CN108823158A - 女贞苷和特女贞苷在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制复制性衰老中的应用 - Google Patents

女贞苷和特女贞苷在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制复制性衰老中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了女贞苷和特女贞苷在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制复制性衰老中的应用，所述女贞苷和特女贞苷共存。女贞苷和特女贞苷具有促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖作用，同时还具有抑制复制性衰老的作用，为临床治疗提供足够的干细胞。其中女贞苷和特女贞苷为市售高纯度的女贞苷和特女贞苷(含量≥98％),也可按常规方法进行制备。其优点是：女贞苷和特女贞苷可促进骨髓间充质干细胞增殖且可以抑制复制性衰老，为治疗骨缺损、软骨缺损、肝脏纤维化、心肌梗死、肺纤维化和糖尿病等组织工程和干细胞治疗提供足够的细胞,同时减少机体免疫排斥反应。

Description

女贞苷和特女贞苷在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和 抑制复制性衰老中的应用
所属技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及女贞苷和特女贞苷在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制复制性衰老中的应用。
背景技术
骨髓间充质干细胞作为一种细胞型药物，在骨缺损、软骨缺损、肝脏纤维化、心肌梗死、肺纤维化和糖尿病等疾病中有着广泛的广阔的应用前景。但是，商业化的生产过程中，骨髓间充质干细胞的生产规模往往难以扩大。其中骨髓间充质干细胞增殖速度慢，在复制过程中的已衰老，干性丢失是限制其生产规模扩大，阻碍干细胞应用和转化的两大主要原因。
骨髓间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，在骨髓中含量极低，其增殖速度缓慢。在生物体内，这样一方面可以外界信号作出反应，以决定细胞的发展方向—增殖或分化；另一方面可以减少基因突变的危险，使细胞有时间发现并纠正处于增殖周期中的错误。然而，在商业化的干细胞生产过程中，这一特性，一方面限制了干细胞生产的规模，一方面也延长了干细胞生产的周期。
衰老是生命体发展过程中的正常生理现象，骨髓间充质干细胞在体外培养过程中，在有丝分裂20到40代后会发生Hayflick现象，即复制性衰老现象。该现象伴随着细胞形态由原来的成纤维样的纺锤体型发生肥大化，衰老相关的β-半乳糖苷酶活性的增强，分化能力的丢失和细胞增殖停滞。此外，复制性的压力还导致在细胞衰老过程中DNA损伤的不断积累，有研究表明由于复制叉的停止引起的复制压力可诱导端粒DNA发生损伤。在MSC体外复制过程中，端粒DNA的长度以30—120bp/PD的速度不断缩短。同时，复制性衰老还会引起MSC释放的细胞因子、生长因子以及蛋白酶发生变化，导致这些蛋白所作用的细胞和组织的微环境发生显著变化。复制性衰老已成为MSC临床应用领域最大的瓶颈之一，限制了MSC在商业化与工业化中的大规模生产。
因此，寻找和发现能够加速骨髓间充质干细胞扩增速度和程度，抑制其复制性衰老的成分是加速和扩大干细胞临床应用的关键步骤。目前国内外采用在骨髓间充质干细胞培养环境中加入生长因子等生物大分子可促进干细胞的增殖和抑制复制性衰老。但是生长因子等重组蛋白产量低，成本极高，且生物半衰期短，非常不稳定，难以得到广泛的应用。因此急需寻找替代性的活性成分用于加速干细胞的增殖和抗复制性衰老，解决干细胞的数量问题，从而加速其临床应用与产业化。
女贞子(Ligustri Lucidi Fructμs)，又名冬青子，为木犀科植物女贞(Ligustrumlucidum Ait.)的干燥成熟果实。始载于成书于东汉时期的《神农本草经》，书中谓其“女贞实，味苦平，主补中，安五脏，养精神，除百病”，被列为上品。明朝李时珍谓其“果实强阴健腰膝，变白发，明目”，于《本草纲目》记载女贞子气味苦、平、无毒，能补中、安五脏、养精神、除百病。及至现代，2010版《中华人民共和国药典》记载女贞子的功能与主治为“滋补肝肾，明目乌发。用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明，内热消渴，骨蒸潮热”。
女贞子成分包括萜类、黄酮类、苯乙醇糖苷类、挥发油、磷脂、多糖、脂肪酸、氨基酸等。女贞苷和特女贞苷是女贞子指标性的活性成分，为女贞子裂环环烯醚萜苷类中含量较高的成分之一。女贞苷化学名为apigenin 7-O-β-(2″,6″-di-α-rhamnopyranosyl)-glucopyranoside；特女贞苷化学名为methyl(5E,6S)-5-ethylidene-4-[2-oxo-2-[[(2R,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[2-(4-hydroxyphenyl)ethoxy]oxan-2-yl]methoxy]ethyl]-6-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxylmethyl)oxan-2-yl]oxy-4H-pyran-3-carboxylate。当前对于女贞苷和特女贞苷研究发现的药理作用较少，女贞苷被证明具有降血糖作用和抗病毒作用，特女贞苷能调节免疫。但截至目前，女贞子及其所含成分对干细胞增殖和复制性衰老的影响还未见报道。
女贞苷化学结构为：
特女贞苷化学结构为：
发明内容
针对上述不足，本发明提供女贞苷和特女贞苷在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制干细胞复制性衰老中的应用，该发明将为骨髓间充质干细胞的体外扩增、干性维持和后续应用将提供重要的保障，为临床治疗和科学研究提供足够的干细胞，具有重要的经济价值与社会意义。
本发明所采用的技术方案如下：女贞苷和特女贞苷在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制复制性衰老中的应用，所述女贞苷和特女贞苷共存。
进一步的，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比在1:10-10:1之间，应用于鼠源骨髓间充质干细胞增殖显著。
进一步的，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比优选在1:4-2:3之间。
进一步的，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比在1:10-10:1之间，应用于人源骨髓间充质干细胞增殖显著。
进一步的，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比优选在1：3-3：1之间。
进一步的，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比在1:15-15:1之间，应用于抑制人源骨髓间充质干细胞复制性衰老显著。
进一步的，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比优选在3:8-2:1之间。
进一步的，所述女贞苷为市售高纯度的女贞苷，纯度≥98％，所述特女贞苷为市售高纯度的特女贞苷，纯度≥98％。
本发明的有益效果是：女贞苷和特女贞苷促进骨髓间充质干细胞增殖，还可以抑制复制性衰老，可为治疗骨缺损、软骨缺损、肝脏纤维化、心肌梗死、肺纤维化和糖尿病等组织工程和干细胞治疗提供足够的细胞，同时降低机体免疫排斥反应。
附图说明
图1是女贞苷和特女贞苷体外培养鼠源骨髓间充质干细胞增殖CCK8实验结果；
图2是女贞苷和特女贞苷体外培养人源骨髓间充质干细胞增殖CCK8实验结果；
图3是女贞苷和特女贞苷体外培养人源骨髓间充质干细胞的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色光镜拍照结果。
图4是女贞苷和特女贞苷体外培养人源骨髓间充质干细胞的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色细胞数目统计结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
1.材料方法：
1.1试药DMEM低糖培养液(Gibco BRL，美国)；胎牛血清(FBS，Gibco BRL，美国)；0.25wt.％胰酶(含0.02wt.％EDTA，Gibco BRL，美国)；青霉素一链霉素溶液(Gibco BRL，美国)；Cell Counting Kit-8(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；
1.2仪器电子天平(AL204，Mettler Toledo，瑞士)；全自动酶标仪(ELX800，BioTekInstruments Inc.，美国)；二氧化碳细胞孵箱(HF90，Health Force，中国)；生物安全柜(Type A2，北京东联哈尔仪器制造有限公司，中国)；超纯水仪(Milli-Q，Millipore Co.，美国)；
1.3BMSCs分离培养取3周龄的雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死，并用酒精浸泡5min消毒，在超净台里用手术剪剥离后肢皮肤和肌肉，取出胫骨和股骨，小心地剪掉骨头两端，暴露骨髓腔后，用注射器吸取含有10％的胎牛血清的DMEM低糖培养液反复冲洗骨髓腔直至骨外观变白。将得到的含骨髓组织的培养液过200目细胞筛后，1200rpm离心5min，弃去上清液，加入培养液重悬置于培养皿中，并在37℃和5％CO2环境中培养，每隔一天换一次液。当细胞生长密度达到80％-90％时消化传代，第二代至第五代的BMSCs用于后续实验。
1.4HMSCs培养取P0代HMSCs，用10％的胎牛血清的DMEM低糖培养液在37℃和5％CO2环境中培养，每隔两天换一次液。当细胞生长密度达到80％-90％时消化传代，第2代至第5代的HMSCs用于增殖实验，第20代的HMSCs用于细胞衰老β-半乳糖苷酶染色实验
1.5增殖实验实验分为两组，分别为BMSCs组和HMSCs组。其中每组分为空白组、对照组与给药组。给药组中的女贞苷与特女贞苷溶解后经过滤除菌，按10种比例进行混合，分为组合1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，所选组合质量比例范围均在1:10-10:1之间。
取第三代的BMSCs与HMSCs，分别以5×103/孔的密度种在96孔板上。培养24小时，待细胞贴壁后，向96孔板中分别加入10种不同组分的女贞苷与特女贞苷混合液，每个组分5个孔。加药24h后，按照CCK8试剂盒操作，于450nm波长酶标仪检测结果。增殖率＝OD给药组-OD空白组/OD对照组-OD空白组
1.6细胞衰老β-半乳糖苷酶染色实验实验设置对照组和给药组。给药组中女贞苷与特女贞苷溶解后经过滤除菌，按6种比例进行混合，所选组合比例范围均在1:15-15:1之间，分为组合1、2、3、4、5、6。
取第20代的HMSCs，分别以2×104/孔的密度种在24孔板上。培养24小时，待细胞贴壁后，向24孔板中分别加入6种不同比例的女贞苷与特女贞苷混合液，每个组合3个孔。加药24h后，吸除细胞培养液，用PBS或HBSS洗涤1次，加入250ulβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。吸除细胞固定液，用PBS或HBSS洗涤细胞3次，每次3分钟。吸除PBS或HBSS，每孔加入1毫升染色工作液。染色工作液的配制方法参考细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书。37℃孵育过夜，用parafilm或保鲜膜封住24孔板防止蒸发。普通光学显微镜下观察拍照，阳性细胞呈蓝绿色。随机选取不同的视野，每孔计300个细胞，计算衰老细胞的比例。
1.7统计分析实验数据用‘x±Sd表示，采用Origin2017软件进行统计学处理分析，两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析，当P<0.05时认为有统计学差异。
2.结果：
2.1BMSCs细胞生长状况和CCK8结果女贞苷和特女贞苷在培养液中的比例在1:10-10:1之间，优选比例范围在组合6(1:4-2:3)之间，应用于鼠源骨髓间充质干细胞增殖显著(见图1所示)。
2.2HMSCs细胞生长状况和CCK8结果女贞苷和特女贞苷在培养液中的比例在1:10-10:1之间，优选比例范围在组合8(1：3-3：1)之间，应用于人源骨髓间充质干细胞增殖显著(见图2所示)。
2.3HMSCs细胞衰老β-半乳糖苷酶染色实验结果女贞苷和特女贞苷在培养液中的比例在1:15-15:1之间，优选比例范围在组合2(3:8-2:1)之间，在光镜下观察，培养的HMSCs的β-半乳糖苷酶阳性细胞率降低显著，阳性细胞数目减少，具有显著的抗复制性衰老作用(见图3、图4所示)。

Claims (8)

1.女贞苷和特女贞苷在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制复制性衰老中的应用，其特征在于，所述女贞苷和特女贞苷共存。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比在1:10-10:1之间，应用于鼠源骨髓间充质干细胞增殖显著。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比优选在1:4-2:3之间。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比在1:10-10:1之间，应用于人源骨髓间充质干细胞增殖显著。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比优选在1：3-3：1之间。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比在1:15-15:1之间，应用于抑制人源骨髓间充质干细胞复制性衰老显著。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述女贞苷和特女贞苷在培养液中的质量比优选在3:8-2:1之间。
8.根据权利要求1-4任一项所述应用，其特征在于，所述女贞苷为市售高纯度的女贞苷，纯度≥98％，所述特女贞苷为市售高纯度的特女贞苷，纯度≥98％。
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