CN116064363B - 一种生产观蓝的基因工程菌株及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产观蓝的基因工程菌株和发酵方法，该基因工程菌株IN06，由表达载体pRk‑bpsA‑EntD/95s‑glnA导入底盘菌株IN05构建而得；盘菌株IN05，以大肠杆菌BW25113为起始菌株，将大肠杆菌利用丙酮酸为碳源和能量的代谢路基的基因敲除或者原位突变构建而得，所述表达载体pRk‑bpsA‑EntD/95s‑glnA，以pRk、95s分别为质粒模板，蓝色素合成酶bpsA、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD及谷氨酰氨合成酶glnA为功能基因，经基因合成、优化、扩增构建而得。本发明的基因工程菌株，利用葡萄糖为底物，在体内直接生物合成观蓝，降低成本，绿色环保，无化学残留。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产观蓝的基因工程菌株及应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
观蓝是一种天然蓝色素，结构式为主要应用于染料行业。
目前，染料行业所使用的染料仍以工业染料靛蓝为主，但工业靛蓝的生产是以化学合成法为主，主要原料为苯胺，对人体的危害较大，所产生的污染较为严重，是工业污染的重要源头之一，而微生物发酵生产蓝色素污染较少且成本较低，已逐步成为工业靛蓝的替代方案，但是目前行业内微生物发酵生产观蓝的产量较低，且成本较高，尚不能工业应用。为了降低成本，实现工业化应用，本发明公开了一种生产观蓝的基因工程菌株和发酵方法。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种生产观蓝的基因工程菌株和发酵方法，以葡萄糖为底物，在工程菌株IN06体内直接生物合成观蓝，降低成本，安全稳定，绿色环保，产品纯度高，无化学残留。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种生产观蓝的基因工程菌株和发酵方法，该基因工程菌株，即工程菌株IN06，是由表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA导入底盘菌株IN05构建而得；
其中，所述底盘菌株IN05，是以大肠杆菌BW25113为起始菌株，将大肠杆菌利用丙酮酸为碳源和能量的代谢路基的基因敲除或者原位突变构建而得，以增强中心代谢，促进关键蛋白的翻译后修饰；
所述表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA，是以质粒pRk、蓝色素合成酶bpsA以及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD分别经扩增、基因合成、优化后连接而得的目的基因片段pRk-bpsA-EntD与以质粒95s与谷氨酰氨合成酶glnA经基因合成、优化、扩增而得的的基因片段95s-glnA构建而得。
优选地，所述底盘菌株IN05的构建方法，具体的步骤如下：
s1、以大肠杆菌BW25113为起始菌株，插入标签基因筛选prpB基因，敲除prpB基因，并命名为菌株IN01；
s2、在菌株IN01基础上，插入标签基因筛选prpC基因，敲除prpC基因，并命名为菌株IN02；
s3、在菌株IN02基础上，插入标签基因筛选prpD基因，敲除prpD基因，消除大肠杆菌利用丙酮酸作为碳源和能量的能力，并命名为菌株IN03；
s4、将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp基因经PCR扩增，获得基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp，再以95s为质粒模板，将基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp与质粒95s连接，获得表达质粒95s-sfp，获得表达质粒95s-sfp，再选用119启动子对表达质粒95s-sfp进行定点突变，获得质粒95s-119-sfp；
s5、在菌株IN03基础上，插入标签基因筛选prpR基因，继续敲除prpR基因，并在该基因位点引入质粒95s-119-sfp，并命名为菌株IN04；
s6、在菌株IN04基础上，插入标签基因筛选prpE基因，选用119启动子在prpE基因上进行原位突变，获得底盘菌株，并命名为底盘菌株IN05。
优选地，所述表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA的构建方法，具体的步骤如下：
S1、将蓝色素合成酶bpsA先进行基因合成，再进行密码子优化，再经PCR扩增，得到基因片段蓝色素合成酶bpsA；将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD先进行基因合成，再进行密码子优化，再经PCR扩增，得到基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD；再以质粒pRk为模板，质粒pRk先进行基因合成，再进行密码子优化，再反义PCR扩增，得到基因片段质粒pRk，接着将基因片段质粒pRk、基因片段蓝色素合成酶bpsA、基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD进行连接，得到目的基因片段pRk-bpsA-EntD；
S2、以95s为质粒模板，与谷氨酰氨合成酶glnA进行基因合成，后进行密码子优化，再经PCR扩增，得到目的基因片段95s-glnA；
S3、将目的基因片段pRk-bpsA-EntD和目的基因片段95s-glnA进行连接，后经筛选RBS序列，得到表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA。
其中，插入的标签基因为重复序列，(CAXGGXTCXATGTCXTGG)n，X为任意碱基，n可为1、2、3、4、5或6，标签基因相似度为80％-100％。
本发明的所述工程菌株IN06还在观蓝生产中得到应用。
本发明提供了一种摇瓶培养的方式，具体的步骤如下：活化上述的工程菌株IN06，以1％接种量接种至50ml摇瓶培养基内进行培养，摇瓶培养基为ZYM培养基，培养基内加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素和50ug/ml的链霉素，当阿拉伯糖的终浓度为4mg/L时，在摇床内进行诱导，摇床温度为30℃、转速为225rpm，诱导表达16h，诱导结束后，得到观蓝摇瓶培养液。
本发明提供了一种发酵培养的方式，具体的步骤如下：
(1)活化上述的工程菌株IN06，以1％接种量接种至100ml LB培养基内，并加入50ug/mL的卡纳抗生素，置于37℃、220rpm条件下的摇床上培养6h，至OD600为1.8～2.2，即为种子液；
(2)取2.5L ZYM培养基置于发酵罐内并进行高压灭菌，后冷却至室温，调节pH为7.0，在25℃下，将种子液火焰接种至发酵罐内，并补加维生素VB1、卡那霉素、链霉素和L-阿拉伯糖，开始发酵，发酵温度为25℃，转速为300rpm，维持溶氧参数为30％，并在发酵过程通过氨水控制pH为7.0；
(3)当溶氧参数为35％时，开启补料，添加补料培养基，初始补料速率为1～2(g/L)/h；
(4)当持续培养72～75h时，发酵结束，得到观蓝发酵培养液。
其中，LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
其中，ZYM发酵培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO43.55g/L，KH2PO4 3.4g/L，NH4Cl 1.2～2.5g/L，Na2SO4 0.71g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，100*微量元素10ml/L，消泡剂150ul/L～1ml/L，甘油0.5％(wt)，葡萄糖0.5g/L，L-阿拉伯糖1～2.8g/L。
其中，补料培养基的配方为：无水葡萄糖400～630g/L，MgSO4·7H2O1～2.3g/L，100*微量元素8～12ml/L，酵母粉10g/L。
其中，100*微量元素的配方为：CuSO4 0.32g/L，CaCl2·2H2O 1.5～3.1g/L，MnCl2·4H2O 0.32g/L，ZnSO4·7H2O 5.75g/L，CoCl2·6H2O 0.47g/L，FeSO4·7H2O2.8g/L，Na2MO4·2H2O 0.48g/L，0.5M EDTA 80ml/L。
本发明的有益效果：本发明的基因工程菌株，以BW25113为起始菌株进行基因改造，后导入蓝色素合成酶bpsA、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD及谷氨酰氨合成酶glnA进行密码子优化或定向突变的功能表达载体得到；本发明利用葡萄糖为底物，在经基因改造后的大肠杆菌内，也就是基因工程菌株IN06体内直接生物合成观蓝，降低生产成本，安全稳定，绿色环保，无化学试剂残留；本发明通过摇瓶培养的观蓝产量高达7.19g/L，发酵罐发酵培养的观蓝产量高达35g/L，是目前行业内最高水平；本发明的基因工程菌株可以适用工业化生产观蓝。
附图说明
图1为本发明的实施例5发酵培养时间对应的观蓝产量图。
具体实施方式
为了对本发明作出更加清楚完整地说明，下面用具体实施例说明本发明，但并不是对发明的限制。
本发明的观蓝的标准曲线，采用紫外分光光度计进行测定，取5ug、10ug、15ug、20ug、25ug、30ug的观蓝标品于1ml DMSO中，超声溶解后于分光光度计612nm测对应OD值，记录后，拟合成横坐标代表浓度、纵坐标代表OD值的标准曲线：Y＝0.0364X+0.0199，R2＝0.999(相关系数)。
本发明的LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
本发明的ZYM发酵培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO4 3.55g/L，KH2PO4 3.4g/L，NH4Cl 1.2～2.5g/L，Na2SO4 0.71g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，100*微量元素10ml/L，消泡剂150ul/L～1ml/L，甘油0.5％(wt)，葡萄糖0.5g/L，L-阿拉伯糖1～2.8g/L。
本发明的补料培养基的配方为：无水葡萄糖400～630g/L，MgSO4·7H2O1～2.3g/L，100*微量元素8～12ml/L，酵母粉10g/L。
本发明的100*微量元素的配方为：CuSO4 0.32g/L，CaCl2·2H2O 1.5～3.1g/L，MnCl2·4H2O 0.32g/L，ZnSO4·7H2O 5.75g/L，CoCl2·6H2O 0.47g/L，FeSO4·7H2O2.8g/L，Na2MO4·2H2O 0.48g/L，0.5M EDTA 80ml/L。
本发明的大肠杆菌BW25113。
实施例1底盘菌株IN05的构建方法
具体步骤如下，利用了CRISPR-Cas9技术原理：
s1、以大肠杆菌BW25113为起始菌株，插入核苷酸如序列SEQ ID No:6所示的标签基因筛选prpB基因，prpB基因涉及的核苷酸序列SEQ ID No:17和SEQ ID No:18所示，敲除prpB基因，并命名为菌株IN01；
s2、在菌株IN01基础上，插入核苷酸如序列SEQ ID No:8所示的标签基因筛选prpC基因，prpC基因涉及的核苷酸序列SEQ ID No:19和SEQ ID No:20所示，敲除prpC基因，并命名为菌株IN02；
s3、在菌株IN02基础上，插入核苷酸如序列SEQ ID No:6所示的标签基因筛选prpD基因，prpD基因涉及的核苷酸序列SEQ ID No:21和SEQ ID No:22所示，敲除prpD基因，消除大肠杆菌利用丙酮酸作为碳源和能量的能力，并命名为菌株IN03；
s4、将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp基因经PCR扩增，引物的核苷酸序列SEQ IDNo:23和SEQ ID No:24所示，获得基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp，再以95s为质粒模板，通过Gibson组装方式将基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp与质粒95s连接，获得表达质粒95s-sfp，再选用119启动子对表达质粒95s-sfp进行定点突变，获得质粒95s-119-sfp；
s5、在菌株IN03基础上，插入核苷酸如序列SEQ ID No:8所示的标签基因筛选prpR基因，prpR基因涉及的核苷酸序列SEQ ID No:25至SEQ ID No:27所示，继续敲除prpR基因，并在该基因位点引入质粒95s-119-sfp，并命名为菌株IN04；
s6、在菌株IN04基础上，插入核苷酸如序列SEQ ID No:7所示的标签基因筛选prpE基因，prpE基因涉及的核苷酸序列SEQ ID No:28和SEQ ID No:29所示，选用119启动子在prpE基因上进行原位突变，获得底盘菌株，并命名为底盘菌株IN05。
表1
实施例2表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA的构建方法
具体的步骤如下：
S1、将蓝色素合成酶bpsA先进行基因合成，该蓝色素合成酶bpsA的核苷酸序列SEQID No:1所示，再进行密码子优化，再经PCR扩增，引物如核苷酸序列SEQ ID No:9和SEQ IDNo:10所示，获得基因片段蓝色素合成酶bpsA；将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD先进行基因合成，该磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD的核苷酸序列SEQ ID No:2所示，再进行密码子优化，再经PCR扩增，经PCR扩增，引物如核苷酸序列SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示，获得基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD；再以pRk为模板质粒，质粒pRk先进行基因合成，质粒pRk的核苷酸序列SEQ ID No:3所示，再进行密码子优化，再经反义PCR扩增，引物如核苷酸序列SEQ ID No:13和SEQ ID No:14所示，获得基因片段质粒pRk，最后将基因片段质粒pRk、基因片段蓝色素合成酶bpsA、基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD连接，得到目的基因片段pRk-bpsA-EntD；
S2、以95s为质粒模板，质粒95s的核苷酸序列SEQ ID No:4所示，与谷氨酰氨合成酶glnA进行基因合成，谷氨酰氨合成酶glnA的核苷酸序列SEQ ID No:5所示，后进行密码子优化，再经PCR扩增，引物如核苷酸序列SEQ ID No:15和SEQ ID No:16所示，得到目的基因片段95s-glnA；
S3、通过Gibson组装方式将目的基因片段pRk-bpsA-EntD和目的基因片段95s-glnA进行连接，后经筛选RBS序列，得到表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA。
表2
本发明使用的标签基因为重复序列，(CAXGGXTCXATGTCXTGG)n，X为任意碱基，n可为1、2、3、4、5或6，标签基因相似度为80％～100％，在本实施例1中具体使用的标签基因如下表3所示：
表3
实施例3基因工程菌株的构建方法
将上述实施例2中的表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA通过化学转化法导入底盘菌株IN05，得到基因工程菌株，命名为工程菌株IN06。
实施例4摇床培养生产观蓝
具体的步骤如下：将上述实施例3的工程菌株IN06，以1％体积接种量接种至50ml摇瓶培养基内进行培养，摇瓶培养基为ZYM培养基，培养基内加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素和50ug/ml的链霉素，当阿拉伯糖的终浓度为4mg/L时，在摇床内进行诱导，诱导表达16h，摇床温度为30℃、转速为225rpm，诱导结束后，得到观蓝摇瓶培养液，然后取样，离心、溶解，通过紫外分光光度计检测，根据标准曲线计算，观蓝产量为7.19g/L。
实施例5发酵培养生产观蓝
具体的步骤如下：
(1)将上述实施例3的工程菌株IN06，以1％接种量接种至100ml LB培养基内，并加入50ug/mL的卡纳抗生素，置于37℃、220rpm条件下的摇床上培养6h，至OD600为1.8～2.2，即为种子液；
(2)取2.5L ZYM培养基置于发酵罐内并进行高压灭菌，后冷却至室温，调节pH为7.0，在25℃下，将种子液火焰接种至发酵罐内，并补加0.05～0.15g/L维生素VB1、50ug/ml卡那霉素、50ug/ml链霉素和1～2.8g/L L-阿拉伯糖，开始发酵，发酵温度为25℃，转速为300rpm，维持溶氧参数为30％，并在发酵过程通过氨水控制pH为7.0；
(3)当溶氧参数为35％时，开启补料，添加补料培养基，初始补料速率为1～2(g/L)/h，直至发酵结束；
(4)诱导发酵前，取样，诱导发酵后，每个两个小时取一次样，每次取样100μl，离心、溶解，通过紫外分光光度计检测，根据标准曲线计算观蓝产量，通过记录结果，并重复多次实验，结果如图1所示。
通过图1发现，发酵6h观蓝的产量很低，发酵到8h，观蓝的产量才达到0.42g/L，继续发酵，观蓝的产量呈积聚上升，发酵到44.5h，观蓝产量出现较高水平，达到了34.65g/L，继续发酵，观蓝产量呈现缓慢的上升，直至发酵到75h，更加趋于平稳状态，在发酵了约74h时观蓝的产量达到了最高，为35.06g/L，发酵42～75h，观蓝产量在32～35.06g/L，从75h延长发酵时间，观蓝的产量出现下降，综合发酵时间和观蓝的产量情况，发酵时间在42～45h，观蓝产量在34～34.7g/L，发酵时间和产量相对较佳，综上所述，本发明的发酵培养生产观蓝的发酵时间优选为42～45h。
实施例6发酵培养生产观蓝
本实施例6具体的步骤如下与实施例5完全相同，不同在于发酵时间为42h，观蓝产量在32.11g/L。
实施例7发酵培养生产观蓝
本实施例7具体的步骤如下与实施例5完全相同，不同在于发酵时间为43h，观蓝产量在33.35g/L。
实施例8发酵培养生产观蓝
本实施例8具体的步骤如下与实施例5完全相同，不同在于发酵时间为45h，观蓝产量在32.72g/L。
对比例1
将上述实施例2中的表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA通过化学转化法导入大肠杆菌BW25113，得到对照菌株一，该工对照菌株一替换工程菌株IN06，按照实施例4的步骤方法，发酵44h，进行生产观蓝为0.27g/L。
对比例2
本对比例2以实施例1中获得的菌株IN01为底盘菌株；
将上述实施例2中的表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA通过化学转化法导入底盘菌株IN01，得到对照菌株二，该工程菌株二替换工程菌株IN06，按照实施例4的步骤方法，发酵44h，进行生产观蓝为0.95g/L。
对比例3
本对比例3以实施例1中获得的菌株IN02为底盘菌株；
本对比例3以实施例2中的构建方式，筛选质粒pRk-EntD-bpsA，质粒pRk-EntD-bpsA与质粒95s-glnA进行基因合成，得到出获得的菌株IN02为底盘菌株中；
将上述实施例2中的表达载体pRk-EntD-bpsA和95s-glnA通过化学转化法导入底盘菌株IN02，得到对照菌株三，该工程菌株三替换工程菌株IN06，按照实施例4的步骤，发酵44h，方法进行生产观蓝为1.26g/L。
对比例4
本对比例4以实施例1中获得的菌株IN02为底盘菌株；
将上述实施例3中的表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA通过化学转化法导入底盘菌株IN02，得到对照菌株二，该工程菌株二替换工程菌株IN06，按照实施例4的步骤方法，发酵44h，进行生产观蓝为1.63g/L。
对比例5
本对比例5以实施例1中获得的菌株IN03为底盘菌株；
将上述实施例2中的表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA通过化学转化法导入底盘菌株IN03，得到对照菌株四，该工程菌株四替换工程菌株IN06，按照实施例4的步骤方法，发酵44h，进行生产观蓝为1.89g/L。
对比例6
本对比例6以实施例1中获得的菌株IN04为底盘菌株；
将上述实施例2中的表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA通过化学转化法导入底盘菌株，得到对照菌株五，该工程菌株五替换工程菌株IN06，按照实施例4的步骤方法，发酵44h，进行生产观蓝为3.45g/L。
综上所述，本发明的基因工程菌株IN06，利用葡萄糖为底物，在其体内直接生物合成观蓝留，采用的摇瓶培养是观蓝的产量高达7.19g/L，发酵罐发酵培养使观蓝的产量高达35g/L，能够大大降低生产成本，安全稳定，绿色环保，无化学试剂残留，可以适用工业化生产观蓝。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (8)
1.一种生产观蓝的基因工程菌株其特征在于，该基因工程菌株，即工程菌株IN06，是由表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA导入底盘菌株IN05构建而得；
其中，所述底盘菌株IN05的构建方法，具体的步骤如下：
s1、以大肠杆菌BW25113为起始菌株，敲除prpB基因，并命名为菌株IN01；
s2、在菌株IN01基础上，敲除prpC基因，并命名为菌株IN02；
s3、在菌株IN02基础上，敲除prpD基因，并命名为菌株IN03；
s4、将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp基因经PCR扩增，获得基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp，再以95s为质粒模板，将基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp与质粒95s连接，获得表达质粒95s-sfp，获得表达质粒95s-sfp，再选用119启动子对表达质粒95s-sfp进行定点突变，获得质粒95s-119-sfp；
s5、在菌株IN03基础上，继续敲除prpR基因，并在该基因位点引入质粒95s-119-sfp，并命名为菌株IN04；
s6、在菌株IN04基础上，选用119启动子在prpE基因上进行原位突变，获得底盘菌株，并命名为底盘菌株IN05；
所述表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA，是以质粒pRk、蓝色素合成酶bpsA以及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD分别经扩增、基因合成、优化后连接而得的目的基因片段pRk-bpsA-EntD与以质粒95s与谷氨酰氨合成酶glnA经基因合成、优化、扩增而得的的基因片段95s-glnA构建而得。
2.根据权利要求1所述的一种生产观蓝的基因工程菌株，其特征在于，所述表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA的构建方法，具体的步骤如下：
S1、将蓝色素合成酶bpsA先进行基因合成，再进行密码子优化，再经PCR扩增，得到基因片段蓝色素合成酶bpsA；将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD先进行基因合成，再进行密码子优化，再经PCR扩增，得到基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD；再以质粒pRk为模板，质粒pRk先进行基因合成，再进行密码子优化，再反义PCR扩增，得到基因片段质粒pRk，接着将基因片段质粒pRk、基因片段蓝色素合成酶bpsA、基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD进行连接，得到目的基因片段pRk-bpsA-EntD；
S2、以95s为质粒模板，与谷氨酰氨合成酶glnA进行基因合成，后进行密码子优化，再经PCR扩增，得到目的基因片段95s-glnA；
S3、将目的基因片段pRk-bpsA-EntD和目的基因片段95s-glnA进行连接，后经筛选RBS序列，得到表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA。
3.根据权利要求1或2所述的一种生产观蓝的基因工程菌株，其特征在于，在基因敲除或基因突变，需要插入的标签基因，所述标签基因为重复序列，(CAXGGXTCXATGTCXTGG)n，X为任意碱基，n可为1、2、3、4、5或6，标签基因相似度为80％-100％。
4.一种根据权利要求1所述的一种生产观蓝的基因工程菌株的应用，其特征在于，所述工程菌株IN06应用生产观蓝。
5.根据权利要求4所述的一种生产观蓝的基因工程菌株应用，其特征在于，采用摇瓶培养的方式生产观蓝，具体的步骤如下：活化上述的工程菌株IN06，以1％接种量接种至50ml摇瓶培养基内进行培养，培养基内加入卡那霉素和链霉素，当阿拉伯糖的终浓度为4mg/L时，在摇床内进行诱导，摇床温度为30℃、转速为225rpm，诱导表达16h，诱导结束后，得到观蓝摇瓶培养液；所述摇瓶培养基为ZYM培养基。
6.根据权利要求4所述的一种生产观蓝的基因工程菌株应用，其特征在于，采用发酵罐发酵培养的方式生产观蓝，具体的步骤如下：
(1)活化上述的工程菌株IN06，以1％接种量接种至100ml LB培养基内，并加入卡纳抗生素，置于37℃、220rpm条件下的摇床上培养6h，至OD600为1.8～2.2，即为种子液；LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；
(2)取2.5L ZYM培养基置于发酵罐内并进行高压灭菌，后冷却至室温，调节pH为7.0，在25℃下，将种子液火焰接种至发酵罐内，并补加维生素VB1、卡那霉素、链霉素和L-阿拉伯糖，开始发酵，发酵温度为25℃，转速为300rpm，维持溶氧参数为30％，并在发酵过程通过氨水控制pH为7.0；
(3)当溶氧参数为35％时，开启补料，添加补料培养基，初始补料速率为1～2(g/L)/h；
(4)当持续培养72～75h时，发酵结束，得到观蓝发酵培养液。
7.根据权利要求5或6所述的一种生产观蓝的基因工程菌株应用，其特征在于，所述ZYM发酵培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO43.55g/L，KH2PO4 3.4g/L，NH4Cl1.2～2.5g/L，Na2SO4 0.71g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，100*微量元素10ml/L，消泡剂150ul/L～1ml/L，甘油0.5％，葡萄糖0.5g/L，L-阿拉伯糖1～2.8g/L；
其中，100*微量元素的配方为：CuSO4 0.32g/L，CaCl2·2H2O 1.5～3.1g/L，MnCl2·4H2O0.32g/L，ZnSO4·7H2O 5.75g/L，CoCl2·6H2O 0.47g/L，FeSO4·7H2O 2.8g/L，Na2MO4·2H2O0.48g/L，0.5M EDTA 80ml/L。
8.根据权利要求6所述的一种生产观蓝的基因工程菌株应用，其特征在于，所述补料培养基的配方为：无水葡萄糖400～630g/L，MgSO4·7H2O 1～2.3g/L，100*微量元素8～12ml/L，酵母粉10g/L；
100*微量元素的配方为：CuSO4 0.32g/L，CaCl2·2H2O 1.5～3.1g/L，MnCl2·4H2O0.32g/L，ZnSO4·7H2O 5.75g/L，CoCl2·6H2O 0.47g/L，FeSO4·7H2O 2.8g/L，Na2MO4·2H2O0.48g/L，0.5M EDTA 80ml/L。
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