CN112675210A - 一种用于降低补骨脂肝毒性的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开一种用于降低补骨脂肝毒性的方法，所述方法包括：补骨脂的预处理：补骨脂依次用乙醇水溶液浸泡、水漂洗，然后，将水漂洗后的补骨脂蒸制，干燥。通过本申请的方法制备的补骨脂可有效降低补骨脂的肝毒性且不影响补骨脂的药效。

Description

一种用于降低补骨脂肝毒性的方法

技术领域

本发明涉及中药安全性领域，具体地涉及一种用于降低补骨脂肝毒性的方法。

背景技术

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻等功效。现临床主治腰膝骨痛、骨质疏松、骨折、骨性关节炎等。近年来，随着补骨脂及其制剂的广泛使用，国内外关于补骨脂及其制剂肝损伤不良反应报道呈增高趋势，其安全性问题引起国内外广泛关注。国家食品药品监督管理总局先后通报了含补骨脂的制剂(壮骨关节丸、仙灵骨葆、骨康胶囊)导致肝损伤的风险，国际权威药物肝损伤信息网站Liver Tox也对补骨脂及其制剂进行了收录。已有临床病例显示，补骨脂单独使用也存在一定的肝毒性。(参考文献Nam SW，Baek JT，Lee DS，et al.A Case of AcuteCholestatic Hepatitis Associated with the Seeds of Psoralea corylifolia(Boh-Gol-Zhee)[J].Clin Toxicol，2005，43：589-591.)目前补骨脂的炮制方法主要为盐炙法，然而临床上也存在盐补骨脂导致肝损伤的病例，表明盐炙补骨脂仍具有一定的肝毒性(王月清，何登明.盐补骨脂致药物性肝损伤1例并文献复习[J].实用医药杂志，2018，35(08)：724-725.)；提示盐炙法主要目的是改变药性和归经以增强药效，并非减毒。此外，也有相关企业对补骨脂采用水煮去毒的前处理方法，但临床上仍出现肝损伤病例。因此，寻找有效的减毒方法，是补骨脂临床应用及其相关制剂产业化发展亟待解决的问题。

发明内容

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

本发明提出补骨脂酒浸水漂法的前处理方法，经过本申请酒浸水漂处理后的补骨脂不仅保持药效，而且降低了肝毒性。酒浸水漂法不改变中成药生产工艺，且不需要药品上市的再评价与注册，值得推广与应用。

具体地，本申请提供一种用于降低补骨脂肝毒性的方法，所述方法包括：

预处理：补骨脂以此用乙醇水溶液浸泡、水漂洗，然后，将漂洗后的补骨脂蒸制，干燥。

在本申请中，补骨脂依次用乙醇水溶液浸泡、水漂洗，然后将水漂洗后的补骨脂隔水蒸制，日光下干燥。

在本申请中，所述补骨脂来源于豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实。

在本申请中，乙醇水溶液的体积浓度为20％-90％，优选地为80％。

在本申请中，用乙醇水溶液浸泡1次-3次，优选地浸泡3次。

在本申请中，乙醇水溶液浸泡的时间为2h-72h，优选地为30h。

在本申请中，乙醇水溶液与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g，优选地为3mL∶1g。

在本申请中，用水漂洗1次-3次，优选地漂洗3次。

在本申请中，水漂洗的时间为2h-72h，优选地为12h。

在本申请中，水与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g，优选地为2mL∶1g。

在本申请中，乙醇水溶液的体积浓度为20％-90％；乙醇水溶液与补骨脂的比为2mL-12mL∶1g。

在本申请中，乙醇水溶液的体积浓度为20％-90％；乙醇水溶液与补骨脂的比为2mL-12mL∶1g；用乙醇水溶液浸泡1次-3次。

在本申请中，乙醇水溶液的体积浓度为20％-90％；乙醇水溶液与补骨脂的比为2mL-12mL∶1g；用乙醇水溶液浸泡1次-3次；乙醇水溶液浸泡的时间为2h-72h。

在本申请中，乙醇水溶液的体积浓度为80％；乙醇水溶液与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g；用乙醇水溶液浸泡3次；乙醇水溶液浸泡的时间为30h。

在本申请中，水与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g。

在本申请中，水与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g，用水漂洗1次-3次。

在本申请中，水与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g；用水漂洗1次-3次；水漂洗的时间为2h-72h。

在本申请中，水与补骨脂比例为2mL∶1g；用水漂洗3次；水漂洗的时间为12h。

在本申请中，乙醇水溶液的体积浓度为20％-90％；乙醇水溶液与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g；用乙醇水溶液浸泡1次-3次；乙醇水溶液浸泡的时间为2h-72h；水与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g；用水漂洗1次-3次；水漂洗的时间为2h-72h。

在本申请中，乙醇水溶液的体积浓度为80％；乙醇水溶液与补骨脂比例为3mL∶1g；用乙醇水溶液浸泡3次；乙醇水溶液浸泡的时间为30h；水与补骨脂比例为2mL∶1g；用水漂洗3次；水漂洗的时间为12h。

在本申请中，所述方法包括：

依次用体积浓度为20％-90％的乙醇水溶液浸泡2h-72h，浸泡1次-3次；用水漂洗2h-72h，漂洗1次-3次，

其中，乙醇水溶液与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g；水与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g。

在本申请中，所述方法包括：

依次用体积浓度为80％的乙醇水溶液浸泡30h，浸泡3次；用水漂洗12h，漂洗3次，

其中，乙醇水溶液与补骨脂比例为3mL∶1g；水与补骨脂比例为2mL∶1g。

在本申请中，蒸制的时间为1h-12h。

在本申请中，所述方法包括：

依次用体积浓度为20％-90％的乙醇水溶液浸泡2h-72h，浸泡1次-3次；用水漂洗2h-72h，漂洗1次-3次，然后，将漂洗后的补骨脂蒸制1h-12h，干燥，

其中，乙醇水溶液与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g；水与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g，优选地为3mL∶1g。

在本申请中，所述方法包括：

依次用体积浓度为80％的乙醇水溶液浸泡30h，浸泡3次；用水漂洗12h，漂洗3次，

然后，将漂洗后的补骨脂蒸制5h，干燥，

其中，乙醇水溶液与补骨脂比例为3mL∶1g；水与补骨脂比例为2mL∶1g。

在本申请中，所述方法包括：

依次用体积浓度为20％-90％的乙醇水溶液浸泡2h-72h，浸泡1次-3次，用水漂洗2h-72h，漂洗1次-3次；

然后，将水漂洗后的补骨脂蒸制1h-12h，干燥；

其中，乙醇水溶液与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g；水与补骨脂比例为2mL-12mL∶1g；

向干燥后的补骨脂添加乙醇，超声提取，过滤，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1示出补骨脂修制品X1、X2、X3对肝脏类器官细胞高内涵成像的影响，其中细胞核被Hoechst核酸染料染为蓝色，活细胞被Calcein AM染成绿色，死细胞被EthD-1染成红色。

图2示出补骨脂修制品X1、X2、X3对肝脏类器官细胞死活的影响。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

以下实施例中采用的物质，除注明的以外，其余均为市售。

ATP：是活细胞新陈代谢的指标，采用CellTiter-GloTM3D细胞活力检测试剂检测。

PBS：磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)细胞实验中能保持组织细胞需要的PH范围，其所含盐浓度与细胞内环境的相似，对组织细胞没有毒性作用。

材料

1、药品与试剂

补骨脂药材(批号：18052104，产地河南)购于北京绿野药业有限公司；牛胰岛素、氢化可的松(Sigma公司)；GlutaMAXTM、胎牛血清、William′s E培养基购于Gibco公司；Trypsin-EDTA购于Macgene公司；Hoechst 33342、Calcein AM、EthD-1购于Thermo Fisher公司；CellTiter-GloTM3D细胞活力检测试剂，购于Promega公司。维甲酸，戊巴比妥钠购于美国Sigma公司；酸性磷酸酶(ACP)，碱性磷酸酶(ALP)试剂盒购于美国Beckman Coulter公司。

2、仪器

XS205DU电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；旋转蒸发仪R205B(SENCO)(上海申生科技有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SynergyTMH1全功能酶标仪(BioTek公司)；CO₂培养箱(三洋公司)；常规倒置显微镜(上海泽权仪器设备有限公司)；TC10TM细胞自动计数器(BioRad公司)；冷冻干燥机(Christ Alpha 1-2LDplus)；DMIL HC型倒置相差显微镜(Leica德国)；高内涵筛选分析仪(Thermo公司)等。

3、实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体重180-200g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2016-0002，于中国人民解放军总医院第五医学中心实验动物中心分笼饲养，自由饮水和进食。实验动物中心室温(25±2)℃，湿度50％～70％，室内保持12h照明与黑暗交替，并定期进行消毒。

4、肝细胞：HepaRG细胞由本实验室冻存。

实施例1补骨脂不同修制品的制备

a.本申请的方法包括：

预处理：补骨脂依次用乙醇水溶液浸泡、水漂洗，然后，将漂洗后的补骨脂蒸制，干燥。

按照表1中的乙醇水溶液的浓度和用量、浸泡时间、浸泡次数和水的用量、漂洗时间、漂洗次数，以及蒸制条件处理补骨脂；蒸制后的补骨脂在日光下干燥3天。

表1：补骨脂预处理条件

b.制备补骨脂修制品

取补骨脂药材各约100g，按照a中的方法制备补骨脂X1、X2、X3修制品。

实施例2细胞实验评价补骨脂的毒性

a.制备不同修制品供试品溶液；

分别取补骨脂修制品(X1、X2、X3)各20g，精密称定，置于锥形瓶，加体积为补骨脂药材10倍量体积分数为75％的乙醇，超声(40KHz，500W)提取，共提取3次，每次1h，以八层纱布过滤，合并滤液，旋转蒸发仪上减压浓缩回收乙醇，得补骨脂修制品稠浸膏，冷冻干燥机上制备冻干粉备用。分别取取冻干粉(X1、X2、X3)用William′s E细胞培养基配制质量浓度分数分别为0.5mg(生药)·mL^-1、1mg(生药)·mL^-1、2mg(生药)·mL^-1、4mg(生药)·mL^-1的药液，以0.22μm的微孔滤膜滤过，备用。

b.类器官3D模型构建

将HepaRG细胞培养于含10％胎牛血清、100μg·mL^-1青链霉素的William′s E培养基中，放置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。将诱导的HepaRG细胞以800个/孔接种于低吸附的96孔U型底板中，静置10min后置于培养箱中培养，使细胞形成类器官3D结构。

上述诱导方法为：以氢化可的松和二甲基亚砜(DMSO)诱导HepaRG细胞，将HepaRG细胞以每平方厘米2.0×10⁴个接种于25cm²培养瓶中，用含10％胎牛血清、100μg·mL^-1青霉素、100μg·mL^-1链霉素、2mmo1·L^-1GlutaMAX、5μg·mL^-1牛胰岛素和50μmol·L^-1氢化可的松William′s E培养基中，放置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养2周后，培养基中加入2％的DMSO诱导两周。

c.不同修制品毒性检测

1.类器官高内涵成像

染料配制：取荧光染料Hoechst33342、Calcein AM、EthD-1按说明书配制待用。

染色：吸取并弃去培养板内的液体，PBS冲洗3次，每孔加入染液100μL，置于培养箱中孵育30min。取并弃去培养板孔内染液，每孔加入PBS 100μL，待测。

采用

HCS Reader高内涵细胞成像仪对类器官的细胞进行定位和定量分析：选用细胞毒性模块，10倍物镜。

设定Channel检测波长为386nm，检测细胞核，其中细胞核被Hoechst核酸染料染为蓝色。Channe2检测波长为490nm，检测活细胞，其中活细胞被Calcein AM染成绿色。Channe3检测波长为528nm，检测死细胞，其中死细胞被EthD-1染成红色。

采集荧光图像并对图像进行荧光强度的量化分析。

实验结果表明Hoechst33342标记细胞核的染色结果显示，给药24h后X1、X2、X3修制品四个浓度下细胞都出现均匀的蓝色荧光，补骨脂生品随着给药浓度的增加，细胞荧光强度呈现不同程度的减弱，提示补骨脂生品毒性强于补骨脂修制品。

Calcein AM标记活细胞的染色结果表明，给药24h后，X1、X2、X3修制品四个浓度下细胞都出现较均匀的绿色荧光，而生品随浓度的增加，细胞的绿色荧光显著降低，提示补骨脂生品毒性强于X1、X2、X3修制品。

EthD-1标记的死细胞染色结果显示，给药24h后，生品随浓度增加，细胞呈现的红色荧光逐渐增强，X1、X2、X3修制品四个浓度下呈现较均匀的红色荧光，提示补骨脂生品毒性强于X1、X2、X3修制品。实验结果如图1、图2。

2.检测类器官细胞ATP合成

取培养四天的类器官球体，将不同浓度(0.5mg(生药)·mL^-1、1mg(生药)·mL^-1、2mg(生药)·mL^-1、4mg(生药)·mL^-1)的样品依次加入培养板内，设置溶媒对照组，置于培养箱中。24h后将孔板中球体吸至384孔板中，每孔加入CellTiter-GloTM试剂25μL，震荡混匀5min，室温孵育20min，采用酶标仪读取荧光值，检测ATP合成量，用于评价补骨脂修制品毒性大小。

实验结果表明，细胞ATP释放综合评分修制品X1(96.35)、修制品X2(75.70)、修制品X3(91.56)远高于生品(8.1)，提示补骨脂酒浸水漂法处理后的修制品有较好的减毒效果。实验结果如表2。

表2补骨脂不同修制品肝毒性评价

d.修制品药效学验证

1.分组及给药

将SD大鼠48只随机分成4组(n＝12)，正常对照组、骨质疏松模型组(剂量为70mg/kg)、补骨脂生品组(剂量为0.9g生药/kg)，补骨脂X1修制品组(剂量为0.9g生药/kg)。除正常对照组外，其余各组给予维甲酸70mg/kg，连续灌胃14天进行造模。造模后，按1mL/100g灌胃给药，连续给药8周，对照组及骨质疏松模型组给予相应体积的生理盐水。

2.实验数据采集

连续给药8周后，以1％戊巴比妥钠(剂量为50mg/kg)麻醉大鼠，腹主动脉取血，并采集胫骨样品。

3.指标检测

3.1血清生化指标检测：收集大鼠离体血液，离心(3500r/min，15min)取血清，采用全自动生化分析仪检测碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)水平。

3.2胫骨骨密度检测：收集大鼠胫骨，用10％中性福尔马林固定，进行骨密度分析，主要检测指标为骨密度(of BV)、骨连接度(Conn.D)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。

4.统计学分析

采用SPSS19.0软件进行系统分析，实验数据以

表示，计量资料采用单因素方差分析(ANOVA)，显著性概率水平P＜0.05。

5.实验结果

5.1表3补骨脂给药8周各组血清中ACP和ALP含量

从表3可以看出，给药8周后，与骨质疏松模型组相比补骨脂生品组，补骨脂X2修制品组的ACP与骨质疏松模型组相比均有明显下降，有统计学意义。

5.2表4补骨脂给药8周各组大鼠胫骨CT指标

注：与骨质疏松模型组相比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

从表4可以看出，给药8周后，补骨脂生药组，补骨脂X1修制品组的骨密度要高于骨质疏松模型组，其中与骨质疏松模型组相比补骨脂最优修制品组具有显著性；给药组的骨连接度和骨小梁数均显著高于骨质疏松模型组，有统计学意义。

临床上补骨脂用于治疗骨质疏松有较好疗效，本申请以补骨脂生品作为对比，实验结果显示修制后的补骨脂和补骨脂生品一样具有治疗骨质疏松的疗效。就补骨脂生品而言具有一定的肝毒性，本申请修制后的补骨脂既能存效，又能减毒。实验结果说明补骨脂X1修制品对维甲酸诱导的骨质疏松模型大鼠有较好的治疗作用；补骨脂酒浸水漂法可以降低补骨脂的肝毒性且不影响补骨脂的药效。

虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种用于降低补骨脂肝毒性的方法，所述方法包括：

预处理：补骨脂依次用乙醇水溶液浸泡、水漂洗，然后，将水漂洗后的补骨脂蒸制，干燥。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，乙醇水溶液的体积浓度为20％-90％，优选地为80％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，用乙醇水溶液浸泡1次-3次，优选地浸泡3次。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，乙醇水溶液浸泡的时间为2h-72h，优选地为30h。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，乙醇水溶液与补骨脂比例为2mL-12mL:1g，优选地为3mL:1g。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，用水漂洗1次-3次，优选地漂洗3次。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，水漂洗的时间为2h-72h，优选为12h。

8.根据权利要求1或6所述的方法，其中，水与补骨脂比例为2mL-12mL:1g，优选地为2mL:1g。

9.根据权利要求1、2和6中任一项所述的方法，其中，补骨脂用体积浓度为80％的乙醇水溶液浸泡3次，每次30h；用水漂洗3次，每次12h，

其中，乙醇水溶液与补骨脂的比例为3mL:1g，水与补骨脂的比例为2mL:1g。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，将水漂洗后的补骨脂蒸制1h-12h，优选地为5h。

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