CN114438024A - 一种干细胞制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：选取脐带样品、脐带样品处理、设置初始培养基、设置完整培养基、离心收集细胞悬液、细胞悬液再培养、加入血白蛋白等等。本发明与现有技术相比的优点在于：本发明提供的干细胞制剂的制备方法的P4代脐带间充质干细胞具有细胞数量多且表型稳定，用细胞筛过滤细胞制剂，将成团细胞过滤掉，防止细胞成团，大大提高了细胞活率。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞细胞实验领域，具体是指一种干细胞制剂的制备方法。
背景技术
近来，脐带间充质干细胞成为研究的热点。脐带MSCs来源广泛，易获得，并具有MSCs的所有特性。与骨髓来源的MSCs进行对比，脐带间充质干细胞更高水平表达CD146，一种代表MSCs的多向分化能力的标志物，且分化增殖能力更强。脐带间充质干细胞在慢性脊髓损伤的临床治疗研究结果显示，接受治疗的患者改善明显，生活质量得到很大提高，而不良反应发生率低，是非常安全的治疗方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足之处，提供一种干细胞制剂的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、选取脐带样品，将脐带与胶体金、荧光定量PCR混合后，检测脐带血清成分；
步骤二、脐带样品处理，脐带样品从采集瓶中取出并置于无菌器皿中，用无菌手术剪剪成1-4cm的脐带小段样品后分别放入无菌烧杯中进行表面清洗，清洗完成后放入弯盘并用无菌手术剪剪成1-3mm的脐带小块样品，并将脐带小块样品均匀铺设在培养皿底部；
步骤三、设置初始培养基，将带有脐带小块样品的培养皿放入干燥箱干燥40min，拿出后向培养皿内放入富含15％添加物的培养基，保证每周更换一次培养基并在期间观察组织贴块边缘细胞生长情况，待多数组织块细胞爬出且每个块组织块周围的细胞生长至75％融合值时，进行脐带间充质干细胞的原代传代；
步骤四、设置完整培养基，观察步骤三中的间充质干细胞细胞传至P3代时，6500cells/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入35ml的DF12完全培养基；待细胞长至90％左右融合时，用10mL PBS缓冲液冲洗细胞表面3次；
步骤五、将步骤四的PBS缓冲液清理干净后加入5mL胰蛋白酶消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶覆盖瓶底，迅速在镜下观察，待细胞皱缩成球状时轻轻拍打培养瓶外侧使细胞漂浮起来；用移液管移取两倍胰蛋白酶量的培养基至培养皿中，终止消化；
步骤六、离心收集细胞悬液，选用1600rpm的离心机进行10min离心处理，选用移液管将离心后的上清液去除并用40mL生理盐水重悬细胞，得到细胞筛过滤细胞悬液；
步骤七、细胞悬液再培养，取0.4mL过滤后的细胞悬液，用血球计数板计数，计算所需细胞量的细胞悬液体积，并取1*106细胞悬液做流式，用注射器抽出与所需细胞悬液体积相等的生理盐水，将细胞悬液打回100mL生理盐水袋中，轻轻颠倒生理盐水袋混匀细胞；
步骤八、加入血白蛋白，分别在0h、4h计数，计算细胞活率；制剂在8℃条件下分别储存0h、2h、4h、6h、24h并计算相应的细胞活率。
本发明与现有技术相比的优点在于：本发明提供的干细胞制剂的制备方法的P4代脐带间充质干细胞具有细胞数量多且表型稳定，用细胞筛过滤细胞制剂，将成团细胞过滤掉，防止细胞成团，大大提高了细胞活率。
进一步的，步骤一的成分检测包括抗-HCV、HCV-RNA、抗-HDV、抗HEV、抗-HIV-1/2、HIV-1-RNA 及CMV-DNA。
进一步的，步骤二中选用PBS缓冲液对脐带小段样品内外进行反复冲洗，直至PBS缓冲液冲洗后无血色。
进一步的，步骤三中培养基用量标准为浸没培养皿底部的脐带小块样品上沿且保证液面平齐。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明。
本发明在具体实施时，提出一种干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、选取脐带样品，将脐带与胶体金、荧光定量PCR混合后，检测脐带血清成分；
步骤二、脐带样品处理，脐带样品从采集瓶中取出并置于无菌器皿中，用无菌手术剪剪成1-4cm的脐带小段样品后分别放入无菌烧杯中进行表面清洗，清洗完成后放入弯盘并用无菌手术剪剪成1-3mm的脐带小块样品，并将脐带小块样品均匀铺设在培养皿底部；
步骤三、设置初始培养基，将带有脐带小块样品的培养皿放入干燥箱干燥40min，拿出后向培养皿内放入富含15％添加物的培养基，保证每周更换一次培养基并在期间观察组织贴块边缘细胞生长情况，待多数组织块细胞爬出且每个块组织块周围的细胞生长至75％融合值时，进行脐带间充质干细胞的原代传代；
步骤四、设置完整培养基，观察步骤三中的间充质干细胞细胞传至P3代时，6500cells/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入35ml的DF12完全培养基；待细胞长至90％左右融合时，用10mL PBS缓冲液冲洗细胞表面3次；P4代脐带间充质干细胞具有细胞数量多，表型稳定。
步骤五、将步骤四的PBS缓冲液清理干净后加入5mL胰蛋白酶消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶覆盖瓶底，迅速在镜下观察，待细胞皱缩成球状时轻轻拍打培养瓶外侧使细胞漂浮起来；用移液管移取两倍胰蛋白酶量的培养基至培养皿中，终止消化；
步骤六、离心收集细胞悬液，选用1600rpm的离心机进行10min离心处理，选用移液管将离心后的上清液去除并用40mL生理盐水重悬细胞，得到细胞筛过滤细胞悬液；用细胞筛过滤细胞制剂，将成团细胞过滤掉，防止细胞成团。
步骤七、细胞悬液再培养，取0.4mL过滤后的细胞悬液，用血球计数板计数，计算所需细胞量的细胞悬液体积，并取1*106细胞悬液做流式，用注射器抽出与所需细胞悬液体积相等的生理盐水，将细胞悬液打回100mL生理盐水袋中，轻轻颠倒生理盐水袋混匀细胞；
步骤八、加入血白蛋白，分别在0h、4h计数，计算细胞活率；制剂在8℃条件下分别储存0h、2h、 4h、6h、24h并计算相应的细胞活率。加入一定量的人血白蛋白可以提高细胞活率。完成后8℃储存，短期内细胞活率不会大幅度变化
步骤一的成分检测包括抗-HCV、HCV-RNA、抗-HDV、抗HEV、抗-HIV-1/2、HIV-1-RNA及CMV-DNA。
步骤二中选用PBS缓冲液对脐带小段样品内外进行反复冲洗，直至PBS缓冲液冲洗后无血色。
步骤三中培养基用量标准为浸没培养皿底部的脐带小块样品上沿且保证液面平齐。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.一种干细胞制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、选取脐带样品，将脐带与胶体金、荧光定量PCR混合后，检测脐带血清成分；
步骤二、脐带样品处理，脐带样品从采集瓶中取出并置于无菌器皿中，用无菌手术剪剪成1-4cm的脐带小段样品后分别放入无菌烧杯中进行表面清洗，清洗完成后放入弯盘并用无菌手术剪剪成1-3mm的脐带小块样品，并将脐带小块样品均匀铺设在培养皿底部；
步骤三、设置初始培养基，将带有脐带小块样品的培养皿放入干燥箱干燥40min，拿出后向培养皿内放入富含15％添加物的培养基，保证每周更换一次培养基并在期间观察组织贴块边缘细胞生长情况，待多数组织块细胞爬出且每个块组织块周围的细胞生长至75％融合值时，进行脐带间充质干细胞的原代传代；
步骤四、设置完整培养基，观察步骤三中的间充质干细胞细胞传至P3代时，6500cells/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入35ml的DF12完全培养基；待细胞长至90％左右融合时，用10mL PBS缓冲液冲洗细胞表面3次；
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步骤六、离心收集细胞悬液，选用1600rpm的离心机进行10min离心处理，选用移液管将离心后的上清液去除并用40mL生理盐水重悬细胞，得到细胞筛过滤细胞悬液；
步骤七、细胞悬液再培养，取0.4mL过滤后的细胞悬液，用血球计数板计数，计算所需细胞量的细胞悬液体积，并取1*106细胞悬液做流式，用注射器抽出与所需细胞悬液体积相等的生理盐水，将细胞悬液打回100mL生理盐水袋中，轻轻颠倒生理盐水袋混匀细胞；
步骤八、加入血白蛋白，分别在0h、4h计数，计算细胞活率；制剂在8℃条件下分别储存0h、2h、4h、6h、24h并计算相应的细胞活率。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤一的成分检测包括抗-HCV、HCV-RNA、抗-HDV、抗HEV、抗-HIV-1/2、HIV-1-RNA及CMV-DNA。
3.根据权利要求1所述的一种干细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤二中选用PBS缓冲液对脐带小段样品内外进行反复冲洗，直至PBS缓冲液冲洗后无血色。
4.根据权利要求1所述的一种干细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤三中培养基用量标准为浸没培养皿底部的脐带小块样品上沿且保证液面平齐。
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