CN117904164A - 一种地衣芽孢杆菌工程菌及其在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用 - Google Patents
一种地衣芽孢杆菌工程菌及其在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种地衣芽孢杆菌工程菌及其在调控不同分子量γ‑聚谷氨酸的应用，利用地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法构建地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter‑pgdS，该方法利用筛选得到的不同表达强度的地衣芽孢杆菌内源性启动子，调控γ‑聚谷氨酸的分子量，根据表达强度可以分为强、中、弱三种表达强度，其中内源性启动子P2967较强表达强度，使得γ‑PGA的分子量最低下降至1.61×103kDa，并且提高了γ‑PGA的产量，证明地衣芽孢杆菌内源性启动子的调控策略对于为产生不同分子量的γ‑聚谷氨酸可行且有效的，为产生不同分子量的γ‑PGA提供了新路径。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌工程菌及其在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由微生物合成的一种胞外聚合物。它由谷氨酸单体通过γ-谷氨酰胺键聚合而成的一类均聚氨基酸，具有吸水性强、可降解、生物相容性强、无毒等优良特性，在工业、食品、医药、环境、农业、日化等行业都具有广阔的应用前景。γ-PGA的分子量是影响其在不同应用中的性能的一个重要因素之一。在不同的实际应用中，需要γ-PGA的分子量也不相同，例如在医药行业，需要的是低分子量γ-PGA。微生物发酵所得的γ-PGA的分子量通常大于1000kDa，不同的用途需要γ-PGA的分子量也不同。因此控制γ-聚谷氨酸的分子量显得十分重要。
相关技术中如中国发明专利申请CN 112175982 A通过构建了聚谷氨酸的外源合成途径，实现理性控制γ-PGA分子量的目的，其将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ-PGA合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达，在此基础上，利用不同强度的RBS调控元件调控合成酶基因簇各基因的表达水平获得的重组菌株所生产的γ-PGA分子量为295.47～28018kDa。中国发明专利申请CN 108624546 A针对解淀粉芽孢杆菌，通过异源表达不同来源的γ-PGA降解酶基因，控制诱导型启动子获取不同分子量范围的小分子γ-PGA。其聚谷氨酸降解酶的表达通过控制诱导剂的浓度、诱导时间控制聚谷氨酸降解酶的表达量，来获取分子量为20～16000kDa的小分子聚谷氨酸。中国发明专利申请CN 116064356 A通过在解淀粉芽孢杆菌工程菌中引入靶向聚谷氨酸降解酶基因pgdS的动态调控表达水平，根据dCas9蛋白特异性响应靶向sgRNA的调控特性和可被外源诱导的时空特异性的特性，实现一菌合成多种分子量聚谷氨酸，聚谷氨酸的分子量范围为50～1400kD。
然而，上述的相关研究是以外源基因自带表达原件而非自身基因组中的表达原件，这使得载体构建复杂，不易操作。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种地衣芽孢杆菌工程菌及其在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用。本申请选以地衣芽孢杆菌B.licheniformis CGMCC 2876为底盘菌株，通过不同强度的内源性启动子的调控策略，进而调控γ-PGA的分子量。
本发明的实施例提出了一种地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，其包括以下步骤：
(1)以B.licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板扩增内源性启动子，并与RBS序列和绿色荧光报告蛋白GFP序列进行SOE-PCR重叠串联，获得融合片段Ppromter-RBS-GFP；
(2)将所述融合片段Ppromter-RBS-GFP与线性的pHY300PLK-PamyL-TTtamyL表达载体连接，获得内源性启动子报告工程载体pHY-Ppromoter-GFP；
(3)将所述内源性启动子报告工程载体pHY-Ppromoter-GFP转化地衣芽孢杆菌B.liche niformis CGMCC 2876中，获得地衣芽孢杆菌内源性启动子的报告工程菌株Bl/pPpromoter-GFP；
(4)将地衣芽孢杆菌内源性启动子的报告工程菌株Bl/p Ppromoter-GFP中的GFP基因替换为γ-PGA降解酶基因pgdS，获得地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter-pgdS。
根据本发明实施例的一种地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，该方法利用筛选得到的不同表达强度的地衣芽孢杆菌内源性启动子，调控γ-聚谷氨酸的分子量，根据表达强度可以分为强、中、弱三种表达强度，其中内源性启动子P2967较强表达强度，使得γ-PGA的分子量最低下降至1.61×103kDa，并且提高了γ-PGA的产量，证明地衣芽孢杆菌内源性启动子的调控策略对于为产生不同分子量的γ-聚谷氨酸可行且有效的，为产生不同分子量的γ-PGA提供了新路径。
可选地，步骤(4)为：
以B.licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板进行扩增，并与RBS序列和γ-PGA降解酶PgdS序列进行SOE-PCR重叠串联，获得融合片段Ppromter-RBS-pgdS；
将所述融合片段Ppromter-RBS-GFP与线性的pHY300PLK-PamyL-TTtamyL表达载体连接，获得地衣芽孢杆菌分子量工程载体pHY-Ppromoter-pgdS；
将所述地衣芽孢杆菌分子量工程载体pHY-Ppromoter-pgdS转化到地衣芽孢杆菌B.licheniformis CGMCC 2876中，获得地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter-pgdS。
根据本发明的实施例，还提出了上述的构建方法构建出的地衣芽孢杆菌工程菌在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用。
根据本发明的实施例，利用上述工程菌Bl/pP2967-pgdS可降低γ-PGA平均分子量，例如在工程菌Bl/pP2967-pgdS中γ-PGA平均分子量从1.25×105kDa下降至1.61×103kDa，γ-PGA的产量提高了16.54％。
可选地，将所述地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter-pgdS接种至培养基中，温度37℃、转速200rpm的条件下培养56h，取56h发酵液测定所产γ-PGA的产量及平均分子量。
进一步地，将所述地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter-pgdS接种至pH为7.2新鲜的种子培养基中，于温度37℃转速200rpm的条件下培养16～18h，获得种子菌液；将所述种子菌液以2％的接种量接种至pH为7.2新鲜的发酵培养基中，于温度37℃转速200rpm的条件下培养56h。
进一步地，所述种子培养基的配方包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L尿素、0.5g/L酵母膏、0.1g/L KH2PO4、0.1g/L K2HPO4、0.1g/L NaCl和0.2g/L MgSO4·7H2O。
进一步地，所述发酵培养基的配方包括：13.9g/L葡萄糖、2.67g/L尿素、0.6g/L酵母、5.6g/L KH2PO4、1.4g/L K2HPO4、2g/L NaCl和0.048g/L MgSO4·7H2O。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例中地衣芽孢杆菌内源性启动子报告工程菌株的GFP基因表达水平图；
图2为本发明实施例中地衣芽孢杆菌分子量工程菌株Bl/pPpromoter-pgdS所产γ-PGA平均分子量比较图；
图3为本发明实施例中地衣芽孢杆菌分子量工程菌株Bl/pPpromoter-pgdS所产γ-PGA产量比较图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
种子培养基的配方为：10g/L葡萄糖、0.5g/L尿素、0.5g/L酵母膏、0.1g/L KH2PO4、0.1g/L K2HPO4、0.1g/L NaCl和0.2g/L MgSO4·7H2O。
发酵培养基的配方为：：13.9g/L葡萄糖、2.67g/L尿素、0.6g/L酵母、5.6g/LKH2PO4、1.4g/L K2HPO4、2g/L NaCl和0.048g/L MgSO4·7H2O。
B.licheniformis CGMCC 2876是实验室自主筛选的，保藏于CGMCC，保藏号CGMCCNo.2876。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1地衣芽孢杆菌内源性启动子报告工程菌株的构建
设计SOE-PCR引物，用于扩增Ppromter-RBS-GFP融合基因片段。
引物1：AAGCTTTTTCTGAATGCGATTTCAGTCGTTTTA(下划线为HinIII酶切位点)
引物2：GGTACCCTACTTAATTCTGACGCTTCCG(下划线为KpnI酶切位点)
以地衣芽孢杆菌B.licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板，进行如下PCR程序:(1)95℃，3min；(2)95℃，15s；(3)56～72℃，15s；(4)72℃，30～60s/kb；(2)-(4)步重复30～35个循环；(5)72℃，5～10min，4℃保存。
SOE-PCR反应体系如下表：
将融合表达SOE-PCR产物和表达载体pHY300PLK-PamyL-TTtamyL分别用限制性内切酶HinIII和KpnI双酶切，回收纯化后，将PCR产物和表达载体以3:1的比例用T4 DNA连接酶在16℃连接4h，构建内源性启动子报告工程载体pHY-Ppromoter-GFP。
将内源性启动子报告工程载体pHY-Ppromoter-GFP经提取，电击转入地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布盐酸四环素(Tetracycline)抗性平板，再在37℃培养8-12h，筛选转化子，从而获得内源性启动子报告工程菌株pHY-Ppromoter-GFP。
电转化具体步骤如下：
地衣芽孢杆菌感受态的制备：
(1)将B.licheniformis从-80℃冰箱中取出，在LB平板上划线活化获得单菌落后，用接种环挑取一环单菌落接种至50mL LB液体培养基中，于37℃，200rpm摇床中过夜培养12h。
(2)吸取2mL过夜培养的菌液至50mL生长培养基中，于37℃、200rpm摇床中培养约4-5h至对数中后期，此时细胞OD600约为0.85-0.95。
(3)取培养后的菌液40mL至无菌的50mL离心管中，置于冰上静置30min。使菌体停止生长，于4℃、5000g条件下离心以收集菌体。
(4)用预冷的无菌水40mL轻柔重悬洗涤细胞两次后，将细胞重悬于1mL预冷的EP缓冲液中。
(5)吸取100μL重悬好的感受态细胞分装于预冷的1.5mL离心管中，置于冰上以备电转化实验或保存于-80℃冰箱中备用。
地衣芽孢杆菌的电转：
(1)将感受态细胞与1μg制备好的过表达载体轻弹混匀后转移预冷的电击杯(0.1cm)中，于冰上静置1h。
(2)将电击杯放入电转化仪中，以2500V、4ms的条件进行脉冲转化。
(3)电击完成后，向电击杯中加入1mL复苏培养基，将感受态细胞重悬后，转移至离心管中，并于37℃、200rpm摇床中复苏培养5h。
(4)将复苏后的菌液于8000g条件下离心1min以浓缩菌液至100μL，吸取80μL浓缩后的菌液至含有5mg/L四环素的LB平板上，均匀涂布后于37℃培养箱中培养24h。
荧光法测定表达内源性启动子报告工程菌株的相对荧光强。以480nm的激发波长和516nm的发射波长测定GFP的相对荧光强度，结果如图1所示。结果显示，内源性启动子P2640、P2967和P3232的荧光强度较强，内源性启动子P3937、P3588、P3388和P2097的荧光强度中等，内源性启动子P3515的荧光强度较弱。其中，内源性启动子荧光强度最高的是Bl/pP2640-GFP工程菌株，达到8.89×103，第二高的是Bl/pP3232-GFP菌株和Bl/pP2967-GFP菌株，绿色荧光强度分别达到4.98×103和4.02×103。强荧光强度比中等荧光强度的P3388内源性启动子(2.17×102)高10.46倍。
实施例2地衣芽孢杆菌分子量工程菌株的构建
设计SOE-PCR引物，用于扩增Ppromter-RBS-pgdS融合基因片段。
引物3：GGATCCTTGATAAAAAAAGCGGCAAACAAAAAGTTGGTT(下划线为BamHI酶切位点)；
引物4：ACTAGTCTACTTAATTCTGACGCTTCCGGCGTATTTCTCT(下划线为SpeI酶切位点)；
以地衣芽孢杆菌B.licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板，进行如下PCR程序:(1)95℃，3min；(2)95℃，15s；(3)56～72℃，15s；(4)72℃，30～60s/kb；(2)-(4)步重复30～35个循环；(5)72℃，5～10min，4℃保存。
SOE-PCR反应体系如下表：
将融合表达SOE-PCR产物和表达载体pHY300PLK-PamyL-TTtamyL分别用限制性内切酶HinIII和KpnI双酶切，回收纯化后，将PCR产物和表达载体以3:1的比例用T4 DNA连接酶在16℃连接4h，构建地衣芽孢杆菌分子量工程载体pHY-Ppromoter-pgdS。
将地衣芽孢杆菌分子量工程载体pHY-Ppromoter-pgdS经提取，电击转入地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布盐酸四环素(Tetracycline)抗性平板，再在37℃培养8-12h，筛选转化子，从而获得地衣芽孢杆菌分子量工程菌株pHY-Ppromoter-pgdS。
实施例3利用地衣芽孢杆菌分子量工程菌发酵制备γ-PGA
(1)将保存在甘油管中的地衣芽孢杆菌B.licheniformis CGMCC 2876和实施例2所得的地衣芽孢杆菌分子量工程菌于平板培养基划线，挑取单菌落接入50mL种子培养基中，于37℃及200rpm的转速下，培养16～18h，获得种子培养液；
(2)将上述种子接入50mL发酵培养基中，接种量为2％，于37℃及200rpm的转速下，培养56h，得发酵液；
(5)取56h发酵液测定所产γ-PGA的产量及平均分子量。
具体结果如图2、图3所示，与原始菌株相比，工程菌株的分子量均有不同程度的下降。工程菌株产生γ-PGA的分子量范围为1.61×103kDa至2.03×104kDa。结果表明，可以通过调节pgdS的表达来获得具有广泛分子量的γ-PGA。其中，Bl/pP3232-pgdS和Bl/pP2967-pgdS中γ-PGA的平均分子量分别为1.89×103kDa和1.61×103kDa，降幅最大。
γ-PGA的平均分子量的测定方法如下：
(1)采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)方法测定。柱子型号：TSKgel GMPWXL；流率：0.5mL·min-1；柱温：35℃；柱压：10Bar；检测器：示差检测器。
(2)选取1kD、110kD、289kD、2164kD葡聚糖作为分子量的标准品，溶于水中，用0.45μm的水相滤膜过滤除去杂质。配置0.025％ Proclin溶液作为流动相。
(3)将发酵产物分离提取之后，准备0.1g冻干产物，溶于超纯水中，用10mL容量瓶定容，用0.45μm的水相滤膜过滤除去杂质。所得样品即可进行液相色谱分析。
γ-PGA产量的测定方法如下：
(1)采用高效液相色谱法(HPLC)。称取10mL发酵产物的冻干样品于10mL消解管中，加入5mL 6mol·L-1的盐酸，于105℃高温消解24h。
(2)用高浓度的NaOH将pH调至7.0，定容至10mL。最后0.22μm的有机相滤膜过滤除去杂质，保存于液相瓶待测。
(3)配制pH为2.5的0.1M KH2PO4溶液，并加入5％甲醇，混匀后用超声仪除去气泡。色谱条件：柱子型号：HC-C18色谱柱(25cm×4.6mm，Agilent)。紫外检测波长：210nm，柱温：30℃，流速：1.0mL·min-1，20μL进样量。
综上所述，根据本发明的实施例，利用内源性启动子调控γ-PGA的分子量，其中，Bl/pP3232-pgdS和Bl/pP2967-pgdS中γ-PGA的平均分子量分别为1.89×103kDa和1.61×103kDa，降幅最大，而且工程菌株Bl/pP2967-pgdS产生9.1的胞外聚合物和4.22g/L的γ-PGA，相比原始菌株分别增加了12.8％和16.54％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以B.licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板扩增内源性启动子，并与RB S序列和绿色荧光报告蛋白GFP序列进行SOE-PCR重叠串联，获得融合片段Ppromter-RBS-GFP；
(2)将所述融合片段Ppromter-RBS-GFP与线性的pHY300PLK-PamyL-TTtamyL表达载体连接，获得内源性启动子报告工程载体pHY-Ppromoter-GFP；
(3)将所述内源性启动子报告工程载体pHY-Ppromoter-GFP转化到地衣芽孢杆菌B.licheniformis CGMCC 2876中，获得地衣芽孢杆菌内源性启动子的报告工程菌株Bl/pPpromo ter-GFP；
(4)将地衣芽孢杆菌内源性启动子的报告工程菌株Bl/p Ppromoter-GFP中的GFP基因替换为γ-PGA降解酶基因pgdS，获得地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter-pgdS。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)为：
以B.licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板进行扩增，并与RBS序列和γ-PGA降解酶PgdS序列进行SOE-PCR重叠串联，获得融合片段Ppromter-RBS-pgdS；
将所述融合片段Ppromter-RBS-GFP与线性的pHY300PLK-PamyL-TTtamyL表达载体连接，获得地衣芽孢杆菌分子量工程载体pHY-Ppromoter-pgdS；
将所述地衣芽孢杆菌分子量工程载体pHY-Ppromoter-pgdS转化到地衣芽孢杆菌B.
licheniformis CGMCC 2876中，获得地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter-pgdS。
3.如权利要求1或2所述的构建方法构建出的地衣芽孢杆菌工程菌在调控不同分子量γ-聚谷氨酸的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter-pgdS接种至培养基中，温度37℃、转速200rpm的条件下培养56h，取56h发酵液测定所产γ-PGA的产量及平均分子量。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述地衣芽孢杆菌工程菌Bl/pPpromoter-pgdS接种至pH为7.2新鲜的种子培养基中，于温度37℃转速200rpm的条件下培养16～18h，获得种子菌液；将所述种子菌液以2％的接种量接种至pH为7.2新鲜的发酵培养基中，于温度37℃转速200rpm的条件下培养56h。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述种子培养基的配方包括：10g/L葡萄糖、0.5g/L尿素、0.5g/L酵母膏、0.1g/L KH2PO4、0.1g/L K2HPO4、0.1g/L NaCl和0.2g/L MgSO4·7H2O。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方包括：13.9g/L葡萄糖、2.67g/L尿素、0.6g/L酵母、5.6g/L KH2PO4、1.4g/L K2HPO4、2g/L NaCl和0.048g/LMgSO4·7H2O。
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