KR20190059388A - 에리스리톨을 생산하는 신규 효모 균주 및 이의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 복숭아로부터 분리한 에리스리톨을 생산하는 신규 효모 균주칸디다 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 및 이를 이용하여 에리스리톨의 생산을 증대시키는 최적의 배양 방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 에리스리톨의 생산능이 신규 효모 균주인 Candida sorbosivorans JM409 균주를 복숭아로부터 분리하였으며, 본 균주가 에리스리톨을 생산하는 최적을 조건을 확립하였으므로 설탕을 대체할 감미료 제조기술로 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

Description

에리스리톨을 생산하는 신규 효모 균주 및 이의 생산 방법{New Yeast Strain with high productivity of erythritol production method thereof}

본 발명은 복숭아로부터 분리한 에리스리톨을 생산하는 신규 효모 균주 칸디다 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 및 이를 이용하여 에리스리톨의 생산을 증대시키는 최적의 배양 방법에 관한 것이다.

최근 우리나라뿐만 아니라 세계적으로 지속적인 당류의 섭취로 인한 만성비만 및 당뇨병 등의 건강문제를 인식하고 저당류 제품을 선호하는 사람들이 늘어나고 있다. 이에 발맞춰 식품산업도 저당에 대한 관심이 높아지고 있으며 저당 트렌드를 식품에 적용하고자 하는 움직임 또한 활발하게 일어나고 있다.

그 중에서도 대체 당으로 주목받고 있는 당 알코올은 청량감을 비롯하여 설탕에 60-80% 해당하는 단맛을 내며 무엇보다 설탕에 비해 칼로리가 낮다는 장점을 가지고 있다.

일반적으로 당 알코올은 polyol 구조를 가지고 있으며 자연계에서는 멜론, 포도 등의 과일이나 채소 등에 존재한다. 현재는 대부분이 촉매에 의한 탄수화물 수소화 반응을 통하여 만들어지지만 생산효율성이 떨어져 미생물을 이용한 당 알코올 생산에 대한 중요성이 커지고 있다.

이러한 당 알코올에는 자일리톨, 만니톨, 소르비톨, 에리스리톨 등이 있으며, 그 중에서도 에리스리톨은 4개의 탄소로 이루어진 당 알코올로 거의 0 칼로리에 가까운 저칼로리 물질이며 구강세균인 Streptococcus mutans와 Streptococcus sobrinus가 이용하지 못하기 때문에 충치예방에도 효과가 있다고 알려져 있다. 또한 에리스리톨은 활성산소를 제거하는 능력이 뛰어나 항산화 역할도 한다고 보고된 바 있다.

에리스리톨을 생산할 수 있는 균주로 가장 많이 연구된 균주는 Candida magnolia 와 Yarrowia lipolytica이며 효율성이 높아 산업적으로 이용되는 대표적인 균주는 Aureobasidium sp.와 Pseudozyma tsukubaensis이다.

이에 본 발명자들은 에리스리톨을 생산하는 신규 균주를 연구하던 중에 복숭에서 분리한 신규 균주가 에리스리톨을 생산하는 것을 확인하였으므로 본 발명을 완성하였다.

대한민국등록특허 (0001) KR10-1576183

본 발명의 목적은 에리스리톨 생산능을 가지는 칸디다 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 균주(KACC 93287P)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 에리스리톨을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에리스리톨(Erythritol)을 생산하는 칸디다 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 균주(KACC 93287P)를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서 있어서, 상기 칸디다 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 균주는 복숭아로부터 분리된 것이다.

본 발명에서 용어, "에리스리톨"은 백색의 결정성분말로서 냄새가 없고 단맛을 가지고 있다. 화학식은 C₄H₁₀O₄ 이다. 물에 잘 녹고, 알코올에는 약간 녹으며 에테르에는 녹지 않는다. 녹는점은 119∼123℃이다. 내열성이 뛰어나고 흡습성도 낮아서 결정을 쉽게 형성하는 장점이 있다. 감미도는 설탕의 70∼80%정도이며 청량한 감미를 가지고 있다. 다른 감미료와 달리 체내에서 에너지원으로 이용되지 않고 대부분 배출되므로 낮은 흡수율로 인해 저칼로리 감미료이다.

또한, 본 발명은 칸디다 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 균주(KACC 93287P)를 배지에서 발효하는 단계; 및 발효에 따른 배지 또는 상기 균주로부터 에리스리톨을 회수하는 단계를 포함하는 에리스리톨의 생산 방법을 제공한다.

상기 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지는 성장에 필요한 환원제로 금속이온을 포함할 수 있다. 본 발명의 Candida sorbosivorans JM409는 Fe^{2 +}를 포함하는 것이 바람직하다. 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

한편, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예,공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃일 수 있다. 발효는 원하는 에스트리톨의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 220 시간에서 달성될 수 있다. 에리스리톨은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 에리스리톨의 회수 방법은 당업계에서 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 에리스리톨의 생산능이 신규 효모 균주인 칸디다 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 균주를 복숭아로부터 분리하였으며, 본 균주가 에리스리톨을 생산하는 최적을 조건을 확립하였으므로 설탕을 대체할 감미료 제조기술로 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

도 1은 기존 에리스리톨 생산 균주와 본 발명의 신규 균주의 에리스리톨 생산량 비교 분석한 결과를 나타낸 그래프이다: 오차 막대는 두 개의 생물학적 복제본의 표준 편차를 나타냄.
도 2는 Candida sorbosivorans type strain(A)과 Candida sorbosivorans JM409(B)는 탄소원의 종류에 따른 발효특성을 나타낸 그래프이다:
마름모: 과당 농도, 삼각형: 에리스리톨 농도, 원: 세포 밀도, 오차 막대는 두 개의 생물학적 복제본의 표준 편차를 나타냄.
도 3은 온도 조건에 따른 Candida sorbosivorans type strain(검은색 기호)와 Candida sorbosivorans JM409(흰색 기호)의 발효특성을 나타낸 결과이다:
A: 30℃, B: 37℃, 정사각형: 포도당 농도, 삼각형: 에리스리톨 농도, 원: 세포 밀도, 오차 막대는 두 개의 생물학적 복제본의 표준 편차를 나타냄.
도 4는 Candida sorbosivorans type strain과 Candida sorbosivorans JM409의 포도당 농도에 따른 에리스리톨 생산 량을 비교한 그래프이다:
A: Candida sorbosivorans type strain 100g/L glucose,
B: Candida sorbosivorans JM409 100g/L glucose,
C: Candida sorbosivorans type strain 200g/L glucose,
D: Candida sorbosivorans JM409 200g/L glucose,
오차 막대는 두 개의 생물학적 복제본의 표준 편차를 나타냄.
도 5는 환원제의 종류에 따른 Candida sorbosivorans JM409 균주의 에리스리톨 생산량을 나타낸 그래프이다:
환원제의 종류: 금속이온 5종(Ca^{2 +}, Cu^{2 +},Mg^{2 +}, Mn^{2 +}, Fe^{2 +}),
오차 막대는 두 개의 생물학적 복제본의 표준 편차를 나타냄.
도 6은 5L 바이오 리액터를 이용한 Candida sorbosivorans JM409의 scale-up 발효한 결과를 나타낸 그래프이다. 정사각형: 포도당 농도, 삼각형: 에리스리톨 농도, 원: 세포 밀도

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 복숭아에서 분리된 새로운 효모 균주인 Candida sorbovisorans JM409 균주가 에리스리톨을 생산할 수 있는 균주임을 확인하여 한국농업미생물자원센터(KACC)에 2017년 10월 24일에 미생물 수탁번호 KACC93287P로 특허 미생물 수탁하였다.

또한, 상기 Candida sorbovisorans JM409 균주의 에리스리톨의 생산능력을 최대화하기 위해 균주의 발효특성을 파악하였으며, 호기적인 조건인 250rpm에서 에리스리톨 생산량이 가장 많은 것을 확인하였고(표 1), 이와 함께 환원제 역할을 하는 것으로 여겨지는 Fe^{2 +} 금속이온을 첨가하였을 때 생산량이 더 많아지는 것을 확인하였다(도 5).

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단

지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 재료 및 방법

<1-1> 균주 및 배지

본 발명에서는 국내 복숭아 시료에서 채취하여 분리된 효모 균주를 사용하였다. 분리한 효모를 10ml YPD 배지(10g/L yeast extract, 20g/L Bacto peptone, 20g/L glucose)에서 30℃, 250rpm 조건으로 24시간 동안 1차 배양하였다. 배양된 균주를 원심분리를 통해 상등액을 제거하고 균주만 분리하여 OD₆₀₀ = 1.0으로 맞추어 접종하였다. 각각의 실험은 100ml Erelnmeyer flask를 이용하여 20ml YPD 배지에서 limited aerobic 조건으로 발효하였다. YPD 배지는 글루코스(glucose) 농도를 100g/L, 200g/L로, 온도는 30℃, 37℃, 산소조건은 80rpm, 200rpm, 250rpm으로 나누어 실험하였다.

<1-2> 금속이온 종류에 따른 에리스리톨 생산 분석

금속이온 종류에 따른 에리스리톨 생산량을 비교하기 위한 실험으로 총 다섯 가지 금속이온을 사용하여 실험하였다. Fe^{2 +}, Mg^{2 +}, Mn^{2 +}, Cu^{2 +}, Ca^{2 +}를 공급하기 위해 각각 0.35g/L의 Fe₂SO₄·7H₂O, MgSO₄·7H₂O, MnSO₄·H₂O, CuSO₄·5H₂O, CaCl₂·2H₂O를 20ml YPD(100g/L)에 첨가하여 250rpm, 30℃ 조건에서 발효하였다.

<1-3> Scale-up 발효

에리스리톨의 scale-up 발효는 5L-bioreactor에서 2L YPD(100g/L glucose), 30℃, 250rpm, pH5 에서 fed-batch 방식으로 진행되었다. 초기OD₆₀₀은 1.0으로 맞추어서 접종하였고 소포제는 다우코닝사의 실리콘 소포제를 사용하였다.

scale-up 발효실행은 일반적으로 산업에 적용하기 위한 기초단계로 대량 발효시 플라스크 발효와 다른 결과를 나타낼 수 있기 때문에 플라스크 실험 후 scale-up 발효결과를 확인하고 플라스크 실험과 비교하여 대량발효조건의 최적화를 위해 시행하였다.

<1-4> HPLC 분석

용액 내 에리스리톨 농도는 RI detector를 이용한 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC,Agilent Technologies 1260 Series)로 분석하였다. 컬럼은 Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) (Phenomenex Inc., Torrance, CA)을 사용하였고, 이동상은0.005 N의 황산용액을 이용하여 50℃에서 0.6 mL/min 속도로 용출시켰다.

< 실시예 2> 실험 결과

<2-1> 기존 에리스리톨 생산 균주와의 에리스리톨 생산량 비교 분석

기존의 에리스리톨 생산 균주와 본 발명의 Candida sorbosivorans JM409 균주의 에리스리톨 생산량을 분석하였다.

구체적으로, 에리스리톨 생산 균주로 보고된 Candida magnoliae, Pseudozyma tsukubaensis와 함께 Candida sorbosivorans type strain을 포함하여 Candida sorbosivorans JM409 균주의 에리스리톨 생산을 비교하였다. 발효조건은 20ml YPD(100g/L), 30℃, 250rpm이며 48시간 동안 발효하여 에리스리톨 생산량을 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 Candida sorbosivorans JM409가 4.35g/L로 가장 많이 생산하는 모습을 보였고 Pseudozyma tsukubaensis, Candida sorbosivorans 순으로 에리스리톨을 생산하였다. Candida magnoliae는 에리스리톨을 생산하지 못하였다(도 1).

따라서, 균주별로 선호하는 발효조건이 다르지만 비교적 200-400g/L의 고농도 글루코스를 요구하는 Candida magnolia와 500rpm-850rpm 수준의 호기적 조건을 선호하는 Pseudozyma tsukubaensis를 비교하였을 때 Candida sorbosivorans JM409 균주 또한 에리스리톨 생산 균주로써 잠재적인 가능성이 있다고 판단된다.

<2-2> 발효조건에 따른 에리스리톨 생산능 분석

본 발명의 발효 조건에 따른 Candida sorbosivorans JM409 균주의 에리스리톨 생산량을 분석하였다.

구체적으로, 복숭아에서 분리한 새로운 효모균주인 Candida sorbosivorans JM409의 발효특성을 알아보기 위해 탄소원(carbon source), 온도, 당 농도 및 산소조건 등을 변화시키면서 에리스리톨 생산량을 비교하였다. 각 실험에서의 대조군(control)은 Candida sorbosivorans type strain으로 하였다.

첫 번째로 프룩토오스(fructose)를 선호하는 Candida 속의 균주가 있다는 연구를 참고하여, 탄소원으로 프룩토오스와 글루코스를 비교하였다. 실험은 YPD(200g/L), 200rpm, 30℃ 조건에서 진행하였다.

그 결과, Candida sorbosivorans type strain과 Candida sorbosivorans JM409 균주 모두 fructose를 기질로 하였을 때는 에리스리톨을 생산하지 못하였다(도 2).

또한, 온도조건을 30℃와 37℃로 다르게 하여 YPD(200g/L), 200rpm에서 실험한 결과, 37℃에서는 생장을 거의 하지 못할 뿐만 아니라 에리스리톨 또한 거의 생산하지 못하였다(도 3).

세 번째로는 산소조건과 당 농도에 따른 에리스리톨 생산량을 비교하여 하기 표 1에 나타내었다.

적정농도(100g/L 글루코스)			적정농도(200g/L 글루코스)
에어레이션 조건(Aeration condition)	Candida sorbosvirans type strain	Candida sorvosivorans JM409	Candida sorbosvirans type strain	Candida sorvosivorans JM409
80rpm	1.8	3.1	2.6	3.2
200rpm	4.2	8.5	3.9	6.9
250rpm	2.5	6.8	4.0	7.4

발효결과 YPD(100g/L) 배지에서 80rpm으로 실험하였을 때 Candida sorbosivorans type strain은 48시간 동안 1.8g/L의 에리스리톨을 생산하였고(도 4A) Candida sorbosivorans JM409 균주는 3.1g/L를 생산하였다(도 4B).

동일한 농도의 배지에서 250rpm 조건에서 실험하였을 때는 type strain은 2.5g/L(도 4A), Candida sorbosivorans JM409는 6.8g/L를 생산하여 80rpm 보다 약 1.7배 정도 많이 생산하였다(도 4B). 배지의 당 농도를 다르게 하여 YPD(200g/L)로 80rpm, 250rpm 각각 발효했을 때 80rpm에서 48시간 동안type strain은 2.6g/L(도 4C), Candida sorbosivorans JM409 균주는 3.2g/L의 에리스리톨을 생산하였다(도 4D). 250rpm에서는 type strain은 4.0g/L(도 4C), Candida sorbosivorans JM409는 7.4g/L(도 4D)를 생산하였다. 두 균주 모두 당 농도에 따른 차이는 거의 없었으며 YPD(200g/L)에서 glucose를 모두 발효하는데 rpm에 상관없이 96시간 이상 소모되었다.

또한, 두 균주 모두 80rpm보다 호기적인 조건인 250rpm에서 에리스리톨을 더 많이 생산하는 것을 확인할 수 있었으며 특히 Candida sorbosivorans JM409 균주는 type strain와 비교하였을 때도 더 많은 양의 에리스리톨을 생산하였다.

<2-3> 에리스리톨 생산에서 금속이온의 역할 분석

금속이온 종류에 따른 Candida sorbosivorans JM409의 에리스리톨 생산량을 확인하고 해당 균주에 적합한 금속이온을 이용하여 에리스리톨 생산에서 금속 이온의 역할을 분석하였다.

구체적으로, 실험은 0.35g/L 농도의 Fe₂SO₄·7H₂O, MgSO_{4 ·}7H₂O, MnSO₄·H₂O, CuSO₄·5H₂O, CaCl₂·2H₂O를 사용하였다. 각각의 금속이온을 첨가하여 에리스리톨 수율을 확인하였다.

그 결과, Candida sorbosivorans JM409 균주는 Fe^{2 +}에서 금속이온을 첨가하지 않았을 때 6.9g/L를 생산하여 0.06g/g glucose의 수율을 보였을 때에 비해 9.4g/L에리스리톨을 생산하여 0.09g/g glucose의 가장 높은 수율을 보였다. Fe^{2 +}를 제외한 다른 금속이온을 첨가하였을 때는 금속이온을 첨가하지 않았을 때 보다 낮은 수율을 보였다(도 5). 따라서 Candida sorbosivorans JM409 균주는 Fe^{2 +}가 환원제의 역할을 하는데 적합한 금속이온인 것을 확인하였다.

<2-4> 5L- bioreactor를 통한 에리스리톨 생산 분석

상기 실시예 <2-1> 내지 <2-3>의 결과에 따라, 가장 많은 에리스리톨을 생산한 조건에서 5L-bioreactor scale-up 발효를 진행하였다. 2L YPD(100g/L) 배지에 250rpm, 30℃, pH5를 유지하면서 fed-batch 방식으로glucose와 Fe₂SO₄·7H₂O 를 공급해주었다.

그 결과, 216시간 발효를 진행하는 동안 OD=34.2까지 증가하였고 이때, 11.2g/L의 에리스리톨을 생산하였으며, Glucose를 공급해줄 때마다 에리스리톨을 생산이 증가하는 것을 확인하였다(도 6).

농업생명공학연구원 KACC93287 20171024

Claims (5)

1. 에리스리톨(Erythritol)을 생산하는 칸디다 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 균주(KACC 93287P).
2. 제 1항에 있어서, 상기 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 균주는 복숭아로부터 분리된 것인 칸디다 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 균주(KACC 93287P).
3. 1) 제 1항의 칸디다 소르보시보란스(Candida sorbosivorans) JM409 균주(KACC 93287P)를 배지에서 발효하는 단계; 및
   2) 상기 발효에 따른 배지 또는 상기 균주로부터 에리스리톨을 회수하는 단계를 포함하는 에리스리톨의 생산 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 단계 1)의 배지에 금속이온을 첨가하는 것인 에리스리톨의 생산 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 금속이온은 Fe^{2 +} 인 것인 에리스리톨의 생산 방법.
   

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