattg-3'(서열번호: 4).
터미네이터 PCR[94℃ 30초, 30회 반복(94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 1분), 72℃ 7분]:
TGAP-F(XbaI_Xho): 5'-tctagattgctcgagctatccaacaaactctag-3'(서열번호: 5); 및
TGAP-R(BamHI): 5'-ggatcctctggtttagaagtagggactgtatg-3'(서열번호: 6).
<실시예 2> 뉴로스포라 크라사 자일로스 환원효소의 유전자 부호 최적화(codon optimization)
Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)의 데이터를 근거로 하여, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 자일로스 환원효소(Xylose reductase)의 유전자 코돈을 캔디다 트로피칼리스가 선호하는 코돈으로 교체하여 유전자 DNA를 합성하였다(GENEART, 독일). 합성된 NXRG 유전자(969bp)(서열번호: 7)는 뉴로스포라 크라사 자일로스 환원효소의 총 323 코돈 중 184 코돈(57%)이 변경되었다.
보통의 균주와는 달리 캔디다 트로피칼리스를 포함한 몇몇 캔디다속의 미생물들은 일반적인 루신(Leucine)코돈인 CTG 유전자 부호를 세린(Serine)으로 번역한다. 이에, 유전자 부호 최적화의 효과를 검증하기 위해, 야생의 뉴로스포라 크라사의 자일로스 환원효소가 가진 세 개의 CTG 코돈을 캔디다 트로피칼리스에서 루신을 지시하는 TTG 코돈으로 변경한 NXRE 유전자를 대조군으로 이용하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, 클로닝된 프로모터와 터미네이터, NXRE(CTG 코돈 교체된 야생형 유전자) 또는 NXRG(유전자 부호 최적화된 유전자), 및 선별마커인 URA3 유전자를 이용하여 캔디다 트로피칼리스에서 뉴로스포라 크라사의 자일로스 환원효소를 발현할 수 있는 카세트를 구축하였다(도 1).
구축된 카세트를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 변이주 BSXDH-3(기탁번호: KCTC 11137bp)에 각각 도입하여, 자일로스 환원효소의 활성을 측정하였다. 각각의 카세트가 도입된 캔디다 트로피칼리스 균주를 포도당 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L)를 이용해 30℃에서 12시간 배양하였다. 상기 배양된 세포를 파쇄시켜 얻은 효소액을 이용하여 효소의 활성을 측정하였다. 이때 효소 반응을 위한 버퍼로는 pH7.0의 50 mM 인산칼륨버퍼(Potassium phosphate buffer), 기질은 자일로스, 보조인자는 NADPH를 이용하였으며, 분광흡광기를 이용하여 340 nm에서의 흡광도의 변화를 바탕으로 효소의 활성을 계산하였다.
뉴로스포라 크라사 자일로스 환원효소의 유전자 부호 최적화에 따른 활성변화 분석
도입된 유전자 발현된 효소 활성
(mU/mg of proteins)		 상대적 효소 활성 (%)
NXRE (CTG코돈 교체된 야생형) 25.8 3.9
NXRG (유전자 부호 최적화) 656.0 100.0
그 결과, 상기 표 1에서 보는 바와 같이, 최적화된 NXRG 유전자의 발현 강도는 CTG 코돈만 변경된 야생형 유전자에 비해 25배 높은 활성을 보여주었다(표 1).
<실시예 3> 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소의 프로모터 분석
도 2에서 보는 바와 같이, 클로닝된 프로모터와 터미네이터, 합성된 NXRG 유전자 및 선별마커인 URA3 유전자를 이용하여 캔디다 트로피칼리스에서 발현할 수 있는 발현카세트를 구축하였다(도 2).
그런 다음, 길이에 따른 프로모터의 발현 강도를 시험하기 위해, 하기의 여러 가지 프라이머쌍을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 다양한 길이의 프로모터 부분을 증폭한 후, 상기 카세트의 프로모터 부분과 교체하였다.
PCR[94℃ 30초, 30회 반복(94℃ 30초, 57℃ 1분, 72℃ 1분 ~ 1분 12초), 72℃ 7분],
정방향(Forward) 프라이머:
CtGP317F: 5'-agatctctgactcctcccaatcagaa-3'(서열번호: 8);
CtGP519F: 5'-agatctttgtctgccaccaatgcttc-3'(서열번호: 9);
CtGP561F: 5'-agatcttcaaacaagaccaattggctcaat-3'(서열번호: 10);
CtGP700F: 5'-agatctatcagtccgagagcgcgt-3'(서열번호: 11);
CtGP800F: 5'-agatctcaaaagtgaactattggtgg-3'(서열번호: 12);
CtGP1000F: 5'-agatctgagtgcatgattatatatgtaatc-3'(서열번호: 13); 및
CtGP1200F: 5'-agatctgcaacaccctcgggcagt-3'(서열번호: 14).
역방향(Reverse) 프라이머:
CtGPR: 5'-tctagatgtttaaattctttaattgagggatg-3'(서열번호: 15).
다양한 길이의 프로모터를 가진 발현 카세트를 캔디다 트로피칼리스에 도입하여, 자일로스 환원효소의 활성을 측정하였다. 각각의 카세트가 도입된 캔디다 트로피칼리스 균주를 포도당 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L)를 이용해 30℃에서 12시간 배양시켰다. 상기 배양된 세포를 파쇄시켜 얻은 효소액을 이용하여 효소의 활성을 측정하였다. 이 때 효소 반응을 위한 버퍼로는 pH7.0의 50 mM 인산칼륨버퍼(Potassium phosphate buffer), 기질은 자일로스, 보조인자는 NADPH를 이용하였으며, 분광흡광기를 이용하여 340 nm에서의 흡광도의 변화를 바탕으로 효소의 활성을 계산하였다.
글리세알데히드-3-인산 탈수소효소의 프로모터 길이에 따른 발현 강도 분석
프로모터 길이 발현된 효소 활성
(mU/mg of proteins)		 상대적 활성 (%)
317 87 10.4
519 203 24.2
561 167 19.9
700 231 27.7
800 202 24.2
1000 680 81.2
1200 806 96.3
1455 837 100
그 결과, 상기 표 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 317bp의 프로모터 부분은 10% 정도의 약한 발현 강도를 보여주었고, 800bp까지는 20% 내외의 비슷한 활성이 측정되었다. 고활성의 발현을 위해서는 최소한 1000bp 이상의 프로모터 부분이 있어야 80% 이상의 발현이 가능하다는 것이 확인되었다(표 2 및 도 3).
<실시예 4> 캔디다 트로피칼리스에서의 자일로스 환원효소의 항구적 발현
도 4에서 보는 바와 같이, 클로닝된 프로모터와 터미네이터, 합성된 NXRG 유전자 및 선별마커인 URA3 유전자를 이용하여 캔디다 트로피칼리스에서 발현할 수 있는 발현카세트를 구축하였다. (프로모터-NXRG-터미네이터)의 개수 증가에 따른 발현강도 및 자일리톨 생산 증대 효과 여부를 확인하기 위해, (프로모터-NXRG-터미네이터)를 1개 포함하는 pCGUHisf-NXRG와 2개 포함하는 pCGU2Hisf-NXRG를 각각 구축하였다(도 4).
구축된 두 종류의 카세트는 각각 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 변이주 BSXDH-3(기탁번호: KCTC 11137bp)에 도입하고, 이를 유라실(Uracil)이 결핍된 선별용 고체배지(효모 질소 베이스(무아미노산) 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 한천 가루 20 g/L)에 도말한 후 30℃에서 2일간 정치 배양하였다. 유라실 결핍 배지에서 생존한 균주들을 대상으로 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였으며 상기의 카세트들이 유전체에 정상적으로 삽입된 균주를 선별하여, (프로모터-NXRG-터미네이터)가 각각 1개와 2개가 삽입된 캔디다 트로피칼리스 변이주 LNG1, LNG2를 수득하였다.
대조군인 캔디다 트로피칼리스 BSXDH-3와 변이주 LNG1, LNG2의 자일로스 환원효소의 발현여부를 확인하기 위해 효소 활성을 측정하였다. BSXDH-3, LNG1, LNG2를 각각 자일로스-포도당 배지(자일로스 50 g/L, 포도당 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L)를 이용해 30℃에서 12시간 배양시켰다. 상기 배양된 세포를 파쇄시켜 얻은 효소액을 이용하여 효소의 활성을 측정하였다. 이 때 효소 반응을 위한 버퍼로는 pH7.0의 50mM 인산칼륨버퍼(Potassium phosphate buffer), 기질은 자일로스, 보조인자는 NADPH를 이용하였으며, 분광흡광기를 이용하여 340 nm에서의 흡광도의 변화를 바탕으로 효소의 활성을 계산하였다.
NXRG 유전자 발현에 따른 자일로스 환원효소 활성 분석
균 주 발현된 효소 활성
(mU/mg of proteins)		 상대적 효소 활성 (%)
BSXDH-3 13.9 2.0
LNG1 686.6 100.0
LNG2 2864.0 417.1
그 결과, 상기 표 3에서 보는 바와 같이, 캔디다 트로피칼리스 BSXDH-3의 경우 포도당 배지에서 이화대사산물 억제작용(catabolic repression)에 의하여 기존 자신의 자일로스 환원효소가 억제받기 때문에 매우 낮은 활성 정도를 보여주었다.반면에, (프로모터-NXRG-터미네이터)가 1개 삽입된 LNG1의 경우에는 포도당 배지에서 배양했음에도 불구하고, 대조군인 BSXDH-3 보다 50배 높은 효소 활성을 보였으며, 2개 삽입된 LNG2의 경우에는 LNG1보다도 4배 이상 높은 자일로스 환원효소 활성이 확인되었다(표 3).
<실시예 5> 형질전환체를 이용한 자일리톨의 제조
제조된 형질전환체 LNG1 및 LNG2를 각각 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양액을 생산배지(자일로스 50 g/L, 포도당 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L) 50 ml에 접종한 후, 50시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였으며, 배양 개시 후 14시, 20시, 26시 및 32시에 각각 포도당 2.5 g/L씩 첨가하였다.
시간에 따른 자일로스, 자일리톨, 포도당 농도가 측정되었으며, 측정 방법은 다음과 같이 수행하였다. 우선, 시료를 원심분리하여 상등액을 0.2필터로 여과한 후, HPLC 시스템[Sugar-Pak I 컬럼, HPLC 펌프, refractive index detector(Waters, 미국), 이동상(mobile phase): 물, 0.5 ml/min, 온도: 90℃]으로 분석하였다. 시간에 따른 자일로스 감소와 자일리톨 생산결과는 다음과 같다.
배양시간에 따른 자일로스 및 자일리톨 농도 변화
시간 BSXDH-3 LNG1 LNG2
자일로스
(g/L)		 자일리톨
(g/L)		 자일로스 (g/L) 자일리톨
(g/L)		 자일로스
(g/L)		 자일리톨
(g/L)
0 47.2 0 46.9 0 47.4 0
6 47.2 0 46.9 0 47.7 0
9 46.9 0 45.9 0.7 47.0 0.6
12 44.9 1.0 39.6 5.8 41.0 5.1
15 41.1 4.4 33.7 11.5 32.7 13.2
20 35.6 9.4 28.3 16.6 26.6 19.3
28 27.0 17.4 18.8 25.6 14.9 30.1
36 23.0 22.4 11.5 33.5 6.6 38.8
44 13.7 31.7 4.8 40.6 0.6 45.4
50 7.3 38.2 1.6 43.8 0 45.6
그 결과, 상기 표 4, 및 도 5 내지 도 8에서 보는 바와 같이, 자일리톨의 생산성은 BSXDH-3가 0.76 g/L/h(50시간), LNG1이 0.88 g/L/h(50시간), LNG2가 1.03 g/L/h(44시간)인 것으로 나타났으며, LNG1 및 LNG2는 대조군인 BSXDH-3에 비해 각각 15% 및 35%의 자일리톨 생산성 증가를 확인할 수 있었다(표 4, 및 도 5 내지 도 8).
따라서, 자일로스 환원효소의 항구적 고발현을 통한 자일리톨 생산방법은 포도당을 보조기질로 사용하여 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 생산할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 6> 캔디다 트로피칼리스의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소의 프로모터를 이용한 다른 효소의 발현 확인
캔디다 트로피칼리스의 자일로스 환원효소(xylose reductase) 유전자를 클로닝하기 위해 캔디다 트로피칼리스 유전체 DNA와 하기의 프라이머쌍을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 975bp의 서열을 확보하였다:
PCR [94℃ 30초, 30회 반복(94℃ 30초, 56℃ 1분, 72℃ 1분), 72℃ 7분],
CXRCF-XbaI: 5'-tctagaacaaacatgtctactgctactgc-3'(서열번호: 16)
CXRCR-XhoI: 5'-ctcgagttaaacaaagattggaatgttgtcc-3'(서열번호: 17)
도 9에서 보는 바와 같이, 클로닝된 프로모터와 터미네이터, 캔디다 트로피칼리스 본래의 자일로스 환원효소 유전자 및 선별마커인 URA3 유전자를 이용하여 캔디다 트로피칼리스에서 발현할 수 있는 발현카세트를 구축하였다(도 9).
구축된 카세트를 캔디다 트로피칼리스에 도입하여, 자일로스 환원효소의 활성을 측정하였다. 상기 카세트가 도입된 캔디다 트로피칼리스 균주를 포도당 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO47H2O) 0.2 g/L)를 이용해 30℃에서 12시간 배양시켰다. 상기 배양된 세포를 파쇄시켜 얻은 효소액을 이용하여 효소의 활성을 측정하였다. 이 때 효소 반응을 위한 버퍼로는 pH7.0의 50 mM 인산칼륨버퍼(Potassium phosphate buffer), 기질은 자일로스, 보조인자는 NADPH를 이용하였으며, 분광흡광기를 이용하여 340 nm에서의 흡광도의 변화를 바탕으로 효소의 활성을 계산하였다.
GAPDH 프로모터에 의한 캔디다 트로피칼리스 자일로스 환원효소 발현에 따른 활성 분석
균 주 발현된 효소 활성
(mU/mg of proteins)		 상대적 효소 활성 (%)
BSXDH-3 (대조군) 23.2 4.2
JA (항구적 CtXR 발현균주) 553.0 100.0
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 포도당 배지에서는 이화대사산물 억제작용(catabolic repression)에 의하여 본래의 자일로스 환원효소는 거의 발현하지 않지만, 새로 도입된 GAPDH 프로모터 통제 하의 캔디다 트로피칼리스 자일로스 환원효소의 활성은 강하게 측정되었다(표 5). 따라서 NXRG 유전자 이외에 다른 효소도 GAPDH 프로모터에 의해 고발현됨을 확인할 수 있었다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 산업적으로 많이 이용되는 자일리톨을 안전하고 친환경적으로 대량 생산할 수 있다.
도 1은 클로닝된 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소의 프로모터와 터미네이터, NXRE(CTG 코돈 교체된 야생형 유전자) 또는 NXRG(유전자 부호 최적화된 유전자), 및 선별마커인 URA3 유전자를 이용하여 캔디다 트로피칼리스에서 뉴로스포라 크라사의 자일로스 환원효소를 발현할 수 있는 카세트(프로모터-NXRG or NXRE-터미네이터-URA3)를 보여주는 그림이다.
도 2는 클로닝된 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소의 프로모터와 터미네이터, NXRE(CTG 코돈 교체된 야생형 유전자) 또는 NXRG(유전자 부호 최적화된 유전자), 및 선별마커인 URA3 유전자를 이용하여 캔디다 트로피칼리스에서 뉴로스포라 크라사의 자일로스 환원효소를 발현할 수 있는 카세트(프로모터-NXRG-터미네이터-URA3)를 보여주는 그림이다.
도 3은 상기 발현 카세트에 있어서, 다양한 길이의 프로모터를 가진 발현 카세트를 캔디다 트로피칼리스에 도입하여, 자일로스 환원효소의 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 발현 카세트(프로모터-NXRG-터미네이터)를 1개 포함하는 발현벡터인 pCGUHisf-NXRG와 2개 포함하는 발현벡터인 pCGU2Hisf-NXRG의 일부를 보여주는 그림이다.
도 5는 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 균주 BSXDH-3의 배양 시간에 따른 자일로스, 자일리톨 및 포도당 농도의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 6은 BSXDH-3 균주에 발현 카세트(프로모터-NXRG-터미네이터)가 1개 삽입된 캔디다 트로피칼리스 변이주 LNG1의 배양 시간에 따른 자일로스, 자일리톨 및 포도당 농도의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 BSXDH-3 균주에 발현 카세트(프로모터-NXRG-터미네이터)가 2개 삽입된 캔디다 트로피칼리스 변이주 LNG2의 배양 시간에 따른 자일로스, 자일리톨 및 포도당 농도의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 8은 BSXDH-3, LNG1 및 LNG2 균주에서 배양 시간에 따른 자일리톨 생산 정도를 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 9는 클로닝된 프로모터와 터미네이터, 캔디다 트로피칼리스 본래의 자일로스 환원효소 유전자 및 선별마커인 URA3 유전자를 이용하여 캔디다 트로피칼리스에서 발현할 수 있는 발현 카세트를 보여주는 그림이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> A mass-production method of xylitol using constitutive expression of xylose reductase <130> 9p-11-72 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1455 <212> DNA <213> Candida tropicalis <400> 1 aacgtggtat ggttgtaaga aacatattgc aactggagat agcgatcgtt caatttattc 60 cgattttgtg ggggaagtcg cccgctggtg ggcgtgcgcg aatggcaaaa gaaactcgac 120 catgcttttc atcatccctt aacagagcaa tcatatttta aacgttcaag caaaaagaaa 180 cgttggtttc ggctaatgat cacctgaaag gcaaaatcct tccatgtatg aacatgtagg 240 ttattccttt tttttgcaac accctcgggc agttgttcat attcccggaa aacaccacca 300 ctcggggcta agtggaagtt ctacaatccc ggggaaataa ggagccccgg tgagcacgcg 360 cacacaccac cttcacttca ttttgtccga gggaagcagc acgtgaagtc ggaacacgag 420 aggagcattt cttctatttt tttcttctct actgtgagtg catgattata tatgtaatca 480 aaagcgatca acttatggta gggtcgtgca cggcgcaccg ggttccaaaa tgatctgtga 540 gggacaaaat tctttttttt ttccagcatg ccgctggtgg caaataccgt ggtggtatga 600 tgcaccctat gccattgatt cacaccacca ccattaatca acaattgaga gaggacaaaa 660 gtgaactatt ggtggtcgtc aggttatact cgtcagcttc ggaatattac gtcccttcag 720 tttgtgaaat gtcatcctgg cgatgttcga gagagatcag tccgagagcg cgtggtagga 780 gaaacggagc actgcagcaa caaaaaaaaa atccaaaccc aggggggagg aagaagaaca 840 gccagggaaa ttgttcaccg acctgaccgt aaatttgctg ctgaaagaaa cgtgtcaaac 900 aagaccaatt ggctcaattg accctgaggg agtactttgt ctgccaccaa tgcttccacc 960 aaaacgctac ttttgttttg caatcggatg gtgtgggtct ggggtccacc tgttttgtta 1020 agctacagaa ggtggcatat tcctctgatc aggtgctttt tttcggctgc tgctgctcgt 1080 ggtggtgtag tggtagtggt gtgtgtgcgt gtgcgtgagg gaggccgctt tttgctctct 1140 gactcctccc aatcagaagt tgctgtagca gtgaaacaac acaatggatg ataatgcccc 1200 gggcggtgcg tgtccgacac aaaccactac attttttagc tgggagcata ctgccactac 1260 gacccaccca cccatggtca acaaaaaaat tctgacaaat tataaaataa cccttggatt 1320 cccccttgga aaaatttttg gtatttctct ctttcttttc cttttccttt ccctcttctt 1380 tttccctcca tcaatcaatt gacgttcagt aactcaatta attacatcac atccctcaat 1440 taaagaattt aaaca 1455 <210> 2 <211> 309 <212> DNA <213> Candida tropicalis <400> 2 ctatccaaca aactctaggg gttgtgcttt ttgaaaaaaa catataggtt ttattgaaat 60 agccacaatg tctgttgaga ggacatttga tttgttttat attatcgtat atgtaccctg 120 gaatatattg cgttttttaa caaaagacaa acaacggtct ttagtttttt tttcaatcaa 180 tcaatgttcg tgatcgtaga gagaaggaga aaaaaagagt aaacataaac aaacatcttt 240 ctttttacaa acgagtacaa gcaacagcca tgtcacaaga tgccatacag tccctacttc 300 taaaccaga 309 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGAP-F(BglII) primer <400> 3 agatctaacg tggtatggtt gtaagaaac 29 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGAP-R(XbaI_BamHI) primer <400> 4 ggatccgcgt ctagatgttt aaattcttta attg 34 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGAP-F(XbaI_Xho) primer <400> 5 tctagattgc tcgagctatc caacaaactc tag 33 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGAP-R(BamHI) primer <400> 6 ggatcctctg gtttagaagt agggactgta tg 32 <210> 7 <211> 969 <212> DNA <213> Neurospora crassa <400> 7 atggttccag ctattaagtt gaactccggt ttcgatatgc cacaagttgg tttcggtttg 60 tggaaggttg atggttccat tgcttccgat gttgtttaca acgctattaa ggctggttac 120 agattgttcg atggtgcttg tgattacggt aacgaagttg aatgtggtca aggtgttgct 180 agagctatta aagaaggtat cgtcaagaga gaagaattgt tcattgtttc caagttgtgg 240 aacactttcc acgatggtga tagagttgaa ccaattgtta gaaagcaatt ggctgattgg 300 ggtttggaat acttcgattt gtacttgatt cacttcccag ttgctttgga atacgttgat 360 ccatccgtca gatacccacc aggttggcac ttcgatggta aatccgaaat tagaccatcc 420 aaggctacta ttcaagaaac ttggactgct atggaatcct tggttgaaaa gggtttgtcc 480 aagtccattg gtgtttccaa cttccaagct caattgttgt acgatttgtt gagatacgct 540 aaggttagac cagctacttt gcaaattgaa caccacccat acttggttca acaaaacttg 600 ttgaacttgg ctaaggctga aggtattgct gttactgctt actcctcatt cggtccagct 660 tcattcagag aatttaacat ggaacacgct caaaagttgc aaccattgtt ggaagatcca 720 actattaagg ctattggtga taagtacaac aaggacccag ctcaagtttt gttgagatgg 780 gctactcaaa gaggtttggc tattattcca aagtcctcca gagaagctac tatgaagtcc 840 aacttgaact ccttggattt cgatttgtcc gaagaagata ttaagactat ttccggtttt 900 gatagaggta ttagattcaa ccaaccaact aactacttct ccgctgaaaa cttgtggatt 960 ttcggttaa 969 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtGP317F primer <400> 8 agatctctga ctcctcccaa tcagaa 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtGP519F primer <400> 9 agatctttgt ctgccaccaa tgcttc 26 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtGP561F primer <400> 10 agatcttcaa acaagaccaa ttggctcaat 30 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtGP700F primer <400> 11 agatctatca gtccgagagc gcgt 24 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtGP800F primer <400> 12 agatctcaaa agtgaactat tggtgg 26 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtGP1000F primer <400> 13 agatctgagt gcatgattat atatgtaatc 30 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtGP1200F primer <400> 14 agatctgcaa caccctcggg cagt 24 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtGPR primer <400> 15 tctagatgtt taaattcttt aattgaggga tg 32 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXRCF-XbaI primer <400> 16 tctagaacaa acatgtctac tgctactgc 29 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXRCR-XhoI primer <400> 17 ctcgagttaa acaaagattg gaatgttgtc c 31

Claims (9)

  1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 프로모터(promoter), 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 터미네이터(terminator)로 구성된 유전자 컨스트럭트.
  2. 서열번호 1로 기재되는 염기서열 중 5' 부위부터 시작하여 1000bp 이상의 염기서열을 포함하는 프로모터, 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 터미네이터로 구성된 유전자 컨스트럭트.
  3. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트를 1개 또는 2개 이상을 포함하는 발현벡터.
  4. 제 3항의 발현벡터를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 균주에 도입하여 제조된, 자일로스 환원효소(xylose reductase)가 항구적으로 발현(constitutive expression)되는 자일리톨 생산 균주.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 자일리톨 탈수소효소가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 균주는 기탁번호: KCTC 11137bp로 기재되는 균주인 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산 균주.
  6. 1) 제 4항의 자일리톨 생산 균주를 바이오매스 가수분해물 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
    2) 배양된 균주로부터 자일리톨(xylitol)을 생산하는 단계; 및
    3) 배양액으로부터 자일리톨를 분리하는 단계를 포함하는, 자일리톨의 대량 생산방법.
  7. 제 6항에 있어서, 단계 1)의 바이오매스 가수분해물은 옥수수속대 가수분해물, 사탕수수속대 가수분해물, 코코넛 부산물, 및 자작나무의 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자일리톨의 대량 생산방법.
  8. 제 6항에 있어서, 단계 1)의 탄소원은 포도당인 것을 특징으로 하는 자일리 톨의 대량 생산방법.
  9. 제 6항에 있어서, 단계 1)의 배양은 25 내지 50시간 배양하는 것을 특징으로 하는 자일리톨의 대량 생산방법.
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