CN112094812A

CN112094812A - 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法

Info

Publication number: CN112094812A
Application number: CN202011020647.2A
Authority: CN
Inventors: 于梦梦; 马超群
Original assignee: Zhengzhou Zoujue Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhengzhou Zoujue Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2020-12-18

Abstract

本发明公开了一种促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法，包括以下步骤：(1)取人骨髓间充质干细胞于基础培养基DMEM/F12中进行培养，待细胞融合度达到80‑90％时，用0.25％胰酶消化传代；(2)将上述步骤(1)传代培养得到的骨髓间充质干细胞接种至分化培养基上，进行诱导分化；所述分化培养基包括基础培养基Neurobasal培养基、胰岛素18‑22μg/mL、地塞米松10‑15ng/mL、抗坏血酸35‑40μg/mL、β‑谷甾醇15‑25μg/mL、纳米钛酸钡18‑22ng/mL、辣木叶提取物18‑25ng/mL、脱羧肌肽5‑10ng/mL、NGF 20‑30mg/mL。本发明将传代培养得到的骨髓间充干细胞接种于分化培养基上，并在分化培养基中添加β‑谷甾醇、纳米钛酸钡、辣木叶提取物协同作用，有效提高骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的效率，为神经元细胞在临床上的应用提供便利。

Description

一种促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，他是人体新生细胞从增殖、迁移、分化直至成熟过程中的第一个细胞，是细胞治疗和组织工程种子细胞的中药来源，常见的间充质干细胞来源于骨髓、外周血、脐带、脂肪等。在干细胞生物学中，探究细胞增殖和分化之间的关系具有重要的意义。

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。骨髓干细胞的可以分化成各种间充质来源的细胞，如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肝细胞、肌细胞、神经细胞等，是未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想种子细胞。骨髓干细胞生长和分化的方向取决于外局的微环境，体外诱导条件可以决定其分化方向。

长期以来神经系统损伤后神经细胞的再生移植困扰着人们，胚胎神经干细胞移植可促进神经损功能的恢复，但因伦理问题限制了其应用。骨髓间充质干细胞具有来源丰富，不涉及伦理问题等优点，可能为神经系统疾病的治疗提供新途径。但骨髓间充质干细胞移植后神经细胞转化率在体外可高达80％，在体内仅为3％～10％，而且在体内环境下分化为胶质细胞的比例较大，分化为神经细胞的比例较小，这无疑会给神经系统功能的恢复带来不利因素。如果能将骨髓基质细胞在体外分化为神经元样细胞，再进行细胞移植会有事半功倍的效果。现有的体外诱导分化的方法存在细胞分化率低，得到的神经元细胞的比例低，不能满足移植的需要，仍需要改善。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进骨髓间充质干细胞分化的方法，

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法，包括以下步骤：

(1)取人骨髓间充质干细胞于基础培养基DMEM/F12中进行培养，待细胞融合度达到80-90％时，用0.25％胰酶消化传代；

(2)将上述步骤(1)传代培养得到的骨髓间充质干细胞接种至分化培养基上，进行诱导分化；

所述分化培养基包括基础培养基Neurobasal培养基、胰岛素18-22μg/mL、地塞米松10-15ng/mL、抗坏血酸35-40μg/mL、β-谷甾醇15-25μg/mL、纳米钛酸钡18-22ng/mL、辣木叶提取物18-25ng/mL、脱羧肌肽5-10ng/mL、NGF 20-30mg/mL。

进一步地，所述分化培养基包括基础培养基Neurobasal培养基、胰岛素20μg/mL、地塞米松12ng/mL、抗坏血酸38μg/mL、β-谷甾醇20μg/mL、纳米钛酸钡20ng/mL、辣木叶提取物20ng/mL、脱羧肌肽8ng/mL、NGF 25mg/mL。

进一步地，所述纳米钛酸钡的平均粒径为50-100nm。

进一步地，所述步骤(1)中骨髓间充质干细胞接接种密度为1-2×10⁴个/mL。

进一步地，所述步骤(2)中骨髓间充质干细胞的接种密度为2-4×10³个/mL。

进一步地，所述步骤(2)中取传代培养至第3-5代的骨髓间充质干细胞接种至分化培养基。

进一步地，所述传代培养的比例为1:3-4。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的方法，将传代培养得到的骨髓间充干细胞接种于分化培养基上，培养基以Neurobasal培养基为基础培养基，在添加胰岛素、地塞米松、抗坏血酸、脱羧肌肽、NGF的同时，在上述基础培养基中还添加β-谷甾醇、纳米钛酸钡、辣木叶提取物协同作用，有效提高骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的效率，提高分化细胞中神经元细胞的比例，为神经元细胞的在临床上的应用提供保障，为神经系统疾病的治疗提供新途径。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

(1)取人骨髓间充质干细胞接种于12孔培养板中的基础培养基DMEM/F12中，接种密度为1×10⁴个/mL，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养，待细胞融合度达到80％时，用0.25％胰酶消化传代，传代培养的比例为1:3；

(2)将上述步骤(1)传代培养得到的第3代骨髓间充质干细胞接种至12孔培养板的分化培养基上，在37℃，5％CO₂的培养箱中进行诱导分化，接种密度为2×10³个/mL，每2天换液一次；

上述分化培养基包括基础培养基Neurobasal培养基、胰岛素20μg/mL、地塞米松12ng/mL、抗坏血酸38μg/mL、β-谷甾醇20μg/mL、平均粒径为50nm的纳米钛酸钡20ng/mL、辣木叶提取物20ng/mL、脱羧肌肽8ng/mL、NGF 25mg/mL。

实施例2

(1)取人骨髓间充质干细胞接种于12孔培养板中的基础培养基DMEM/F12中，接种密度为1.5×10⁴个/mL，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养，待细胞融合度达到85％时，用0.25％胰酶消化传代，传代培养的比例为1:4；

(2)将上述步骤(1)传代培养得到的第4代骨髓间充质干细胞接种至12孔培养板的分化培养基上，在37℃，5％CO₂的培养箱中进行诱导分化，接种密度为3×10³个/mL，每2天换液一次；

上述分化培养基包括基础培养基Neurobasal培养基、胰岛素18μg/mL、地塞米松10ng/mL、抗坏血酸35μg/mL、β-谷甾醇15μg/mL、平均粒径为80nm的纳米钛酸钡18ng/mL、辣木叶提取物18ng/mL、脱羧肌肽ng/mL、NGF 20mg/mL。

实施例3

(1)取人骨髓间充质干细胞接种于12孔培养板中的基础培养基DMEM/F12中，接种密度为2×10⁴个/mL，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养，待细胞融合度达到90％时，用0.25％胰酶消化传代，传代培养的比例为1:4；

(2)将上述步骤(1)传代培养得到的第5代骨髓间充质干细胞接种至12孔培养板的分化培养基上，在37℃，5％CO₂的培养箱中进行诱导分化，接种密度为4×10³个/mL，每2天换液一次；

上述分化培养基包括基础培养基Neurobasal培养基、胰岛素22μg/mL、地塞米松15ng/mL、抗坏血酸40μg/mL、β-谷甾醇25μg/mL、平均粒径为100nm的纳米钛酸钡22ng/mL、辣木叶提取物25ng/mL、脱羧肌肽10ng/mL、NGF 30mg/mL。

对比例1

对比例1提供促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的方法，和实施例1的区别为省去分化培养基中的β-谷甾醇，其余均和实施例1相同。

对比例2

对比例2提供促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的方法，和实施例1的区别为省去分化培养基中的纳米钛酸钡，其余均和实施例1相同。

对比例3

对比例3提供促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的方法，和实施例1的区别为省去分化培养基中的辣木叶提取物，其余均和实施例1相同。

对实施例1和对比例1至3中诱导培养的细胞进行细胞免疫染色，分别统计在诱导分化培养2d、4d和6d时具有神经元细胞特异性标志物TUJ1阳性和MAP2阳性的细胞占比，结果如表1所示。

表1

样品	2d	4d	6d
				实施例1	23％	55％	95％
对比例1	18％	42％	75％
				对比例2	12％	38％	64％
对比例3	15％	40％	70％

由表1可知：实施例1中的细胞在诱导培养过程中神经元细胞的比例增加速度高于对比例1至3，在培养第6d时，TUJ1和MAP2双阳性的神经元细胞占比高达95％，细胞纯度较高。对比例1至3中调整了分化培养基的组成，如对比例1中省去了β-谷甾醇，对比例2中省去了纳米钛酸钡，对比例3中省去了辣木叶提取物，由表1可知调整分化培养基的组成后细胞在诱导培养过程中神经元细胞增加的比例低于实施例1，说明本发明通过在骨髓间充质干细胞诱导分化过程中的分化培养基中添加β-谷甾醇、纳米钛酸钡、辣木叶提取物有效的提高了诱导得到细胞中神经元细胞的比例，提高细胞纯度，从而提高分化效率，为神经元细胞的移植等临床应用提供较大便利。

综上，本发明提供的促进骨髓基氨充质干细胞向神经元细胞分化的方法，在诱导分化过程中采用分化培养基，并对分化培养基的成分进行改进，在添加胰岛素、地塞米松、抗坏血酸脱羧肌肽和NGF的同时还添加β-谷甾醇、纳米钛酸钡、辣木叶提取物，成分间协同作用，促进促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞的分化，提高分化细胞中神经元细胞的比例，提高分化效率，为神经元细胞在临床上移植应用提供保障，为神经系统疾病的治疗提供新途径。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.一种促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述分化培养基包括基础培养基Neurobasal培养基、胰岛素18-22μg/mL、地塞米松10-15ng/mL、抗坏血酸35-40μg/mL、β-谷甾醇15-25μg/mL、纳米钛酸钡18-22ng/mL、辣木叶提取物18-25ng/mL、脱羧肌肽5-10ng/mL、NGF20-30mg/mL。

2.根据权利要求1所述促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法，其特征在于，所述分化培养基包括基础培养基Neurobasal培养基、胰岛素20μg/mL、地塞米松12ng/mL、抗坏血酸38μg/mL、β-谷甾醇20μg/mL、纳米钛酸钡20ng/mL、辣木叶提取物20ng/mL、脱羧肌肽8ng/mL、NGF 25mg/mL。

3.根据权利要求1所述促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法，其特征在于，所述纳米钛酸钡的平均粒径为50-100nm。

4.根据权利要求1所述促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤(1)中骨髓间充质干细胞接接种密度为1-2×10⁴个/mL。

5.根据权利要求1所述促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤(2)中骨髓间充质干细胞的接种密度为2-4×10³个/mL。

6.根据权利要求6所述促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤(2)中取传代培养至第3-5代的骨髓间充质干细胞接种至分化培养基。

7.根据权利要求1所述促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法，其特征在于，所述传代培养的比例为1:3-4。