CN107653227A - 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法 - Google Patents

一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107653227A
CN107653227A CN201711115769.8A CN201711115769A CN107653227A CN 107653227 A CN107653227 A CN 107653227A CN 201711115769 A CN201711115769 A CN 201711115769A CN 107653227 A CN107653227 A CN 107653227A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
stem cells
neurons
marrow stromal
stromal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711115769.8A
Other languages
English (en)
Inventor
胡小东
王健
赵翔
熊华强
宋彩霞
王仁杰
邱阳
黄启程
李国焱
唐玲
叶劲涛
曹玉昊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Sidemu Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Chongqing Sidemu Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Sidemu Biological Technology Co Ltd filed Critical Chongqing Sidemu Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201711115769.8A priority Critical patent/CN107653227A/zh
Publication of CN107653227A publication Critical patent/CN107653227A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法，诱导培养基包括以下组分：人参皂苷Rg1 1‑8mg/L、三七多糖0.3‑0.8mg/L、维生素C 5‑12mg/L、EGF 2‑10μg/L、葡萄籽提取物2‑5mg/L，神经元培养上清液补足。本发明通过特定的组分组成诱导培养基，用该诱导培养基诱导培养骨髓间充质干细胞向神经元分化，其诱导效率高，同时培养基组分简单，容易制备，且成本低。

Description

一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱 导方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法。
背景技术
中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)主要有两大类细胞，神经元和神经胶质细胞，神经胶质细胞又分为大神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞)和小神经胶质细胞。神经元和大神经胶质细胞来源于外胚层，而大约占神经胶质细胞的5-20％的小神经胶质细胞被认为来源于骨髓。人们一直以来都认为哺乳动物的CNS是属于不能再生类的组织，但是，这一神经学的经典法则正受到挑战，近年的研究已经显示神经祖细胞具有在CNS进行细胞分裂的能力。虽然这些细胞的功能和寿命还有待研究，但是已有明确的证据显示，在哺乳动物的齿状回和嗅球有成熟的神经形成。近来，随着神经细胞群的分化研究，在脊髓区也同样发现有成熟的神经形成。
中枢神经系统退行性疾病，遗传性疾病等是临床上治疗的难点。由于药物治疗仅仅是对症治疗，故神经组织移植替代治疗就成为最有发展前景的方法。神经元是神经系统的结构和功能单位。神经元有接受、整合和传递信息的功能。一般就长轴突神经元而言，树突和胞体接受从其他神经元传来的信息，并进行整合，然后通过轴突将信息传递给另一些神经元或效应器。神经干细胞(neural stemcells，NSCs)定向分化为的神经元在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。因此，寻求一种可以使NSCs定向分化为神经元的方法是国内外学者的研究热点。但是NSCs的来源和数量有限是目前存在的主要问题。
相关研究已经证实骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cell，BMSCs)是最具有多向分化潜能和高度自我复制能力的细胞。BMSCs不仅能分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和造血支持细胞，还可分化为CNS细胞，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。BMSCs是一群存在于骨髓中的非造血干细胞。自体骨髓间充质干细胞，因具有无免疫排斥反应，取材方便，对供体损伤小，易于分离培养及体外增殖能力强的特点，因此，可为中枢神经系统疾病临床治疗提供丰富的细胞资源。
目前诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化的方法，诱导出的神经元比例少，大部分分化成胶质细胞。因此，急需提供一种能够提高骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基及培养方法。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法，可显著提高骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导率。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，包括以下组分：人参皂苷Rg11-8mg/L、三七多糖0.3-0.8mg/L、维生素C 5-12mg/L、EGF2-10μg/L、葡萄籽提取物2-5mg/L，神经元培养上清液补足。
进一步地，一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，包括以下组分：人参皂苷Rg16mg/L、三七多糖0.5mg/L、维生素C 7mg/L、EGF 8μg/L、葡萄籽提取物4mg/L，神经元培养上清液补足。
进一步地，三七多糖通过以下方法制备得到：取提取过三七总皂苷的废渣，加废渣3-5倍重量的水，煮40-60min，过滤，得第一滤液和第一沉淀，向第一沉淀中加2-4倍重量的水，煮30-50min，过滤，得第二滤液和第二沉淀，然后再向第二次沉淀中加入2-3倍水，煮20-30min，过滤，得第三次滤液和第三次沉淀，合并三次滤液，旋转浓缩总滤液至原体积的1/4-1/5，加入无水乙醇，边加边搅拌，放置，然后抽滤得沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，最后烘干，得三七多糖。
进一步地，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32-35％的水和0.03-0.08％的酵母，室温下密封发酵10-12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60-62℃，萃取压力为3.8-4.0MPa，萃取时间为1-1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/3-1/4，所得浓缩液以0.6-0.8V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
进一步地，神经元培养上清液通过以下方法制备得到：神经元细胞在神经元培养基中培养3-5h，换液，继续培养3-5天，得神经元培养上清液。
进一步地，神经元培养基为含有1-2％B27、0.5-1％青霉素、0.5-1％链霉素、0.2-0.4mM GLUTAMAX的神经元基础培养基。
进一步地，神经元细胞的接种密度为3-8×105个/mL，培养条件为37℃，5％CO2。
一种骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，将骨髓间充质干细胞与上述诱导培养基混合，培养。
进一步地，培养条件为37℃，5％CO2，培养时间为5-8天。
进一步地，骨髓间充质干细胞的接种密度为2-8×104个/mL。
本发明提供的促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法，具有以下有益效果：
本发明通过特定的组分组成诱导培养基，用该诱导培养基诱导培养骨髓间充质干细胞向神经元分化，其诱导效率高，同时培养基组分简单，容易制备，且成本低。
具体实施方式
实施例1
一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，包括以下组分：人参皂苷Rg11mg/L、三七多糖0.3mg/L、维生素C 5mg/L、EGF 2μg/L、葡萄籽提取物2mg/L，神经元培养上清液补足。
其中，三七多糖通过以下方法制备得到：取提取过三七总皂苷的废渣，加废渣5倍重量的水，煮60min，过滤，得第一滤液和第一沉淀，向第一沉淀中加4倍重量的水，煮50min，过滤，得第二滤液和第二沉淀，然后再向第二次沉淀中加入3倍水，煮30min，过滤，得第三次滤液和第三次沉淀，合并三次滤液，旋转浓缩总滤液至原体积的1/5，加入无水乙醇，边加边搅拌，放置，然后抽滤得沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，最后烘干，得三七多糖。
葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8MPa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
神经元培养上清液通过以下方法制备得到：神经元细胞在神经元培养基中培养5h，换液，继续培养4天，得神经元培养上清液；神经元培养基为含有2％B27、0.5％青霉素、0.5％链霉素、0.3mM GLUTAMAX的神经元基础培养基；神经元细胞的接种密度为5×105个/mL，培养条件为37℃，5％CO2。
一种骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞与上述诱导培养基混合，培养；培养条件为37℃，5％CO2，培养时间为5天；间充骨髓质干细胞的接种密度为5×104个/mL。
实施例2
一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，包括以下组分：人参皂苷Rg18mg/L、三七多糖0.8mg/L、维生素C 12mg/L、EGF 10μg/L、葡萄籽提取物5mg/L，神经元培养上清液补足。
其中，三七多糖通过以下方法制备得到：取提取过三七总皂苷的废渣，加废渣5倍重量的水，煮60min，过滤，得第一滤液和第一沉淀，向第一沉淀中加4倍重量的水，煮50min，过滤，得第二滤液和第二沉淀，然后再向第二次沉淀中加入3倍水，煮30min，过滤，得第三次滤液和第三次沉淀，合并三次滤液，旋转浓缩总滤液至原体积的1/5，加入无水乙醇，边加边搅拌，放置，然后抽滤得沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，最后烘干，得三七多糖。
葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8MPa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
神经元培养上清液通过以下方法制备得到：神经元细胞在神经元培养基中培养5h，换液，继续培养4天，得神经元培养上清液；神经元培养基为含有2％B27、0.5％青霉素、0.5％链霉素、0.3mM GLUTAMAX的神经元基础培养基；神经元细胞的接种密度为5×105个/mL，培养条件为37℃，5％CO2。
一种骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞与上述诱导培养基混合，培养；培养条件为37℃，5％CO2，培养时间为5天；间充骨髓质干细胞的接种密度为5×104个/mL。
实施例3
一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，包括以下组分：人参皂苷Rg13mg/L、三七多糖0.4mg/L、维生素C 7mg/L、EGF 4μg/L、葡萄籽提取物3mg/L，神经元培养上清液补足。
其中，三七多糖通过以下方法制备得到：取提取过三七总皂苷的废渣，加废渣5倍重量的水，煮60min，过滤，得第一滤液和第一沉淀，向第一沉淀中加4倍重量的水，煮50min，过滤，得第二滤液和第二沉淀，然后再向第二次沉淀中加入3倍水，煮30min，过滤，得第三次滤液和第三次沉淀，合并三次滤液，旋转浓缩总滤液至原体积的1/5，加入无水乙醇，边加边搅拌，放置，然后抽滤得沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，最后烘干，得三七多糖。
葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8MPa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
神经元培养上清液通过以下方法制备得到：神经元细胞在神经元培养基中培养5h，换液，继续培养4天，得神经元培养上清液；神经元培养基为含有2％B27、0.5％青霉素、0.5％链霉素、0.3mM GLUTAMAX的神经元基础培养基；神经元细胞的接种密度为5×105个/mL，培养条件为37℃，5％CO2。
一种骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞与上述诱导培养基混合，培养；培养条件为37℃，5％CO2，培养时间为6天；间充骨髓质干细胞的接种密度为5×104个/mL。
实施例4
一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，包括以下组分：人参皂苷Rg17mg/L、三七多糖0.6mg/L、维生素C 10mg/L、EGF 8μg/L、葡萄籽提取物4mg/L，神经元培养上清液补足。
其中，三七多糖通过以下方法制备得到：取提取过三七总皂苷的废渣，加废渣5倍重量的水，煮60min，过滤，得第一滤液和第一沉淀，向第一沉淀中加4倍重量的水，煮50min，过滤，得第二滤液和第二沉淀，然后再向第二次沉淀中加入3倍水，煮30min，过滤，得第三次滤液和第三次沉淀，合并三次滤液，旋转浓缩总滤液至原体积的1/5，加入无水乙醇，边加边搅拌，放置，然后抽滤得沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，最后烘干，得三七多糖。
葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8MPa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
神经元培养上清液通过以下方法制备得到：神经元细胞在神经元培养基中培养5h，换液，继续培养4天，得神经元培养上清液；神经元培养基为含有2％B27、0.5％青霉素、0.5％链霉素、0.3mM GLUTAMAX的神经元基础培养基；神经元细胞的接种密度为5×105个/mL，培养条件为37℃，5％CO2。
一种骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞与上述诱导培养基混合，培养；培养条件为37℃，5％CO2，培养时间为6天；间充骨髓质干细胞的接种密度为5×104个/mL。
实施例5
一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，包括以下组分：人参皂苷Rg16mg/L、三七多糖0.5mg/L、维生素C 7mg/L、EGF 8μg/L、葡萄籽提取物4mg/L，神经元培养上清液补足。
其中，三七多糖通过以下方法制备得到：取提取过三七总皂苷的废渣，加废渣5倍重量的水，煮60min，过滤，得第一滤液和第一沉淀，向第一沉淀中加4倍重量的水，煮50min，过滤，得第二滤液和第二沉淀，然后再向第二次沉淀中加入3倍水，煮30min，过滤，得第三次滤液和第三次沉淀，合并三次滤液，旋转浓缩总滤液至原体积的1/5，加入无水乙醇，边加边搅拌，放置，然后抽滤得沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，最后烘干，得三七多糖。
葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8MPa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
神经元培养上清液通过以下方法制备得到：神经元细胞在神经元培养基中培养5h，换液，继续培养4天，得神经元培养上清液；神经元培养基为含有2％B27、0.5％青霉素、0.5％链霉素、0.3mM GLUTAMAX的神经元基础培养基；神经元细胞的接种密度为5×105个/mL，培养条件为37℃，5％CO2。
一种骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞与上述诱导培养基混合，培养；培养条件为37℃，5％CO2，培养时间为5天；间充骨髓质干细胞的接种密度为5×104个/mL。
对比例1
对比例1与实施例5不同之处在于，培养基中不含三七多糖，其余成分及诱导方法与实施例5相同。
对比例2
对比例2与实施例5不同之处在于，培养基中不含葡萄籽提取物，其余成分及诱导方法与实施例5相同。
对比例3
对比例3与实施例5不同之处在于，培养基中不含三七多糖和葡萄籽提取物，其余成分及诱导方法与实施例5相同。
实施例1-5及对比例1-3均是骨髓间充质干细胞的第三代对数期生长过程中的细胞，置于诱导培养基中诱导培养。
将实施例1-5和对比例1-3培养5天后的细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗3遍，加4％多聚甲醛固定30min，加PBS冲洗3次，每次5min，用2％Tritox-100室温破膜，PBS洗涤3次，每次5min，5％的山羊血清室温封闭30min，PBS洗涤3次，每次5min，一抗Map-2(1：100)，40℃孵育过夜，二抗DyLight 488AffiniPure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(1：100)室温避光孵育1h，PBS冲洗2遍，封片，荧光倒置显微镜下观察，鉴定骨髓间充质干细胞分化成神经元的量，结果见下表：
骨髓间充质干细胞接种量(个) 神经元细胞数量(个)
实施例1 5×104 2.5×104
实施例2 5×104 2.8×104
实施例3 5×104 3.0×104
实施例4 5×104 2.6×104
实施例5 5×104 3.5×104
对比例1 5×104 1.0×104
对比例2 5×104 0.9×104
对比例3 5×104 0.75×104
由上表可知，采用本发明诱导培养基诱导，可显著提高骨髓间充质干细胞分化成神经元的诱导率，尤其是实施例5，效果最佳。

Claims (10)

1.一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，其特征在于，包括以下组分：人参皂苷Rg1 1-8mg/L、三七多糖0.3-0.8mg/L、维生素C 5-12mg/L、EGF 2-10μg/L、葡萄籽提取物2-5mg/L，神经元培养上清液补足。
2.根据权利要求1所述的促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，其特征在于，包括以下组分：人参皂苷Rg1 6mg/L、三七多糖0.5mg/L、维生素C 7mg/L、EGF 8μg/L、葡萄籽提取物4mg/L，神经元培养上清液补足。
3.根据权利要求1或2所述的促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，其特征在于，三七多糖通过以下方法制备得到：取提取过三七总皂苷的废渣，加废渣3-5倍重量的水，煮40-60min，过滤，得第一滤液和第一沉淀，向第一沉淀中加2-4倍重量的水，煮30-50min，过滤，得第二滤液和第二沉淀，然后再向第二次沉淀中加入2-3倍水，煮20-30min，过滤，得第三次滤液和第三次沉淀，合并三次滤液，旋转浓缩总滤液至原体积的1/4-1/5，加入无水乙醇，边加边搅拌，放置，然后抽滤得沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，最后烘干，得三七多糖。
4.根据权利要求1或2所述的促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，其特征在于，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32-35％的水和0.03-0.08％的酵母，室温下密封发酵10-12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60-62℃，萃取压力为3.8-4.0MPa，萃取时间为1-1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/3-1/4，所得浓缩液以0.6-0.8V/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
5.根据权利要求1或2所述的促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，其特征在于，神经元培养上清液通过以下方法制备得到：神经元细胞在神经元培养基中培养3-5h，换液，继续培养3-5天，得神经元培养上清液。
6.根据权利要求5所述的促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，其特征在于，神经元培养基为含有1-2％B27、0.5-1％青霉素、0.5-1％链霉素、0.2-0.4mMGLUTAMAX的神经元基础培养基。
7.根据权利要求5所述的促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，其特征在于，神经元细胞的接种密度为3-8×105个/mL，培养条件为37℃，5％CO2。
8.一种骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，其特征在于，将骨髓间充质干细胞与上述诱导培养基混合，培养。
9.根据权利要求8所述的骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，其特征在于，培养条件为37℃，5％CO2，培养时间为5-8天。
10.根据权利要求8所述的骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，其特征在于，骨髓间充质干细胞的接种密度为2-8×104个/mL。
CN201711115769.8A 2017-11-13 2017-11-13 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法 Pending CN107653227A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711115769.8A CN107653227A (zh) 2017-11-13 2017-11-13 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711115769.8A CN107653227A (zh) 2017-11-13 2017-11-13 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107653227A true CN107653227A (zh) 2018-02-02

Family

ID=61121414

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711115769.8A Pending CN107653227A (zh) 2017-11-13 2017-11-13 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107653227A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108060131A (zh) * 2018-02-12 2018-05-22 暨赛再生医学科技有限公司 一种诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化的方法
CN112094812A (zh) * 2020-09-25 2020-12-18 郑州佐爵生物科技有限公司 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法
CN114191413A (zh) * 2021-12-14 2022-03-18 浙江大学 金属-有机配体框架zif-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101172140A (zh) * 2007-09-11 2008-05-07 珍奥集团股份有限公司 促进造血干细胞增殖与血红蛋白合成的营养组合物
CN102994446A (zh) * 2012-12-04 2013-03-27 罗国安 诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导剂及培养基
CN105130941A (zh) * 2015-08-31 2015-12-09 桂林茗兴生物科技有限公司 一种葡萄籽提取物的制备方法
CN107254443A (zh) * 2017-07-28 2017-10-17 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法
CN107286265A (zh) * 2017-06-16 2017-10-24 云南多糖生物科技有限公司 一种中性三七多糖的提取纯化方法及促进细胞增殖药理活性研究与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101172140A (zh) * 2007-09-11 2008-05-07 珍奥集团股份有限公司 促进造血干细胞增殖与血红蛋白合成的营养组合物
CN102994446A (zh) * 2012-12-04 2013-03-27 罗国安 诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导剂及培养基
CN105130941A (zh) * 2015-08-31 2015-12-09 桂林茗兴生物科技有限公司 一种葡萄籽提取物的制备方法
CN107286265A (zh) * 2017-06-16 2017-10-24 云南多糖生物科技有限公司 一种中性三七多糖的提取纯化方法及促进细胞增殖药理活性研究与应用
CN107254443A (zh) * 2017-07-28 2017-10-17 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108060131A (zh) * 2018-02-12 2018-05-22 暨赛再生医学科技有限公司 一种诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化的方法
CN108060131B (zh) * 2018-02-12 2019-01-04 暨赛再生医学科技有限公司 一种诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化的方法
CN112094812A (zh) * 2020-09-25 2020-12-18 郑州佐爵生物科技有限公司 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的方法
CN114191413A (zh) * 2021-12-14 2022-03-18 浙江大学 金属-有机配体框架zif-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的应用
CN114191413B (zh) * 2021-12-14 2022-09-06 浙江大学 金属-有机配体框架zif-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107653227A (zh) 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法
CN101702984B (zh) 一种利用真菌诱导子提高桑黄黄酮产量的桑黄菌丝体液体发酵方法
CN102443566B (zh) 一种脂肪干细胞的获取方法
CN106801032B (zh) 人羊膜上皮干细胞库的构建方法
CN105331668B (zh) 一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法
CN102618594B (zh) 一种提高灵芝菌丝体中总黄酮产量的方法
CN107653225A (zh) 一种用于扩增人间充质干细胞的培养基及其扩增方法
CN104450611A (zh) 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法
CN102796673A (zh) 一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法
CN113564212B (zh) 一种利用微生物发酵法提取杜仲叶多糖的方法
CN102875359B (zh) 一种利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的方法及其装置和其耦合发酵技术的应用
CN111471727A (zh) 一种利用微生物发酵法提取白术多糖的方法
CN113480587A (zh) 一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法
CN106086147A (zh) 利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法
CN114369564B (zh) 一种枳雀来源外泌体的制备方法和应用
CN111334440A (zh) 米根霉ch5及其在提取紫芝多糖中的应用
CN103553755B (zh) 一种冬虫夏草菌粉、其生产方法及专用培养基
CN104388497B (zh) 利用红松头霉菌生产红景天苷和酪醇的方法
CN104278070B (zh) 一种提高桑黄液体发酵产物中麦角甾醇含量的方法
CN108251357A (zh) 一种诱导骨骼肌干细胞向软骨细胞分化的细胞培养液和分化方法
CN105018422A (zh) 一种人脐带间充质干细胞规模化制备的方法
CN111996223A (zh) 利用双向发酵技术获取灵芝板蓝根生物多糖的方法
CN102805171B (zh) 一种茶叶综合利用的工艺
CN106591142B (zh) 一种炭角目菌植物内生菌及应用
CN108117558A (zh) 从发酵茶中拆分泰德诺a和泰德诺b的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180202

RJ01 Rejection of invention patent application after publication