CN114191413A - 金属-有机配体框架zif-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的应用 - Google Patents

金属-有机配体框架zif-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金属‑有机配体框架ZIF‑67修饰的中空二氧化钒核‑膜复合结构药物载体的应用。本发明的复合结构药物载体兼具可同时携带不同药物，携带药物含量高，程序性调控抑制干细胞衰老并促进干细胞的增殖，诱导干细胞神经分化，神经兴奋的功能。与单一纳米VO2相比，具有更优秀的载药量，更低的细胞毒性，有效提升干细胞的治疗作用，可以在原位组织再生中得到应用。该载体使人参皂苷Rg1包被在药物载体中空的核内，女贞苷吸附在药物载体的外层膜上，达到程序性释放，诱导干细胞向神经分化，并使干细胞有神经兴奋功能效果更加显著。

Description

金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结 构药物载体的应用
技术领域
本发明属于生物材料和再生医学领域，具体涉及一种金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的应用。
背景技术
干细胞具有自我更新和分化能力，可以分化为其他细胞、组织以及器官。鉴于干细胞独特的再生能力，干细胞治疗在多种疾病治疗中都具有很大的潜力。机体可通过自体干细胞的增殖和分化实现细胞更新；但各个组织器官的干细胞数量会随着年龄的增长而逐渐减少，增殖分化能力也会下降，故而受损的组织器官无法得到及时修复。原位组织工程技术又称为原位诱导再生技术，是指通过性能良好的支架材料与体位微环境的相互作用，促进诱导干细胞延缓衰老、增殖、迁移粘附在支架材料上，实现受伤组织的原位再生。
当前世界每年因为车祸、锐器、枪弹等外伤造成神经损伤的病例很多。因此，将干细胞定向分化为神经干细胞，不仅为研究原位组织再生奠定基础，也可为人类治疗神经损伤病例提供新思路。骨髓间充质干细胞是来源于骨髓基质中的一类成体干细胞，其取材方便，易于培养和扩增，能在体内分化成熟，与支架材料有良好的相容性，可作为理想的种子细胞实现受伤组织的原位组织再生。
因此，原位组织再生中需要提供促进干细胞增殖，延缓衰老的信号，使干细胞在再生过程中保持良好的分化能力，实现细胞更新，同时提供促进干细胞定向分化的能力，使干细胞定向分化为特定细胞协助愈合受伤组织，以实现原位再生。
女贞子成分包括三萜酸类、裂环环烯醚萜类、脂肪酸类、氨基酸类、挥发油类等成分。女贞苷和特女贞苷是女贞子指标性的活性成分，为女贞子裂环环烯醚萜苷类中含量较高的成分之一。女贞苷目前被证明具有调节免疫、降血糖和抗病毒作用。但截至目前，女贞苷具有促进干细胞增殖，抑制衰老的作用还未见报道。
人参成分主要包括各种各样的人参皂苷，例如Rh2，Rg5，Rc等，目前已经成功分离出来的稀有人参皂苷有60多种。其中人参皂苷Rg1是人参中含量较高的甾体皂苷，具有神经保护作用。有研究发现，人参皂苷Rg1可增强GR信号传导显著增加小鼠胚胎干细胞分化产生的神经元细胞数量。
核-膜结构复合纳米颗粒是当前很有前途的纳米载体系统，其高表面积、易于修饰和功能化的特点，有助于实现多种功能，用于控制和靶向药物递送应用。单纳米颗粒一般具有毒性，对细胞具有伤害。相较而言，核-膜结构纳米颗粒显示出更好的性能，如携载不同的药物，细胞毒性小，分散性高，生物相容性好，孔隙孔径小，与生物分子和药物的结合更强，载药量高，增强或改变核材料的性能，具有更强的热稳定性和化学稳定性。除了携带药物之外，核-膜结构复合纳米颗粒还可携带探针、siRNA、多功能分子等。其独特的优势特点，核-膜结构复合纳米颗粒在未来治疗学中具有很大的潜力。
中空金属氧化物纳米粒，利用其中空结构作为药物载体，目前在国内外均较少报道。在中空金属氧化物表面复合MOF形成核膜结构复合纳米颗粒作为药物载体，目前几乎没有报道。干细胞在细胞治疗领域上有很大的前景，但其在应用过程中存在数量少，易衰老失去干性，缺乏特定信号定向分化的缺点。因此，针对以上干细胞的缺点，药物需要具有促增殖、抗衰老、诱导干细胞定向分化的特点。本专利提供的核膜复合结构可以释放不同药物，并可以程序性释放药物。ZIF膜的多孔结构表层可以吸附大量药物，同时阻碍其内层药物的释放，以使表层药物先释放，内层药物后释放，以达到程序性释放功能。女贞苷吸附在外层ZIF膜孔隙上，先释放出促进干细胞的增殖与抗衰老，进而释放包被在中空核上的人参皂苷，在干细胞不断增殖与衰老过程中，诱导干细胞的神经分化，程序性发挥以上调控作用，从而有效提升干细胞的治疗作用。
发明内容
针对以上内容，本发明提供一种金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的应用。本发明的复合结构药物载体兼具可同时携带不同药物，携带药物含量高，程序性调控抑制干细胞衰老并促进干细胞的增殖，诱导干细胞神经分化，神经兴奋的功能。
本发明提供了一种金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体在制备抗衰老药物或制剂中的应用，其特征在于所述的抗衰老药物或制剂由所述的药物载体搭载人参皂苷Rg1和女贞苷得到，其中人参皂苷Rg1包被在药物载体中空的核内，女贞苷吸附在药物载体的外层膜上。
作为本发明的可选方案，所述的抗衰老药物或制剂为抑制干细胞衰老药物或制剂。
作为本发明的可选方案，所述的抗衰老药物或制剂为促进干细胞增殖的药物或制剂。
作为本发明的可选方案，所述的抗衰老药物或制剂为诱导干细胞向神经干细胞诱导分化药物或制剂。
作为本发明的优选方案，所述的药物载体为金属-有机配体框架ZIF-67包覆在二氧化钒表面的核-膜双层结构，所述二氧化钒为中空结构。
作为本发明的优选方案，所述的抗衰老药物或制剂的制备方法为：取10～500mg金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体分散在1～30mL去离子水中，搅拌超声10～60分钟，得混悬液A；取10～300mg女贞苷Lig和10～300mg人参皂苷Rg1分别分散于5～20mL水中，得溶液B与C；将溶液C缓慢滴加至混悬液A中，之后持续超声10～40分钟，得反应液D，再将溶液B缓慢滴加至反应液D中，之后持续超声10～40分钟，再室温搅拌反应4～48h，得到反应液E；将反应液E，以转速3000～8000转/分钟，时间5～10分钟超滤，超滤2～5次，得到混悬液F；将混悬液F冷冻干燥，得到抗衰老药物或制剂。
作为本发明的优选方案，所述金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将V2O5加入草酸溶液中，搅拌形成悬浊液，置于水热反应釜中，通过水热反应，制备得到VO2；
(2)将制得的VO2均匀分散在甲醇溶液中，加入六水合硝酸钴和2-甲基咪唑的甲醇溶液，室温搅拌至充分反应，真空干燥后得到ZIF-67包覆的中空二氧化钒壳核结构微纳米复合材料。
作为本发明的优选方案，步骤(1)中所述的V2O5与草酸摩尔比为1：(1～150)，草酸溶液浓度为0.6～5mol/L。所述水热反应温度为120～300℃，反应时间为6～48h。
作为本发明的优选方案，步骤(2)中，VO2、六水合硝酸钴和2-甲基咪唑投料质量比为1：(2～60)：(4～90)，真空干燥温度为40～80℃。
本发明还提供了一种ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体，其特征在于所述的载体为ZIF-67包覆在二氧化钒表面的核-膜双层结构，所述二氧化钒为中空结构。
本发明进一步提供了所述的ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的递药应用，例如递送中药单体女贞苷促进干细胞增殖和抑制干细胞衰老以及人参皂苷Rg1诱导干细胞神经分化的应用。
本发明的有益之处在于：本发明的ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体相较单一二氧化钒，孔隙孔径更小，可以为药物携载提供更多的空间。且VO2@ZIF-67载体其内核与外壳分别由二氧化钒与ZIF-67构成，可携载不同的药物在中空的核内与外面的膜上，增加载药的效率，人参皂苷Rg1包被在中空的核，女贞苷吸附在外层膜上。载药女贞苷与人参皂苷Rg1的VO2@ZIF-67可以先释放女贞苷抑制干细胞衰老，促进干细胞的增殖，进而再释放人参皂苷Rg1诱导干细胞向神经分化，并使干细胞有神经兴奋功能，有效提升干细胞的治疗作用。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步地说明；
图1为实施例1合成得到的金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体显微镜观察图；其中a和b为复合物扫描电镜图，c为复合物在元素扫描电镜下的扫描图，d为钴元素扫描图，e为氧元素扫描图，f为碳元素扫描图，g为钒元素扫描图，h图说明ZIF-67完全包覆在二氧化钒核表面。
图2为实施例3 VO2与VO2@ZIF-67的等温吸附曲线图；
图3为实施例3 VO2与VO2@ZIF-67的孔隙孔径曲线图；
图4为实施例5载药VO2@ZIF-67的女贞苷体外释放曲线图；
图5为实施例5载药VO2@ZIF-67的人参皂苷Rg1体外释放曲线图；
图6为实施例5载药GelMA水凝胶的女贞苷体外释放曲线图；
图7为实施例5载药GelMA水凝胶的人参皂苷苷体外释放曲线图；
图8为实施例6不同组对干细胞增殖作用的统计图；
图9为实施例7不同组对干细胞抗衰老作用β-半乳糖苷酶阳性细胞光镜观察图；
图10为实施例7不同组对干细胞抗衰老作用β-半乳糖苷酶阳性细胞率；
图11为实施例8不同组在CLSM下的神经干细胞的表面标志物Nestin的表达观察图；
图12为实施例8载药组与空白组钙影像成像图与其定量分析。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明。
实施例1金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的构建
将1.82g V2O5溶在450mL1.6mol/L草酸溶液中，混合溶液室温搅拌至溶液变成土黄色悬浊液。将得到的悬浊液置于聚四氟乙烯反应釜中进行水热反应，在180℃的环境下保温36h。反应结束后自然冷却至常温并收集蓝黑色沉淀物VO2在60℃的恒温通风干燥箱中干燥。
取出100mg制得的VO2均匀分散在200mL甲醇溶液中，加入3g六水合硝酸钴，搅拌均匀，加入300mL 0.2g/mL 2-甲基咪唑的甲醇溶液，常温下搅拌24小时以上，使其充分反应，将制得的样品以去离子水和乙醇进行离心洗涤，60℃真空干燥，得到ZIF-67包覆的VO2纳米复合材料，以下实施例称为VO2@ZIF-67。通过SEM和TEM图像观察，如图1所示。
实验结果：制得的二氧化钒为中空结构，ZIF-67包覆在二氧化钒表面，形成核-膜双层结构。
实施例2金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的构建
将1.82g V2O5溶在500mL1.2mol/L草酸溶液中，混合溶液室温搅拌至溶液变成土黄色悬浊液。将得到的悬浊液置于聚四氟乙烯反应釜中进行水热反应，在300℃的环境下保温28h。反应结束后自然冷却至常温并收集蓝黑色沉淀物VO2在60℃的恒温通风干燥箱中干燥。
取出100mg制得的VO2均匀分散在300mL甲醇溶液中，加入5g六水合硝酸钴，搅拌均匀，加入500mL 0.15g/mL 2-甲基咪唑的甲醇溶液，常温下搅拌24小时以上，使其充分反应，将制得的样品以去离子水和乙醇进行离心洗涤，80℃真空干燥，得到ZIF-67包覆的VO2纳米复合材料，以下实施例称为VO2@ZIF-67。经检测其也具有ZIF-67包覆中空二氧化钒的核-膜双层结构。
实施例3 VO2@ZIF-67核-膜复合结构的药物载体的比表面积与孔隙孔径测定
取出实施例1、2制得的VO2，放入60℃烘箱中烘1～2h后冷却至室温，清洗空样品管并烘干，在120℃下对空样品管脱气1h。在空样品管中加入已烘干的式样，然后将样品在150℃下真空脱气2小时后，冷却至室温。将脱气后的样品转入分析站进行低温氮气吸附，用注满液氮的杜瓦瓶试样品处于恒温状态，然后以样品为吸附剂、高纯氮气为吸附质和高纯氦气为载体，在77.3K液氮温度和0.048～0.996范围内的氮气相对压力点处进行等温吸附和脱附，由分析软件测定样品的氮气吸附-脱附等温曲线，最后运用BET理论、t图法和BJH法分析计算样品的比表面积、孔隙孔径等。同样取出实施例1、2制得的VO2@ZIF-67，同样的方法测得其比表面积、孔隙孔径。
实验结果如图2、3所示：“核”结构中空氧化钒(VO2)的BET比表面积为14.59m2/g，VO2@ZIF-67核-膜复合结构的BET比表面积为861.137m2/g。VO2的孔隙孔径分布在3nm左右,而VO2@ZIF-67有更多的孔隙，其孔隙孔径平均分布在6-10nm之间。说明药物载体VO2@ZIF-67可以为携载药物提供更多的空间。
实施例4载药VO2@ZIF-67的构建
取100mg VO2@ZIF-67分散在10mL去离子水中，搅拌超声30分钟，得混悬液A；取200mg女贞苷Lig和200mg人参皂苷Rg1分别分散于10mL水中，得溶液B与C。将溶液C缓慢滴加至混悬液A中，之后持续超声30分钟，得反应液D，再将溶液B缓慢滴加至反应液D中，之后持续超声30分钟，再室温搅拌反应24h，得到反应液E。将反应液E，以转速3000～8000转/分钟，时间5～10分钟超滤，超滤2～5次，得到混悬液F。将混悬液F冷冻干燥，得到载药VO2@ZIF-67。
取1g甲基丙烯酸化的明胶(GelMA)溶解于10mL三氟乙醇中,得到澄清透明的溶液,再加入200mg女贞苷Lig和200mg人参皂苷Rg1,混合均匀，持续超声30分钟，再室温搅拌反应24h，制成预交联溶液。将预交联溶液分别倒入模具中，使用波长360-480nm的紫外光照射将预交联溶液交联，光照过程持续2min，得到载药GelMA悬液，冻干即得载药GelMA。
实施例5载药VO2@ZIF-67的体外释放研究
分别取实施例4中1mL混悬液F和1mL载药GelMA悬液于透析袋中，以15mLpH7.4的PBS为释放介质，置于释放管中，在37℃的恒温培养震荡箱内恒温振荡，分别于0、1、4、6、10、12、24、36、48h取透析液1mL，同时补充相同体积的释放介质，透析液用PBS稀释，过滤，以释放介质为空白对照，用HPLC法测定滤液中的药物含量，根据公式(1)计算累计释放量。
累计释放量＝Wt/We*100％(1)
其中Wt表示一定时间内释放出的药物总量；We表示包封于核膜结构复合材料中的药量。
实验结果如图4、5、6、7所示：混悬液F组，即载药VO2@ZIF-67组，在8小时处，女贞苷释放度即达到70％左右，后续释放度一直保持，说明在该核膜结构中，女贞苷释放较快，以此起到促进干细胞增殖与抗衰老的作用。在最初12小时，人参皂苷Rg1释放较慢，几乎没有释放，但在12小时后，人参皂苷Rg1释放出现突跃现象，说明人参皂苷Rg1包被在中空核内，后于吸附在表面ZIF膜的女贞苷释放。而载药GelMA组，实验结果显示，女贞苷与人参皂苷几乎同时开始释放，无法控制其程序性释放。因此，载药VO2@ZIF-67成功达到程序性释放药物发挥不同的调控干细胞作用，增强干细胞治疗作用的目的。
实施例6载药VO2@ZIF-67对干细胞的增殖作用
取第3代的HMSCs，以5×103/孔的密度种在48孔板上。培养24小时，待细胞贴壁后，分为5个组合，分别为(a)空白组；(b)10μmol/L人参皂苷Rg1；(c)10μmol/L女贞苷Lig；(d)10μmol/L人参皂苷Rg1+10μmol/L女贞苷Lig；(e)10μmol/L载药VO2@ZIF-67，即VZ/RL组，每个组合5个孔。加药24h后，按照CCK8试剂盒操作，于450nm波长酶标仪检测结果。
增殖率＝OD给药组-OD空白组/OD对照组-OD空白组。
实验结果如图8所示：Rg1组未明显增强干细胞增殖效果，Lig组显著增强干细胞增殖效果，Rg1+Lig组相较Lig组增强干细胞增殖效果更强，载药VO2@ZIF-67组相较Rg1+Lig组干细胞增殖没有明显差异，说明Lig能够增强干细胞增殖效果，Rig+Lig能发挥协同作用，增殖效果更明显，载体VO2@ZIF-67不会影响药物的增强增殖效果。
实施例7载药VO2@ZIF-67对干细胞的抗衰老作用
取第20代的HMSCs，以2×104/孔的密度种在24孔板上。培养24小时，待细胞贴壁后，分为5个组合，分别为(a)空白组；(b)10μmol/L人参皂苷Rg1；(c)10μmol/L女贞苷Lig；(d)10μmol/L人参皂苷Rg1+10μmol/L女贞苷Lig；(e)10μmol/L载药VO2@ZIF-67，即VZ/RL组，每个组合3个孔。加药24h后，吸除细胞培养液，用PBS或HBSS洗涤1次，加入250μLβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。吸除细胞固定液，用PBS或HBSS洗涤细胞3次，每次3分钟。吸除PBS或HBSS，每孔加入1毫升染色工作液。染色工作液的配制方法参考细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书。37℃孵育过夜，用parafilm或保鲜膜封住24孔板防止蒸发。普通光学显微镜下观察拍照，阳性细胞呈蓝绿色。随机选取不同的视野，每孔计300个细胞，计算衰老细胞的比例。
实验结果如图9、10所示：在光镜下观察，(b)(c)(d)(e)组培养的HMSCs的β-半乳糖苷酶阳性细胞率相较(a)组空白组降低显著，阳性细胞数目减少，具有显著的抗衰老作用。Rg1+Lig组相较单个给药组，抗衰老作用更显著，载药VO2@ZIF-67组相较Rg1+Lig组抗衰老作用未发生明显变化，说明Rg1+Lig具有抗衰老作用，载体VO2@ZIF-67不会影响药物的抗衰老作用。
实施例8载药VO2@ZIF-67诱导干细胞神经分化的作用
取第3代的HMSCs，以5×103/孔的密度种在24孔板上。培养24小时，待细胞贴壁后，分为5个组合，分别为(a)空白组；(b)10μmol/L人参皂苷Rg1；(c)10μmol/L女贞苷Lig；(d)10μmol/L人参皂苷Rg1+10μmol/L女贞苷Lig；(e)10μmol/L载药VO2@ZIF-67，即VZ/RL组，每个组合3个孔。加药24h后，采用免疫荧光法，在共聚焦显微镜下观察神经干细胞的表面标志物Nestin的表达；通过钙影像检测(a)(e)组胞内钙离子浓度的高低。
实验结果如图11、12所示：蓝色荧光是DAPI染的细胞核，绿色荧光是标记的Nestin蛋白。(a)(b)(c)组蓝色荧光，即细胞核附近，绿色荧光较少，几乎都为蓝色荧光，说明神经干细胞的表面标志物Nestin无明显表达；(d)组实验结果显示，绿色荧光增多，说明Rg1+Lig联合使用可以诱导干细胞向神经分化；但(e)组，即VZ/RL组，实验结果显示蓝色荧光细胞核几乎完全被绿色荧光包被，说明表达了较多神经干细胞的表面标志物Nestin，即载药VO2@ZIF-67可以更显著地诱导干细胞向神经分化，并使干细胞有神经兴奋功能。结合实施例6和7，Rg1+Lig组与VZ/RL组的比较，说明本发明载体携带Rg1+Lig，与Rg1+Lig组，对干细胞增殖与衰老的效果相近，但该载体使人参皂苷Rg1包被在药物载体中空的核内，女贞苷吸附在药物载体的外层膜上，达到程序性释放，诱导干细胞向神经分化，并使干细胞有神经兴奋功能效果更加显著。

Claims (9)

1.金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体在制备抗衰老药物或制剂中的应用，其特征在于所述的抗衰老药物或制剂由所述的药物载体搭载人参皂苷Rg1和女贞苷得到，其中人参皂苷Rg1包被在药物载体中空的核内，女贞苷吸附在药物载体的外层膜上。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于所述的抗衰老药物或制剂为抑制干细胞衰老药物或制剂。
3.权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的抗衰老药物或制剂为促进干细胞增殖的药物或制剂。
4.权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的抗衰老药物或制剂为诱导干细胞向神经干细胞诱导分化药物或制剂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述的药物载体为金属-有机配体框架ZIF-67包覆在二氧化钒表面的核-膜双层结构，所述二氧化钒为中空结构。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的抗衰老药物或制剂的制备方法为：取10～500mg金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体分散在1～30mL去离子水中，搅拌超声10～60分钟，得混悬液A；取10～300mg女贞苷Lig和10～300mg人参皂苷Rg1分别分散于5～20mL水中，得溶液B与C；将溶液C缓慢滴加至混悬液A中，之后持续超声10～40分钟，得反应液D，再将溶液B缓慢滴加至反应液D中，之后持续超声10～40分钟，再室温搅拌反应4～48h，得到反应液E；将反应液E，以转速3000～8000转/分钟，时间5～10分钟超滤，超滤2～5次，得到混悬液F；将混悬液F冷冻干燥，得到抗衰老药物或制剂。
7.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述金属-有机配体框架ZIF-67修饰的中空二氧化钒核-膜复合结构药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将V2O5加入草酸溶液中，搅拌形成悬浊液，置于水热反应釜中，通过水热反应，制备得到VO2；
(2)将制得的VO2均匀分散在甲醇溶液中，加入六水合硝酸钴和2-甲基咪唑的甲醇溶液，室温搅拌至充分反应，真空干燥后得到ZIF-67包覆的中空二氧化钒壳核结构微纳米复合材料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述的V2O5与草酸摩尔比为1：(1～150)，草酸溶液浓度为0.6～5mol/L；所述水热反应温度为120～300℃，反应时间为6～48h。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，VO2、六水合硝酸钴和2-甲基咪唑投料质量比为1：(2～60)：(4～90)，真空干燥温度为40～80℃。
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