CN109722401A - 生产新型靛蓝染料谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种构建重组谷氨酸棒杆菌生产新型靛蓝染料的方法，属于生物工程领域。通过将靛蓝合成酶基因(bpsA)及4’‑磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因(sfp)克隆重组，共表达至谷氨酸棒杆菌中，构建重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032‑(BpsA‑SFP)，该重组谷氨酸棒杆菌能以L‑谷氨酰胺为底物合成靛蓝染料。摇瓶发酵培养LBG液体培养基中，温度为30℃，发酵培养至菌体生长OD600达到0.6‑0.8时，加入0.8mM IPTG及L‑谷氨酰胺11.68g/L，18℃，继续培养48h，靛蓝色素indigoidine产量最高，达到1.75g/L。本发明采用生物工程的策略，构建的重组谷氨酸棒杆菌来合成目的产物靛蓝色素indigoidine，为生物法高产indigoidine提供了新的思路。

Description

生产新型靛蓝染料谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生产靛蓝重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

染料是人类工业生产和生活中必不可少的重要物质之一。我国是世界染料生产大国，常年生产量约占世界70％以上。据国家统计局统计数据显示，2015年我国染料销售额达到830亿元，预计2018年将超过千亿。工业染料大部分都是有机合成，成分中含有硫化氢、碱性物质和酸性物质等。传统染料生产工业产生的高盐废水和废酸是环境污染的重要源头之一。随着我国环境保护力度的加大，染料生产行业也面临着巨大的产业升级与淘汰压力。微生物发酵生产染料相对化学合成生产有着设备简单、条件吻合、污染少等众多优势。所以发展高效的微生物发酵生产染料核心技术是未来染料生产行业发展的出路之一。

目前，食品级的色素大多数以红色、黄色为主，而对于蓝色素，相对稀缺。可作为食品级的蓝色素有栀子蓝色素、藻蓝蛋白和靛蓝，其中靛蓝有天然的和人工合成的，实际应用的主要是人工合成的靛蓝。新型靛蓝染料(indigoidine)是一种来自细菌的天然色素。天然色素具有安全、营养、保健等优点，而人工合成的色素在合成的过程中，容易受到重金属等有毒化学物质的污染，也会对人体造成伤害。消费者对人工合成色素存在疑虑，越来越青睐添加天然色素的食品。因此，通过基因工程、酶工程等手段，改造微生物来生产天然色素得到众多研究者的关注。

Indigoidine是由非核糖体多肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthase,NRPS)催化两分子L-谷氨酰胺缩合而成。目前已经有关于靛蓝合成酶的报道，比如IndC(Erwinia chrysanthemi和Streptomyces aureofaciens CCM 3239)、BpsA(Streptomyceslavendulae)和Sc-IdnC(Streptomyces chromofuscus)。这些靛蓝合成酶的氨基酸序列同源性高，基本构造一致，都含有C(缩合)-A(腺苷酰化)-Ox(氧化)-T(巯基化)-TE(巯基水解)四个结构域。靛蓝合成酶需要一个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)将辅酶A上的4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移到巯基化结构域保守的丝氨酸残基上，使之活化。张等利用靛蓝合成酶Sc-IdnC在大肠杆菌的细胞中表达生产Indigoidine。值得注意的是，大肠杆菌在生产食品等相关物质中受到限制，同时大肠杆菌不是Indigoidine的生物合成原料谷氨酰胺的高效生产菌株，使得Indigoidine后期产量的提高遇到瓶颈。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了以谷氨酰胺为原料开发靛蓝染料的新型生产菌株和方法。通过将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因通过克隆重组，共表达至谷氨酸棒杆菌中，构建重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌能以L-谷氨酰胺为底物合成靛蓝染料。

本发明的第一个目的是提供一种生产靛蓝的重组谷氨酸棒杆菌，其通过共表达靛蓝合成酶及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，进而合成靛蓝染料。

所述共表达，是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子或者同一载体不同启动子或者分别克隆到两个载体上进行表达。

优选地，是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子下进行表达。

在本发明的一个具体实施方式中，是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于pEC-XK99E载体Ptrc启动子下进行表达。

示例性地，所述靛蓝合成酶来源于以下任意一种：Streptomyces lavendulae来源的靛蓝合成酶BpsA、Erwinia chrysanthemi和Streptomyces aureofaciens CCM 3239来源的靛蓝合成酶IndC、Streptomyces chromofuscus来源的靛蓝合成酶Sc-IndC。优选地，所述靛蓝合成酶来源于Streptomyces lavendulae。

示例性地，所述4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶来源于Bacillus subtilis。

在本发明的一个具体实施方式中，靛蓝合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶在NCBI上登录号为ACG68433，其氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明的第二个目的是提供一种重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其包括如下步骤：

将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子或者同一载体不同启动子或者分别克隆到两个载体，

再转化到谷氨酸棒杆菌中，得到重组谷氨酸棒杆菌。

示例性地，在靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶之间添加SD序列再将该序列置于同一载体同一启动子，转化到谷氨酸棒杆菌中，得到重组谷氨酸棒杆菌。其中，所述SD序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述载体为pEC-XK99E，所述启动子为Ptrc

在本发明的一个具体实施方式中，重组谷氨酸棒杆菌的构建具体如下：

以来源于Streptomyces lavendulae的基因组为模板扩增靛蓝合成酶基因bpsA，以来源于Bacillus subtilis的基因组为模板扩增4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp，设计引物时在4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp上游扩增引物中引入SD序列，并且在靛蓝合成酶基因bpsA、4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp及pEC-XK99E载体的扩增引物中添加同源重组序列20bp，按照顺序克隆到载体pEC-XK99E上，筛选获得正确的重组质粒，命名为pEC-XK99E-BpsA-SFP，将重组质粒转化到宿主谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)当中即得到C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)；

本发明的第三个目的是提供一种利用所述重组谷氨酸棒杆菌在生产靛蓝染料中的应用。

本发明的第四个目的是提供利用所述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产靛蓝染料的方法，所述方法是以L-谷氨酰胺为底物催化合成靛蓝染料。

示例性地，所述方法包括以下步骤：

采用摇瓶发酵，将重组谷氨酸棒杆菌种子液以1％的接种量接种到发酵培养基中，18℃-30℃，180-220rpm培养48-72h。

在本发明的一个具体实施方式中，

具体步骤是，从保存有重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的固体培养基上挑取单菌落至5mL含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基当中，30℃，200rpm培养16h，即得到重组菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的种子培养液；所述的固体培养中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别是：胰蛋白胨1％；酵母提取物0.5％；NaCl 1％；葡萄糖0.5％；琼脂2％；pH 7.0。所述LBG培养基中各组分用量占LBG培养基质量用量的百分比分别为胰蛋白胨1％；酵母提取物0.5％；NaCl 1％；葡萄糖0.5％；pH7.0。摇瓶发酵培养时，将种子培养液按1％接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基中，温度为30℃，转速为220rpm，发酵培养至菌体生长OD600达到0.6-0.8时，加入0.8mM IPTG及L-谷氨酰胺11.68g/L，18℃，继续培养48h。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过共表达的方法，通过将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因克隆重组，共表达至谷氨酸棒杆菌中，得到的重组谷氨酸棒杆菌能以L-谷氨酰胺为直接底物合成indigoidine。谷氨酸棒杆菌是已知的谷氨酰胺生产菌株，以它作为indigoidine的新型生产菌株，在上其潜在产能将大大超过大肠杆菌。并且由于该色素是一种来源于谷氨酸棒杆菌的天然色素，在生产过程中无污染，且对人体无毒害，因此在未来的研究中，可以将该色素用作工业染料甚至是食品添加色素。(2)通过摸索L-谷氨酰胺添加量、IPTG浓度和诱导温度对重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032-(BpsA-SFP)发酵生产indigoidine进行了优化。在诱导温度18℃时，IPTG为0.8mM及L-谷氨酰胺添加量为11.68g/L时，发酵48h产量最高可到达1.75g/L。

附图说明

图1：核磁共振氢谱(¹H-NMR)检测indigoidine的化学结构；

图2：indigoidine标准曲线的制作：A.菌体中indigoidine浓度标准曲线；B.上清液中indigoidine浓度标准曲线；

图3：采用共表达方式重组谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵产indigoidine：A.0.1mM的IPTG，添加不同浓度的L-谷氨酰胺(0、0.73、4.38、11.68)g/L，18℃诱导48h和72h时靛蓝染料indigoidine的产量；B.0.1mM IPTG，L-谷氨酰胺分别(4.38、11.68)g/L，不同温度18℃、25℃、30℃诱导48h和72h时indigoidine的产量；C.L-谷氨酰胺浓度为11.68g/L，添加不同浓度的IPTG(0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.8mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM)诱导时indigoidine的产量。

具体实施方式

实施例1重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的构建

以紫灰链霉菌(S.lavendulae)的基因组为模板，以bpsA-F和bpsA-R上下游引物扩增bpsA基因，以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的基因组为模板，sfp-F和sfp-R上下游引物扩增sfp基因，以pEC-XK99E质粒为模板，以pECbone1-F和pECbone1-R以及pECbone2-F和pECbone2-R两对上下游引物分别扩增载体片段pECbone。通过在引物5’端引入同源重组序列20bp，使得扩增产物之间都要具有能够相互同源重组的完全一致的序列(15bp-20bp)，这种带有同源重组序列的PCR产物按一定比例混合后，在Exnase^TM的催化下，仅需反应30min即可进行转化，转化至E.coli JM109中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒pEC-XK99E-(BpsA-SFP)，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒电转入表达宿主C.glutamicum ATCC 13032中，重组克隆子经PCR验证正确，命名为C.glutamicum ATCC13032-(BpsA-SFP)，即为共表达bpsA基因、sfp基因的重组谷氨酸棒杆菌。

表1为实施例1中用到的引物。

表1引物

实施例2靛蓝染料的提取和分析

收集菌体后，加入10mg/mL的二甲基亚砜(DMSO)，采用超声破碎法破碎菌体，6000rpm，离心15min，将上清液置于新的50mL离心管中再次离心，直至离心管中无菌体被离心下来。将上清液通过0.2μM的微孔滤膜过滤，过滤后的上清液中加入5倍体积DMSO的超纯水，将超纯水与菌液的混合液体23℃，12000rpm离心1h，弃去上清，用超纯水水冲洗菌体，然后将溶于超纯水的菌体用旋转蒸发仪蒸干。称取蒸干的indigoidine粉末0.02g，用氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)溶解，用1.5mL离心管23℃，12000rpm离心15min，将溶液转移到核磁管中，用核磁共振氢谱(¹H-NMR)检测分析indigoidine的化学结构。

实施例3靛蓝染料标准曲线的制备

取1mg纯化的indigoidine溶于1mL的二甲基亚砜(DMSO)当中，配成浓度为1mg/mL的indigoidine溶液。将此标准溶液连续稀释成不同浓度：0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL。采用分光光度计于600nm波长下检测分别检测上述5种不同浓度标准溶液的的吸光度。以indigoidine的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，线性拟合得到indigoidine的标准曲线。由于在菌体和发酵后的上清液均含有indigoidine，所以分别做出菌体和上清液中indigoidine标品浓度曲线。菌体中indigoidine标品的标准曲线R²＝0.996，上清液中indigoidine标品的标准曲线R²＝0.992，二者线性良好，符合使用标准。

实施例4重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)摇瓶发酵生产indigoidine

从保存有重组菌株谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的固体培养基上挑取单菌落至5mL含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基当中，30℃，200rpm培养16h，即得到重组菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的种子培养液。将种子培养液按1％接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基中，温度为30℃，转速为220rpm，发酵培养至菌体生长OD600达到0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG，18℃诱导48h和72h。诱导48h比72h靛蓝色素indigoidine产量高，达到1.19g/L。

实施例5重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)摇瓶发酵不同浓度的L-谷氨酰胺条件下生产靛蓝染料

从保存有重组菌株谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的固体培养基上挑取单菌落至5mL含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基当中，30℃，200rpm培养16h，即得到重组菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的种子培养液。将种子培养液按1％接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基中，温度为30℃，转速为220rpm，发酵培养至菌体生长OD600达到0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG及不同浓度的L-谷氨酰胺(0、0.73、4.38、11.68)g/L，18℃诱导48h和72h。当L-谷氨酰胺浓度的添加量为11.68g/L时，诱导48h，靛蓝色素indigoidine产量最高，达到1.47g/L。

实施例6重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)摇瓶发酵在不同温度条件下生产indigoidine

从保存有重组菌株谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的固体培养基上挑取单菌落至5mL含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基当中，30℃，220rpm培养16h，即得到重组菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的种子培养液。将种子培养液按1％接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基中，温度为30℃，转速为220rpm，发酵培养至菌体生长OD600达到0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG及L-谷氨酰胺(4.38、11.68)g/L，在不同温度18℃、25℃、30℃条件下诱导48h和72h。18℃诱导的靛蓝色素indigoidine产量高于25℃诱导。当L-谷氨酰胺浓度的添加量为11.68g/L时，18℃诱导48h，indigoidine产量最高，可以达到1.47g/L。

实施例7重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)摇瓶发酵不同浓度的IPTG诱导下生产indigoidine

从保存有重组菌株谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的固体培养基上挑取单菌落至5mL含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基当中，30℃，220rpm培养16h，即得到重组菌C.glutamicum ATCC 13032-(BpsA-SFP)的种子培养液。将种子培养液按1％接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基中，温度为30℃，转速为220rpm，发酵培养至菌体生长OD600达到0.6-0.8时，加入L-谷氨酰胺11.68g/L及不同浓度的IPTG(0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.8mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM)，在18℃条件下诱导48h和72h。当IPTG浓度的添加量为0.8mM时，诱导48h，indigoidine产量最高，达到1.75g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 生产新型靛蓝染料谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

<130> 2017.9.1

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaggagttg aga 13

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgactcttc aggagaccag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctactctccg agcaggtacc 20

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccggtacct gctcggagag tagaaaggag ttgagaatga agatttacgg aattta 56

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacagccaag cttgcatgcc tgcagttata aaagctcttc gtacg 45

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctgcaggcat gcaagcttgg ct 22

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccatgtaagc ccactgcaag ctacc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggtagcttgc agtgggctta catgg 25

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcacgctggt ctcctgaaga gtcattctca actcctttgg taccg 45

<210> 10

<211> 3852

<212> DNA

<213> Streptomyces lavendulae

<400> 10

atgactcttc aggagaccag cgtgcttgag cccaccctgc gcggcaccac cacgttgccc 60

gacctgctgg cgaagcgggt cgcggagcac ccagaggcga ccgccgtcgc ctaccgggac 120

gagaagctca cctaccgcga gctggcgtcc agaagctccg ccctcgccga gtacctcaga 180

cacctcgggg tctcgacgga cgactgcgtc ggcctcttcg tcgagccgtc catcgacctg 240

atggtcggcg cctggggcat cctgtccgcc ggcgccgcct acctgccgct gtccccggag 300

taccccgagg accggctccg ctacatgatc gagaacagcc aggcgaagat catcctggcg 360

cagcagcgcc tggtcacccg cctgcgcgag ctggccccgc aggacgtcag ggtcgtcacc 420

ctgcgcgagt ccgaggcgtt cgtcctgccc gagggccagg tggccccggc catcgagggc 480

gcccgccccg acagcctcgc ctacgtcatc tacacctccg gcagcacggg caagccgaag 540

ggcgtgatga tcgagcacca cagcatcgtc agccagctcg gctggctgcg cgagacctac 600

ggcatcgacc gcagcaagac catcctgcag aagaccccga tgagcttcga cgccgcccag 660

tgggagatcc tctccccggc caacggtgcc accgtcgtca tgggcgcccc cggcgtctac 720

gccgaccccg agggcctcat cgagaccatc gtcaagtacg gcgtgaccac cctgcagtgc 780

gtccccaccc tgctccaggg cctgctcgac accgagaagt tccccgagtg cacctccctg 840

cagcagatct tcagcggtgg cgaggccctc tcgcgcctcc tggcgatcca gaccacgcag 900

gagatgcccg gccgcgccct gatcaacgtc tacgggccga ccgagtgcac catcaactcc 960

tcctcgtacg cggtcgaccc cgccgagctg ggcgaggcgc cgcagtccat ctccatcggc 1020

gccccggttg ccgacaccga gtaccacatc ctcggcaagg aggacctcaa gcccgtcggc 1080

gtcggcgaga tcggcgagct gtacatcggc ggcggtcagc tggcgcgcgg ctacctgcac 1140

cgccccgacc tgaccgccga gcgcttcctg gagatcgagg tcaccgaggg cgccggtccg 1200

gtccgcctct acaagacggg cgacctgggc cagtggaacc cggacggcac cgtgcagttc 1260

gccggccgcg ccgacaacca ggtcaagctg cgcggctacc gcgtcgagct ggacgagata 1320

tccctggcga tcgagaacca cgactgggtc cgcaacgccg ccgtcatcgt caagaacgac 1380

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ggccaggtcc ccgcggccta ctcgcgcaag gccgccgacc tggcgccggc cgaactgggc 1740

cagatcctgc gctggttcgg ccagtacctc agcgaggagc ggctgctgcc caagtacggc 1800

tacgcctccc cgggcgcgct gtacgcgacg cagctgtact tcgagctgga gggcgtcggc 1860

gggctgcagc cgggctacta ctactaccag ccgcagcgcc accagctggt cctgatcagc 1920

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gtcaccctcg gcaagaagct ccagcacctg atgatgaacg gcctcggcct cggcttcatg 2460

tcctcgggct acagctcgaa gaccggcaac ccgctgccgg cctcccgccg gatcgactcc 2520

gtcctgcagg cgaacggcgt cgagagcggt ccgtcgtact tcttcgtcgg cggccgcgtc 2580

agcgacgagc agctcggcca cgagggcatg cgcgaggaca gcgtccacat gcgcggtccg 2640

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gtcgtggtgt tcgagcggct gccgctgtcc gccaacggca agatcgacgc gaaggcgctg 2760

gccgcctccg accaggtcaa cgccgagctc gtggagcggc ccttcgtcgc cccgcgcacc 2820

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gtccaggacg acttcttcga gtcgggcggc aactcgctga tcgccgtcgg cctcatccgc 2940

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gtcgagaagc tctcccgccg cctggagcgc gaggtcgcgc aggagtcctc ccggctggtg 3060

cgcctgcacg cggagaccgg caaggaccgt ccggtgctgt gctggccggg cctgggcggc 3120

tacccgatga acctgcgcac cctggccggc gagatcggcc tcggccgctc gttctacggc 3180

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aaggtggaca acctcttcct gatcgccccg ggctcgccga ccgtgcgcgc cgagaacggc 3420

aaggtgtacg gccgtgaggc gtccttcgcc aaccgcgcct acacgaccat cctcttctcg 3480

gtgttcaccg gcaccatttc gggtccggac ctggaaaagt gcctggaatc cgccacggac 3540

gaggagtcct tcgccgggtt catcagcgaa ctgaagggaa tcgacgtcga tctggcgaag 3600

cggatcatct cggtcgtggg gcagacctac gaattcgagt actcgttccg tgagctggcc 3660

gagcgcaccc tggccgcgcc ggtgaccata ttcaaggccc gcggcgacga ctactcgttc 3720

atcgagaaca gcaacggtta ctccgccgag cccccgacgg tcatcgacct cgacgccgac 3780

cactacagcc tgctccgcac cccggacatc ggcgagctgg tcaagcacat ccggtacctg 3840

ctcggagagt ag 3852

<210> 11

<211> 1283

<212> PRT

<213> Streptomyces lavendulae

<400> 11

Met Thr Leu Gln Glu Thr Ser Val Leu Glu Pro Thr Leu Arg Gly Thr

1 5 10 15

Thr Thr Leu Pro Asp Leu Leu Ala Lys Arg Val Ala Glu His Pro Glu

20 25 30

Ala Thr Ala Val Ala Tyr Arg Asp Glu Lys Leu Thr Tyr Arg Glu Leu

35 40 45

Ala Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Glu Tyr Leu Arg His Leu Gly Val

50 55 60

Ser Thr Asp Asp Cys Val Gly Leu Phe Val Glu Pro Ser Ile Asp Leu

65 70 75 80

Met Val Gly Ala Trp Gly Ile Leu Ser Ala Gly Ala Ala Tyr Leu Pro

85 90 95

Leu Ser Pro Glu Tyr Pro Glu Asp Arg Leu Arg Tyr Met Ile Glu Asn

100 105 110

Ser Gln Ala Lys Ile Ile Leu Ala Gln Gln Arg Leu Val Thr Arg Leu

115 120 125

Arg Glu Leu Ala Pro Gln Asp Val Arg Val Val Thr Leu Arg Glu Ser

130 135 140

Glu Ala Phe Val Leu Pro Glu Gly Gln Val Ala Pro Ala Ile Glu Gly

145 150 155 160

Ala Arg Pro Asp Ser Leu Ala Tyr Val Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr

165 170 175

Gly Lys Pro Lys Gly Val Met Ile Glu His His Ser Ile Val Ser Gln

180 185 190

Leu Gly Trp Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Ile Asp Arg Ser Lys Thr Ile

195 200 205

Leu Gln Lys Thr Pro Met Ser Phe Asp Ala Ala Gln Trp Glu Ile Leu

210 215 220

Ser Pro Ala Asn Gly Ala Thr Val Val Met Gly Ala Pro Gly Val Tyr

225 230 235 240

Ala Asp Pro Glu Gly Leu Ile Glu Thr Ile Val Lys Tyr Gly Val Thr

245 250 255

Thr Leu Gln Cys Val Pro Thr Leu Leu Gln Gly Leu Leu Asp Thr Glu

260 265 270

Lys Phe Pro Glu Cys Thr Ser Leu Gln Gln Ile Phe Ser Gly Gly Glu

275 280 285

Ala Leu Ser Arg Leu Leu Ala Ile Gln Thr Thr Gln Glu Met Pro Gly

290 295 300

Arg Ala Leu Ile Asn Val Tyr Gly Pro Thr Glu Cys Thr Ile Asn Ser

305 310 315 320

Ser Ser Tyr Ala Val Asp Pro Ala Glu Leu Gly Glu Ala Pro Gln Ser

325 330 335

Ile Ser Ile Gly Ala Pro Val Ala Asp Thr Glu Tyr His Ile Leu Gly

340 345 350

Lys Glu Asp Leu Lys Pro Val Gly Val Gly Glu Ile Gly Glu Leu Tyr

355 360 365

Ile Gly Gly Gly Gln Leu Ala Arg Gly Tyr Leu His Arg Pro Asp Leu

370 375 380

Thr Ala Glu Arg Phe Leu Glu Ile Glu Val Thr Glu Gly Ala Gly Pro

385 390 395 400

Val Arg Leu Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Gly Gln Trp Asn Pro Asp Gly

405 410 415

Thr Val Gln Phe Ala Gly Arg Ala Asp Asn Gln Val Lys Leu Arg Gly

420 425 430

Tyr Arg Val Glu Leu Asp Glu Ile Ser Leu Ala Ile Glu Asn His Asp

435 440 445

Trp Val Arg Asn Ala Ala Val Ile Val Lys Asn Asp Gly Arg Thr Gly

450 455 460

Phe Gln Asn Leu Ile Ala Cys Val Glu Leu Ser Glu Lys Glu Ala Ala

465 470 475 480

Leu Met Asp Gln Gly Asn His Gly Ser His His Ala Ser Lys Lys Ser

485 490 495

Lys Leu Gln Val Lys Ala Gln Leu Ser Asn Pro Gly Leu Arg Asp Asp

500 505 510

Ala Asp Leu Ala Ala Arg Val Ala Tyr Asp Leu Pro Gly Ala Glu Pro

515 520 525

Thr Pro Glu Gln Arg Ser Arg Val Phe Ala Arg Lys Thr Tyr Arg Phe

530 535 540

Tyr Glu Gly Gly Ala Val Thr Glu Ala Asp Leu Leu Ala Leu Leu Gly

545 550 555 560

Gly Gln Val Pro Ala Ala Tyr Ser Arg Lys Ala Ala Asp Leu Ala Pro

565 570 575

Ala Glu Leu Gly Gln Ile Leu Arg Trp Phe Gly Gln Tyr Leu Ser Glu

580 585 590

Glu Arg Leu Leu Pro Lys Tyr Gly Tyr Ala Ser Pro Gly Ala Leu Tyr

595 600 605

Ala Thr Gln Leu Tyr Phe Glu Leu Glu Gly Val Gly Gly Leu Gln Pro

610 615 620

Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gln Pro Gln Arg His Gln Leu Val Leu Ile Ser

625 630 635 640

Glu Lys Ala Ala Thr Gly Arg Pro Thr Ala His Ile His Phe Ile Gly

645 650 655

Lys Arg Gly Gly Ile Glu Pro Val Tyr Lys Asn Asn Ile Gln Glu Val

660 665 670

Leu Glu Ile Glu Thr Gly His Ile Val Gly Leu Phe Glu Gln Val Leu

675 680 685

Pro Ala Tyr Gly Leu Asp Ile Arg Asp Leu Ala Tyr Glu Pro Ala Val

690 695 700

Arg Asp Leu Leu Asp Val Pro Glu Glu Asp Phe Tyr Leu Gly Thr Phe

705 710 715 720

Glu Leu Val Pro His Thr Gly Arg Arg Glu Asp His Ala Glu Val Tyr

725 730 735

Val Gln Thr His Gly Ser Lys Val Ala Asn Leu Pro Glu Gly Gln Tyr

740 745 750

Arg Tyr Ala Asp Gly Thr Leu Thr Arg Phe Ser Asp Asp Ile Val Leu

755 760 765

Lys Lys Gln Val Ile Ala Ile Asn Gln Ser Val Tyr Gln Ala Ala Ser

770 775 780

Phe Gly Ile Ser Val Ile Ser Arg Ala Pro Glu Glu Trp Met His Tyr

785 790 795 800

Val Thr Leu Gly Lys Lys Leu Gln His Leu Met Met Asn Gly Leu Gly

805 810 815

Leu Gly Phe Met Ser Ser Gly Tyr Ser Ser Lys Thr Gly Asn Pro Leu

820 825 830

Pro Ala Ser Arg Arg Ile Asp Ser Val Leu Gln Ala Asn Gly Val Glu

835 840 845

Ser Gly Pro Ser Tyr Phe Phe Val Gly Gly Arg Val Ser Asp Glu Gln

850 855 860

Leu Gly His Glu Gly Met Arg Glu Asp Ser Val His Met Arg Gly Pro

865 870 875 880

Ala Glu Leu Ile Arg Asp Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Asp Tyr Met

885 890 895

Ile Pro Asn Arg Val Val Val Phe Glu Arg Leu Pro Leu Ser Ala Asn

900 905 910

Gly Lys Ile Asp Ala Lys Ala Leu Ala Ala Ser Asp Gln Val Asn Ala

915 920 925

Glu Leu Val Glu Arg Pro Phe Val Ala Pro Arg Thr Glu Thr Glu Lys

930 935 940

Glu Ile Ala Glu Val Trp Ala Lys Ser Leu Arg Arg Glu Ser Val Ser

945 950 955 960

Val Gln Asp Asp Phe Phe Glu Ser Gly Gly Asn Ser Leu Ile Ala Val

965 970 975

Gly Leu Ile Arg Glu Leu Asn Ser Arg Leu Gly Val Ser Leu Pro Leu

980 985 990

Gln Ser Val Leu Glu Ser Pro Thr Val Glu Lys Leu Ser Arg Arg Leu

995 1000 1005

Glu Arg Glu Val Ala Gln Glu Ser Ser Arg Leu Val Arg Leu His Ala

1010 1015 1020

Glu Thr Gly Lys Asp Arg Pro Val Leu Cys Trp Pro Gly Leu Gly Gly

1025 1030 1035 1040

Tyr Pro Met Asn Leu Arg Thr Leu Ala Gly Glu Ile Gly Leu Gly Arg

1045 1050 1055

Ser Phe Tyr Gly Ile Gln Ala His Gly Ile Asn Glu Gly Glu Ala Pro

1060 1065 1070

Tyr Ala Thr Ile Thr Glu Met Ala Lys Ala Asp Ile Glu Ala Ile Lys

1075 1080 1085

Glu Leu Gln Pro Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Trp Gly Tyr Ser Phe Gly

1090 1095 1100

Ala Arg Val Ala Phe Glu Thr Ala Tyr Gln Leu Glu Gln Ala Gly Glu

1105 1110 1115 1120

Lys Val Asp Asn Leu Phe Leu Ile Ala Pro Gly Ser Pro Thr Val Arg

1125 1130 1135

Ala Glu Asn Gly Lys Val Tyr Gly Arg Glu Ala Ser Phe Ala Asn Arg

1140 1145 1150

Ala Tyr Thr Thr Ile Leu Phe Ser Val Phe Thr Gly Thr Ile Ser Gly

1155 1160 1165

Pro Asp Leu Glu Lys Cys Leu Glu Ser Ala Thr Asp Glu Glu Ser Phe

1170 1175 1180

Ala Gly Phe Ile Ser Glu Leu Lys Gly Ile Asp Val Asp Leu Ala Lys

1185 1190 1195 1200

Arg Ile Ile Ser Val Val Gly Gln Thr Tyr Glu Phe Glu Tyr Ser Phe

1205 1210 1215

Arg Glu Leu Ala Glu Arg Thr Leu Ala Ala Pro Val Thr Ile Phe Lys

1220 1225 1230

Ala Arg Gly Asp Asp Tyr Ser Phe Ile Glu Asn Ser Asn Gly Tyr Ser

1235 1240 1245

Ala Glu Pro Pro Thr Val Ile Asp Leu Asp Ala Asp His Tyr Ser Leu

1250 1255 1260

Leu Arg Thr Pro Asp Ile Gly Glu Leu Val Lys His Ile Arg Tyr Leu

1265 1270 1275 1280

Leu Gly Glu

<210> 12

<211> 675

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 12

atgaagattt acggaattta tatggaccgc ccgctttcac aggaagaaaa tgaacggttc 60

atgactttca tatcacctga aaaacgggag aaatgccgga gattttatca taaagaagat 120

gctcaccgca ccctgctggg agatgtgctc gttcgctcag tcataagcag gcagtatcag 180

ttggacaaat ccgatatccg ctttagcacg caggaatacg ggaagccgtg catccctgat 240

cttcccgacg ctcatttcaa catttctcac tccggccgct gggtcattgg tgcgtttgat 300

tcacagccga tcggcataga tatcgaaaaa acgaaaccga tcagccttga gatcgccaag 360

cgcttctttt caaaaacaga gtacagcgac cttttagcaa aagacaagga cgagcagaca 420

gactattttt atcatctatg gtcaatgaaa gaaagcttta tcaaacagga aggcaaaggc 480

ttatcgcttc cgcttgattc cttttcagtg cgcctgcatc aggacggaca agtatccatt 540

gagcttccgg acagccattc cccatgctat atcaaaacgt atgaggtcga tcccggctac 600

aaaatggctg tatgcgccgc acaccctgat ttccccgagg atatcacaat ggtctcgtac 660

gaagagcttt tataa 675

<210> 13

<211> 224

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 13

Met Lys Ile Tyr Gly Ile Tyr Met Asp Arg Pro Leu Ser Gln Glu Glu

1 5 10 15

Asn Glu Arg Phe Met Thr Phe Ile Ser Pro Glu Lys Arg Glu Lys Cys

20 25 30

Arg Arg Phe Tyr His Lys Glu Asp Ala His Arg Thr Leu Leu Gly Asp

35 40 45

Val Leu Val Arg Ser Val Ile Ser Arg Gln Tyr Gln Leu Asp Lys Ser

50 55 60

Asp Ile Arg Phe Ser Thr Gln Glu Tyr Gly Lys Pro Cys Ile Pro Asp

65 70 75 80

Leu Pro Asp Ala His Phe Asn Ile Ser His Ser Gly Arg Trp Val Ile

85 90 95

Gly Ala Phe Asp Ser Gln Pro Ile Gly Ile Asp Ile Glu Lys Thr Lys

100 105 110

Pro Ile Ser Leu Glu Ile Ala Lys Arg Phe Phe Ser Lys Thr Glu Tyr

115 120 125

Ser Asp Leu Leu Ala Lys Asp Lys Asp Glu Gln Thr Asp Tyr Phe Tyr

130 135 140

His Leu Trp Ser Met Lys Glu Ser Phe Ile Lys Gln Glu Gly Lys Gly

145 150 155 160

Leu Ser Leu Pro Leu Asp Ser Phe Ser Val Arg Leu His Gln Asp Gly

165 170 175

Gln Val Ser Ile Glu Leu Pro Asp Ser His Ser Pro Cys Tyr Ile Lys

180 185 190

Thr Tyr Glu Val Asp Pro Gly Tyr Lys Met Ala Val Cys Ala Ala His

195 200 205

Pro Asp Phe Pro Glu Asp Ile Thr Met Val Ser Tyr Glu Glu Leu Leu

210 215 220

Claims (10)

1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌共表达靛蓝合成酶及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。

2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述共表达是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子或者同一载体不同启动子或者分别克隆到两个载体上进行表达。

3.根据权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述共表达是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子下表达；优选地，所述载体为pEC-XK99E，所述启动子为Ptrc。

4.根据权利要求1-3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述靛蓝合成酶基因来源于Streptomyces lavendulae或Erwinia chrysanthemi或Streptomycesaureofaciens CCM 3239或Streptomyces chromofuscus，优选地，所述靛蓝合成酶来源于Streptomyces lavendulae；所述4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶来源于Bacillussubtilis。

5.根据权利要求1-5任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述靛蓝合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

6.一种重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子或者同一载体不同启动子或者分别克隆到两个载体，再转化到谷氨酸棒杆菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子；优选地，所述靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶之间添加SD序列(如SEQ ID NO.1)。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述靛蓝合成酶基因来源于Streptomyces lavendulae或Erwinia chrysanthemi或Streptomyces aureofaciens CCM3239，优选地，所述靛蓝合成酶来源于Streptomyces lavendulae；所述靛蓝合成酶基因来源于Streptomyces lavendulae；所述载体为pEC-XK99E，所述启动子为Ptrc。

9.权利要求1-5任一所述重组谷氨酸棒杆菌或权利要求6-8任一所述方法构建得到的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产靛蓝染料中的应用。

10.一种发酵生产靛蓝染料的方法，所述方法为以L-谷氨酰胺为底物，利用权利要求1-5任一所述重组谷氨酸棒杆菌或权利要求6-8任一所述方法构建得到的重组谷氨酸棒杆菌，在18℃-30℃，180-220rpm培养条件下，发酵48-72h来生产靛蓝染料。