CN110693805A - 一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法，涉及皮肤保养品技术领域。该方法包括间充质干细胞复合因子的制备和制备含间充质干细胞因子的修复液两步，制得的修复液包括间充质干细胞复合因子、透明质酸钠、甘露醇、烟酰胺、甜菜碱、寡肽‑3、聚二甲基硅氧烷、氮酮和夏枯草提取物。通过对制备方法进行整体优化，提高了间充质干细胞因子的分泌量，加快了细胞增殖速度；制备方法更为简单，缩短了制备时间，可适用于规模化生产。另外，利用该方法生产得到的修复液具有修复痘印、晒伤、暗疮等效果，且温和不刺激，使用时无不良反应。
Description
技术领域
本发明涉及皮肤保养品技术领域，具体涉及一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法。
背景技术
皮肤具有阻挡异物和病原体侵入，防止体液流失等功能，是人体面积最大的器官之一，对人体起到重要的屏障保护作用。随着年龄的增加和生活环境的恶化，皮肤的新陈代谢下降，吸收各种有益元素功能下降，皮肤就会出现干燥、粗糙、脱皮等现象，痘印、晒伤、暗疮等疤痕难以消除。在修复疤痕类肌肤问题时，现有的一些修复皮肤的产品在使用时会存在轻微的刺痛感，对于特殊体质的人群偶尔还会出现过敏等不良反应。
目前，大量研究表明，干细胞可以分泌多种细胞因子对组织进行修复，比如：分泌神经细胞营养因子、促血管新生因子、造血支持因子、免疫调节因子、抗凋亡因子和趋化因子等。在众多干细胞中，最常用的是间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。间充质干细胞来源广泛，现已从骨髓、外周血、胚胎、脂肪、脐血、脐带等组织中分离出了间充质干细胞。其中外周血、骨髓间充质干细胞培养时间长，含量少，细胞增殖分化潜能随年龄的增长而明显下降；脐血源MSCs分离效率低，胚胎易污染且存在伦理等问题。而脐带组织因其取材方便，细胞数量多，感染风险小等优点，成为极有潜力的MSCs来源。
脐带华通胶间充质干细胞(umbilical cord wharton’s jelly-derived MSCs，UW-MSCs)是来源于脐带华通胶组织的间充质干细胞，和其他的间充质干细胞一样，脐带华通胶间充质干细胞也可以分泌多种细胞因子，比如：表皮细胞生长因子(EGF)能够快速修复受损皮肤，以及改善性的提高皮肤的修复、护理；成纤维细胞生长因子23(FGF23)能够激活成纤维细胞，加速组织修复；血管内皮生长因子(VEGF)可在体内诱导血管新生，强力修复组织；血小板衍生因子(PDGF)是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力，加快皮肤修复；角质细胞生长因子(KGF)参与皮肤、胃、肠、肾、膀胱、肺等上皮的损伤修复，具有损伤防护功能。
随着生物技术的不断发展，干细胞因子已应用到皮肤修复产品中，但大多产品的制备方法过于复杂，获得的MSCs的效率较低，且间充质干细胞分泌的细胞因子含量较少，不能满足皮肤修复产品中的大量需求，且制备过程耗时较长。目前，中国专利CN108853001A公开了一种含有干细胞提取物的皮肤修复液及其制备方法，该皮肤修复液中的干细胞提取物是利用华通氏块分离、培养得到的MSCs经过解破碎、离心后取上清得到的。虽然该方法较为简单，但实际上干细胞提取物中除了皮肤修复作用的细胞因子外，还含有其他物质。中国专利CN109136180A公开了一种人体脐带血间充质干细胞提取物及其制备方法和应用，该制备方法中所用的间充质干细胞来源于人脐带血，并在培养人脐带血间充质干细胞的培养基中增加维生素C，从而提高人体脐带血间充质干细胞的分泌型内容物的产量，加快细胞的繁殖速率。
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法，该方法制备的脐带间充质干细胞的增殖能力强，分泌的间充质干细胞因子的含量高，操作过程简单，节省了大量的时间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法。该方法能够提高间充质干细胞因子的分泌量，加快了细胞增殖速度，缩短制备时间。
本发明一方面提供了一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
A.间充质干细胞复合因子的制备：经过脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养、间充质干细胞传代培养、上清液的收集和上清液的浓缩，得到间充质干细胞复合因子；
B.制备含间充质干细胞因子的修复液：提取夏枯草，得到夏枯草提取物；按重量份计，取夏枯草提取物、透明质酸钠、甘露醇、烟酰胺和寡肽-3搅拌混匀，得到第一混合物；
取甜菜碱、聚二甲基硅氧烷和氮酮球磨均匀，得到第二混合物；
取步骤A得到的间充质干细胞复合因子与第一混合物和第二混合物混匀、静置，得到含间充质干细胞因子的修复液。
优选地，步骤A所述的间充质干细胞复合因子的制备，具体步骤如下：
(1)脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：将人脐带组织用75％乙醇浸泡，组织两端各剪去1cm，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成小段，生理盐水清洗3次，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除静脉、动脉和羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎，转移至完全培养基进行原代细胞培养，培养至80％-90％融合时进行细胞传代；
(2)间充质干细胞传代培养：吸弃步骤(1)中待传代细胞的培养液，加入生理盐水洗涤组织贴壁面，加入0.25％胰酶，37℃孵育1-3min，待细胞变圆后，加细胞传代培养基终止消化，快速震荡，吹打细胞，吸出细胞悬液，加入生理盐水洗涤，离心，收集沉淀，用PBS缓冲液重悬沉淀，接种至细胞传代培养基进行P1代培养，细胞生长至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至P6代；
(3)上清液的收集：收集P2-P6代间充质干细胞培养的营养上清液，无菌生理盐水清洗细胞，加入0.25％胰酶消化细胞，无菌生理盐水重悬并离心，调整细胞浓度，超声破碎裂解细胞，离心，收集细胞裂解上清液，将营养上清液和细胞裂解上清液以体积比2:1混匀，得到收集后的上清液；
(4)上清液的浓缩：将步骤(3)得到的收集后的上清液用截留分子量为50KD和3KD的滤膜依次过滤、浓缩，0.22μm滤膜除菌过滤，得到间充质干细胞复合因子；
进一步地，所述的完全培养基包括：达优MSCMB培养基85％-95％(v/v)、Helios血清替代物3％-8％(v/v)、谷氨酰胺1％-3％(w/v)、吡哆醇盐酸盐0.5％-3％(w/v)和乙醇胺0.5％-1％(v/v)；
进一步地，所述的细胞传代培养基包括：α-MEM培养基90％-95％(v/v)、胎牛血清3％-6％(v/v)、α-酮戊二酸0.5％-1.2％(w/v)、山梨醇0.3％-0.8％(v/v)和银耳多糖1.2％-2％(w/v)。
优选地，所述的原代细胞培养和传代培养所用的培养条件为37℃，5％CO2，湿度为95％。其中，原代细胞第一次更换新鲜培养基时间间隔7天，3天后观察细胞融合度未达到80％-90％需更换新鲜培养基，传代细胞每隔3天更换新鲜培养基。
优选地，步骤(2)中所述接种的细胞密度为1-3×104/mL，进一步优选地，接种的细胞密度为2×104/mL。
优选地，所述的完全培养基包括：达优MSCMB培养基90％-95％(v/v)、Helios血清替代物3％-5.7％(v/v)、谷氨酰胺1％-2％(w/v)、吡哆醇盐酸盐0.5％-1.5％(w/v)和乙醇胺0.5％-0.8％(v/v)。
进一步优选地，所述的完全培养基包括：达优MSCMB培养基93％(v/v)、Helios血清替代物4％(v/v)、谷氨酰胺1.6％(w/v)、吡哆醇盐酸盐0.8％(w/v)和乙醇胺0.6％(v/v)。
优选地，所述的细胞传代培养基包括：α-MEM培养基92％-95％(v/v)、胎牛血清3％-5.1％(v/v)、α-酮戊二酸0.5％-0.8％(w/v)、山梨醇0.3％-0.5％(v/v)和银耳多糖1.2％-1.6％(w/v)。
进一步优选地，所述的细胞传代培养基包括：α-MEM培养基93％(v/v)、胎牛血清4.4％(v/v)、α-酮戊二酸0.7％(w/v)、山梨醇0.4％(v/v)和银耳多糖1.5％(w/v)。
优选地，步骤(3)中所述的调整细胞浓度为1-3×104/mL；进一步优选地，调整细胞浓度为2×104/mL。
优选地，步骤B中所述的提取夏枯草的步骤包括：将夏枯草磨成粉，超声破碎20-30分钟，离心，收集上清，加入其重量4-6倍的质量分数为80％的乙醇溶液，提取三次，过滤、离心并且减压回收乙醇，得到夏枯草提取液。
进一步地，步骤B所述的含间充质干细胞因子的修复液中包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合因子5-10份、透明质酸钠1-5份、甘露醇10-16份、烟酰胺1-6份、甜菜碱1-5份、寡肽-3 0.5-3份、聚二甲基硅氧烷1.2-4.5份、氮酮0.3-1份和夏枯草提取物10-20份。
优选地，步骤B所述的含间充质干细胞因子的修复液中包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合因子7-10份、透明质酸钠3-5份、甘露醇12-16份、烟酰胺3-6份、甜菜碱2-5份、寡肽-3 1.5-3份、聚二甲基硅氧烷2.4-4.5份、氮酮0.6-1份和夏枯草提取物15-20份。
具体地，一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法，包括如下步骤：
A.间充质干细胞复合因子的制备：
(1)脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养至80％-90％融合时进行细胞传代培养；
(2)间充质干细胞传代培养：吸弃步骤(1)中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1-3min，待细胞变圆后加等量的细胞传代培养基终止消化，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，用PBS缓冲液重悬沉淀，接种至细胞传代培养基进行P1代培养，根据细胞数量铺瓶(T175瓶)，细胞密度为1-3×104/mL，每瓶体积为25mL，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至P6代。
(3)间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集P2-P6代间充质干细胞培养的营养上清液，无菌生理盐水清洗细胞三次，加入0.25％胰酶消化细胞1-3min，无菌生理盐水重悬，13000-15000g转速，离心15-30min，利用无菌生理盐水调整细胞浓度为0.5-2×107/mL，4℃下超声破碎裂解细胞，13000-15000g转速，离心15-30min，收集细胞裂解上清液，将营养上清液和细胞裂解上清液以体积比2:1混匀，得到收集后的上清液；
(4)上清液的浓缩：将步骤(3)得到的收集后的上清液先用截留分子量为50KD的滤膜进行过滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为20倍，将浓缩液通过0.22μm的滤膜进行除菌过滤，得到间充质干细胞复合因子；
B.制备含间充质干细胞因子的修复液：
(5)提取夏枯草：将夏枯草用组织破碎器磨成粉，超声破碎20-30min，超声波破碎的功率为110-160W，超声波破碎的频率为16-21KHz，12000g转速，离心15-20min，收集上清，加入其重量4-6倍的质量分数为80％的乙醇溶液，提取三次，过滤、离心并且减压回收乙醇，得到夏枯草提取液；
(6)按重量份计，取夏枯草提取物10-20份、透明质酸钠1-5份、甘露醇10-16份、烟酰胺1-6份和寡肽-3 0.5-3份，40-60℃下搅拌混匀，得到第一混合物；
(7)按重量份计，取甜菜碱1-5份、聚二甲基硅氧烷1.2-4.5份和氮酮0.3-1.0份在球磨机中球磨均匀，得到第二混合物；
(8)按重量份计，取步骤A得到的间充质干细胞复合因子5-10份，与步骤(6)得到的第一混合物和步骤(7)得到的第二混合物在常温下高速混合均匀，混合转速为1500rpm，静置30-60min，得到含间充质干细胞因子的修复液。
本发明另一方面还提供了根据上述的制备方法制备得到的含间充质干细胞因子的修复液。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明所提供的一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法，所用的间充质干细胞来源于脐带华通胶，与其他间充质干细胞的来源相比，脐带华通胶的MSCs培养时间相对较短，细胞含量较高，MSCs的分离效率更高。
通过优化MSCs的培养基，提高了间充质干细胞因子的分泌量，加快了细胞增殖速度；经过对修复液的制备方法的整体优化，使含间充质干细胞因子的修复液的制备更为简单，缩短了制备时间，可适用于规模化生产。
另一方面，利用该方法生产得到的修复液具有修复痘印、晒伤、暗疮等效果，且温和不刺激，使用时无不良反应。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改于本领域的专业技术人员来说将而言是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例1
一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法
该方法具体包括如下步骤：
A.间充质干细胞复合因子的制备：
(1)脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养约十天左右，显微镜下可见MSCs细胞爬出组织，轻轻晃动培养瓶使组织脱落去除，加入培养基继续培养至80％-90％融合时进行传代培养；
(2)间充质干细胞传代培养：吸弃步骤(1)中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min，待细胞变圆后加等量的细胞传代培养基终止消化，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，用PBS缓冲液重悬沉淀，接种至细胞传代培养基进行P1代培养，根据细胞数量铺瓶(T175瓶)，细胞密度为1×104/mL，每瓶体积为25mL，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至P6代。
(3)间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集P2-P6代间充质干细胞培养的营养上清液，无菌生理盐水清洗细胞三次，加入0.25％胰酶消化细胞1min，无菌生理盐水重悬，13000g转速，离心30min，利用无菌生理盐水调整细胞浓度为1×104/mL，4℃下超声破碎裂解细胞，13000g转速，离心30min，收集细胞裂解上清液，将营养上清液和细胞裂解上清液以体积比2:1混匀，得到收集后的上清液；
(4)上清液的浓缩：将步骤(3)得到的收集后的上清液先用截留分子量为50KD的滤膜进行过滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为20倍，将浓缩液通过0.22μm的滤膜进行除菌过滤，得到间充质干细胞复合因子；
其中，完全培养基包括：达优MSCMB培养基85％(v/v)、Helios血清替代物8％(v/v)、谷氨酰胺3％(w/v)、吡哆醇盐酸盐3％(w/v)和乙醇胺1％(v/v)；
细胞传代培养基包括：α-MEM培养基90％(v/v)、胎牛血清6％(v/v)、α-酮戊二酸1.2％(w/v)、山梨醇0.8％(v/v)和银耳多糖2％(w/v)；
B.制备含间充质干细胞因子的修复液：
(5)提取夏枯草：将夏枯草用组织破碎器磨成粉，超声破碎20min，超声波破碎的功率为160W，超声波破碎的频率为21KHz，12000g转速，离心20min，收集上清，加入其重量4倍的质量分数为80％的乙醇溶液，提取三次，过滤、离心并且减压回收乙醇，得到夏枯草提取液；
(6)按重量份计，取夏枯草提取物10份、透明质酸钠1份、甘露醇10份、烟酰胺1份和寡肽-3 0.5份，40℃下搅拌混匀，得到第一混合物；
(7)按重量份计，取甜菜碱1份、聚二甲基硅氧烷1.2份和氮酮0.3份在球磨机中球磨均匀，得到第二混合物；
(8)按重量份计，取步骤A得到的间充质干细胞复合因子5份，与步骤(6)得到的第一混合物和步骤(7)得到的第二混合物在常温下高速混合均匀，混合转速为1500rpm，静置30min，得到含间充质干细胞因子的修复液。
制备得到的含间充质干细胞因子的修复液包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合因子5份、透明质酸钠1份、甘露醇10份、烟酰胺1份、甜菜碱1份、寡肽-3 0.5份、聚二甲基硅氧烷1.2份、氮酮0.3份和夏枯草提取物10份。
实施例2
一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法
该方法具体包括如下步骤：
A.间充质干细胞复合因子的制备：
(1)脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养，约十天左右，显微镜下可见MSCs细胞爬出组织，轻轻晃动培养瓶使组织脱落去除，加入培养基继续培养至80％-90％融合时进行传代培养；
(2)间充质干细胞传代培养：吸弃步骤(1)中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育3min，待细胞变圆后加等量的细胞传代培养基终止消化，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，用PBS缓冲液重悬沉淀，接种至细胞传代培养基进行P1代培养，根据细胞数量铺瓶(T175瓶)，细胞密度为3×104/mL，每瓶体积为25mL，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至P6代。
(3)间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集P2-P6代间充质干细胞培养的营养上清液，无菌生理盐水清洗细胞三次，加入0.25％胰酶消化细胞3min，无菌生理盐水重悬，15000g转速，离心15min，利用无菌生理盐水调整细胞浓度为2×104/mL，4℃下超声破碎裂解细胞，15000g转速，离心15min，收集细胞裂解上清液，将营养上清液和细胞裂解上清液以体积比2:1混匀，得到收集后的上清液；
(4)上清液的浓缩：将步骤(3)得到的收集后的上清液先用截留分子量为50KD的滤膜进行过滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为20倍，将浓缩液通过0.22μm的滤膜进行除菌过滤，得到间充质干细胞复合因子；
其中，完全培养基包括：达优MSCMB培养基95％(v/v)、Helios血清替代物3％(v/v)、谷氨酰胺1％(w/v)、吡哆醇盐酸盐0.5％(w/v)和乙醇胺0.5％(v/v)；
细胞传代培养基包括：α-MEM培养基95％(v/v)、胎牛血清3％(v/v)、α-酮戊二酸0.5％(w/v)、山梨醇0.3％(v/v)和银耳多糖1.2％(w/v)；
B.制备含间充质干细胞因子的修复液：
(5)提取夏枯草：将夏枯草用组织破碎器磨成粉，超声破碎30min，超声波破碎的功率为110W，超声波破碎的频率为16KHz，12000g转速，离心15min，收集上清，加入其重量6倍的质量分数为80％的乙醇溶液，提取三次，过滤、离心并且减压回收乙醇，得到夏枯草提取液；
(6)按重量份计，取夏枯草提取物20份、透明质酸钠5份、甘露醇16份、烟酰胺6份和寡肽-3 3份，60℃下搅拌混匀，得到第一混合物；
(7)按重量份计，取甜菜碱5份、聚二甲基硅氧烷4.5份和氮酮1.0份在球磨机中球磨均匀，得到第二混合物；
(8)按重量份计，取步骤A得到的间充质干细胞复合因子10份，与步骤(6)得到的第一混合物和步骤(7)得到的第二混合物在常温下高速混合均匀，混合转速为1500rpm，静置60min，得到含间充质干细胞因子的修复液。
制备得到的含间充质干细胞因子的修复液包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合因子10份、透明质酸钠5份、甘露醇16份、烟酰胺6份、甜菜碱5份、寡肽-3 3份、聚二甲基硅氧烷4.5份、氮酮1.0份和夏枯草提取物20份。
实施例3
一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法
该方法具体包括如下步骤：
A.间充质干细胞复合因子的制备：
(1)脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养，约十天左右，显微镜下可见MSCs细胞爬出组织，轻轻晃动培养瓶使组织脱落去除，加入培养基继续培养至80％-90％融合时进行传代培养；
(2)间充质干细胞传代培养：吸弃步骤(1)中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育2min，待细胞变圆后加等量的细胞传代培养基终止消化，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，用PBS缓冲液重悬沉淀，接种至细胞传代培养基进行P1代培养，根据细胞数量铺瓶(T175瓶)，细胞密度为2×104/mL，每瓶体积为25mL，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至P6代。
(3)间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集P2-P6代间充质干细胞培养的营养上清液，无菌生理盐水清洗细胞三次，加入0.25％胰酶消化细胞2min，无菌生理盐水重悬，14000g转速，离心20min，利用无菌生理盐水调整细胞浓度为3×104/mL，4℃下超声破碎裂解细胞，14000g转速，离心20min，收集细胞裂解上清液，将营养上清液和细胞裂解上清液以体积比2:1混匀，得到收集后的上清液；
(4)上清液的浓缩：将步骤(3)得到的收集后的上清液先用截留分子量为50KD的滤膜进行过滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为20倍，将浓缩液通过0.22μm的滤膜进行除菌过滤，得到间充质干细胞复合因子；
其中，完全培养基包括：达优MSCMB培养基93％(v/v)、Helios血清替代物4％(v/v)、谷氨酰胺1.6％(w/v)、吡哆醇盐酸盐0.8％(w/v)和乙醇胺0.6％(v/v)；
细胞传代培养基包括：α-MEM培养基93％(v/v)、胎牛血清4.4％(v/v)、α-酮戊二酸0.7％(w/v)、山梨醇0.4％(v/v)和银耳多糖1.5％(w/v)；
B.制备含间充质干细胞因子的修复液：
(5)提取夏枯草：将夏枯草用组织破碎器磨成粉，超声破碎25min，超声波破碎的功率为130W，超声波破碎的频率为18KHz，12000g转速，离心18min，收集上清，加入其重量5倍的质量分数为80％的乙醇溶液，提取三次，过滤、离心并且减压回收乙醇，得到夏枯草提取液；
(6)按重量份计，取夏枯草提取物18份、透明质酸钠4份、甘露醇15份、烟酰胺5份和寡肽-3 2份，50℃下搅拌混匀，得到第一混合物；
(7)按重量份计，取甜菜碱3份、聚二甲基硅氧烷3份和氮酮0.8份在球磨机中球磨均匀，得到第二混合物；
(8)按重量份计，取步骤A得到的间充质干细胞复合因子8份，与步骤(6)得到的第一混合物和步骤(7)得到的第二混合物在常温下高速混合均匀，混合转速为1500rpm，静置50min，得到含间充质干细胞因子的修复液。
制备得到的含间充质干细胞因子的修复液包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合因子8份、透明质酸钠4份、甘露醇15份、烟酰胺5份、甜菜碱3份、寡肽-3 2份、聚二甲基硅氧烷3份、氮酮0.8份和夏枯草提取物18份。
实施例4
一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法
该方法具体包括如下步骤：
A.间充质干细胞复合因子的制备：
(1)脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养，约十天左右，显微镜下可见MSCs细胞爬出组织，轻轻晃动培养瓶使组织脱落去除，加入培养基继续培养至80％-90％融合时进行传代培养；
(2)间充质干细胞传代培养：吸弃步骤(1)中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min，待细胞变圆后加等量的细胞传代培养基终止消化，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，用PBS缓冲液重悬沉淀，接种至细胞传代培养基进行P1代培养，根据细胞数量铺瓶(T175瓶)，细胞密度为1×104/mL，每瓶体积为25mL，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至P6代。
(3)间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集P2-P6代间充质干细胞培养的营养上清液，无菌生理盐水清洗细胞三次，加入0.25％胰酶消化细胞1min，无菌生理盐水重悬，13000g转速，离心30min，利用无菌生理盐水调整细胞浓度为1×104/mL，4℃下超声破碎裂解细胞，13000g转速，离心30min，收集细胞裂解上清液，将营养上清液和细胞裂解上清液以体积比2:1混匀，得到收集后的上清液；
(4)上清液的浓缩：将步骤(3)得到的收集后的上清液先用截留分子量为50KD的滤膜进行过滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为20倍，将浓缩液通过0.22μm的滤膜进行除菌过滤，得到间充质干细胞复合因子；
其中，完全培养基包括：达优MSCMB培养基90％(v/v)、Helios血清替代物5.7％(v/v)、谷氨酰胺2％(w/v)、吡哆醇盐酸盐1.5％(w/v)和乙醇胺0.8％(v/v)；
细胞传代培养基包括：α-MEM培养基92％(v/v)、胎牛血清5.1％(v/v)、α-酮戊二酸0.8％(w/v)、山梨醇0.5％(v/v)和银耳多糖1.6％(w/v)；
B.制备含间充质干细胞因子的修复液：
(5)提取夏枯草：将夏枯草用组织破碎器磨成粉，超声破碎20min，超声波破碎的功率为160W，超声波破碎的频率为21KHz，12000g转速，离心20min，收集上清，加入其重量4倍的质量分数为80％的乙醇溶液，提取三次，过滤、离心并且减压回收乙醇，得到夏枯草提取液；
(6)按重量份计，取夏枯草提取物15份、透明质酸钠3份、甘露醇12份、烟酰胺3份和寡肽-3 1.5份，40℃下搅拌混匀，得到第一混合物；
(7)按重量份计，取甜菜碱2份、聚二甲基硅氧烷2.4份和氮酮0.6份在球磨机中球磨均匀，得到第二混合物；
(8)按重量份计，取步骤A得到的间充质干细胞复合因子7份，与步骤(6)得到的第一混合物和步骤(7)得到的第二混合物在常温下高速混合均匀，混合转速为1500rpm，静置30min，得到含间充质干细胞因子的修复液。
制备得到的含间充质干细胞因子的修复液包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合因子7份、透明质酸钠3份、甘露醇12份、烟酰胺3份、甜菜碱2份、寡肽-3 1.5份、聚二甲基硅氧烷2.4份、氮酮0.6份和夏枯草提取物15份。
实施例5
一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法
该方法具体包括如下步骤：
A.间充质干细胞复合因子的制备：
(1)脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养，约十天左右，显微镜下可见MSCs细胞爬出组织，轻轻晃动培养瓶使组织脱落去除，加入培养基继续培养至80％-90％融合时进行传代培养；
(2)间充质干细胞传代培养：吸弃步骤(1)中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育3min，待细胞变圆后加等量的细胞传代培养基终止消化，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，用PBS缓冲液重悬沉淀，接种至细胞传代培养基进行P1代培养，根据细胞数量铺瓶(T175瓶)，细胞密度为3×104/mL，每瓶体积为25mL，将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至P6代。
(3)间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集P2-P6代间充质干细胞培养的营养上清液，无菌生理盐水清洗细胞三次，加入0.25％胰酶消化细胞3min，无菌生理盐水重悬，15000g转速，离心15min，利用无菌生理盐水调整细胞浓度为3×104/mL，4℃下超声破碎裂解细胞，15000g转速，离心15min，收集细胞裂解上清液，将营养上清液和细胞裂解上清液以体积比2:1混匀，得到收集后的上清液；
(4)上清液的浓缩：将步骤(3)得到的收集后的上清液先用截留分子量为50KD的滤膜进行过滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为20倍，将浓缩液通过0.22μm的滤膜进行除菌过滤，得到间充质干细胞复合因子；
其中，完全培养基包括：达优MSCMB培养基95％(v/v)、Helios血清替代物3％(v/v)、谷氨酰胺1％(w/v)、吡哆醇盐酸盐0.5％(w/v)和乙醇胺0.5％(v/v)；
细胞传代培养基包括：α-MEM培养基95％(v/v)、胎牛血清3％(v/v)、α-酮戊二酸0.5％(w/v)、山梨醇0.3％(v/v)和银耳多糖1.2％(w/v)；
B.制备含间充质干细胞因子的修复液：
(5)提取夏枯草：将夏枯草用组织破碎器磨成粉，超声破碎30min，超声波破碎的功率为110W，超声波破碎的频率为16KHz，12000g转速，离心15min，收集上清，加入其重量6倍的质量分数为80％的乙醇溶液，提取三次，过滤、离心并且减压回收乙醇，得到夏枯草提取液；
(6)按重量份计，取夏枯草提取物20份、透明质酸钠5份、甘露醇16份、烟酰胺6份和寡肽-3 3份，60℃下搅拌混匀，得到第一混合物；
(7)按重量份计，取甜菜碱5份、聚二甲基硅氧烷4.5份和氮酮1.0份在球磨机中球磨均匀，得到第二混合物；
(8)按重量份计，取步骤A得到的间充质干细胞复合因子10份，与步骤(6)得到的第一混合物和步骤(7)得到的第二混合物在常温下高速混合均匀，混合转速为1500rpm，静置60min，得到含间充质干细胞因子的修复液。
制备得到的含间充质干细胞因子的修复液包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合因子10份、透明质酸钠5份、甘露醇16份、烟酰胺6份、甜菜碱5份、寡肽-3 3份、聚二甲基硅氧烷4.5份、氮酮1.0份和夏枯草提取物20份。
对比例1
与实施例3的区别仅在于，制备得到的含间充质干细胞因子的修复液包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合因子4份、透明质酸钠6份、甘露醇8份、烟酰胺7份、甜菜碱0.8份、寡肽-3 3.5份、聚二甲基硅氧烷1份、氮酮1.5份和夏枯草提取物8份。
对比例2
与实施例3的区别仅在于，制备得到的含间充质干细胞因子的修复液包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合因子12份、透明质酸钠0.8份、甘露醇18份、烟酰胺0.8份、甜菜碱6份、寡肽-3 0.3份、聚二甲基硅氧烷5份、氮酮0.2份和夏枯草提取物22份。
对比例3
与实施例3的区别仅在于，完全培养基包括：达优MSCMB培养基80％(v/v)、Helios血清替代物10％(v/v)、谷氨酰胺5％(w/v)、吡哆醇盐酸盐3.5％(w/v)和乙醇胺1.5％(v/v)。
对比例4
与实施例3的区别仅在于，完全培养基包括：达优MSCMB培养基96％(v/v)、Helios血清替代物2.4％(v/v)、谷氨酰胺0.8％(w/v)、吡哆醇盐酸盐0.4％(w/v)和乙醇胺0.4％(v/v)。
对比例5
与实施例3的区别仅在于，细胞传代培养基包括：α-MEM培养基87％(v/v)、胎牛血清8％(v/v)、α-酮戊二酸1.5％(w/v)、山梨醇1％(v/v)和银耳多糖2.5％(w/v)。
对比例6
与实施例3的区别仅在于，细胞传代培养基包括：α-MEM培养基97％(v/v)、胎牛血清2％(v/v)、α-酮戊二酸0.3％(w/v)、山梨醇0.2％(v/v)和银耳多糖0.5％(w/v)。
一、细胞因子浓度变化检测
使用ELASIA试剂盒对实施例1-5和对比例3-6中脐带间充质干细胞浓缩前和浓缩后的表皮生长因子、血管内皮生长因子和血小板源生长因子的含量进行检测，得到表1：
表1细胞因子含量变化
由表1可知，本申请中细胞上清液使用超滤膜过滤浓缩了40倍左右，实施例1-5中细胞因子含量较高，其中，实施例3中细胞因子含量最高，对比例3-6中细胞因子的含量均小于实施例3。上述结果表明本申请通过制备方法的优化，提高了间充质干细胞因子的分泌量。
二、皮肤治愈情况及感官评价
寻找皮肤需要修复受试者共350名，均分为7组，分别涂抹本申请实施例1-5和对比例1-2的修复液，早晚各一次，持续三周，统计受试者治愈率(其中，治愈：皱纹、暗疮、斑等消失，未留疤痕；有效：皱纹、暗疮、斑明显消失；无效：皱纹、暗疮、斑等不变。)，同时，令受试者对修复液进行感官打分评价并统计(0-3分：存在强烈不适感；4-7分：存在轻微不适感；8-10分：不存在不适感)，得到表2：
表2治愈情况及感官评价
注：表中分数为平均分。
由表2可知，实施例1-5中受试者治愈率和总有效率较高，对比例1-2的受试者治愈率和总有效率相对较低，其中，实施例3中受试者治愈率和总有效率最高，分别为70％和100％。受试者感官评价同样遵循这一规律，实施例1-5分数较高，实施例5分数最高，为9.89分。上述结果表明，本申请方法生产得到的修复液具有修复痘印、晒伤、暗疮等效果，且温和不刺激，使用时无不良反应。
三、细胞增殖速率检测
在实施例1-5和对比例3-4间充质干细胞原代培养过程初始和结束时进行取样，在实施例1-5和对比例5-6间充质干细胞传代培养过程中不同代次(P1-P6)进行取样，采用台盼蓝染色法对细胞数量进行测定，得到表3和表4。
表3细胞总量和活率统计
表4间充质干细胞传代培养细胞数量统计
| 传代数 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 对比例5 | 对比例6 |
| P1 | 2.0×10<sup>7</sup> | 2.1×10<sup>7</sup> | 2.7×10<sup>7</sup> | 2.4×10<sup>7</sup> | 2.5×10<sup>7</sup> | 1.9×10<sup>7</sup> | 1.8×10<sup>7</sup> |
| P2 | 7.1×10<sup>7</sup> | 7.0×10<sup>7</sup> | 7.8×10<sup>7</sup> | 7.5×10<sup>7</sup> | 7.6×10<sup>7</sup> | 6.6×10<sup>7</sup> | 6.7×10<sup>7</sup> |
| P3 | 1.9×10<sup>8</sup> | 2.0×10<sup>8</sup> | 2.6×10<sup>8</sup> | 2.3×10<sup>8</sup> | 2.4×10<sup>8</sup> | 1.6×10<sup>8</sup> | 1.6×10<sup>8</sup> |
| P4 | 5.8×10<sup>8</sup> | 6.0×10<sup>8</sup> | 6.6×10<sup>8</sup> | 6.3×10<sup>8</sup> | 6.4×10<sup>8</sup> | 5.4×10<sup>8</sup> | 5.3×10<sup>8</sup> |
| P5 | 2.0×10<sup>9</sup> | 1.9×10<sup>9</sup> | 2.5×10<sup>9</sup> | 2.3×10<sup>9</sup> | 2.4×10<sup>9</sup> | 1.6×10<sup>9</sup> | 1.5×10<sup>9</sup> |
| P6 | 6.0×10<sup>9</sup> | 6.0×10<sup>9</sup> | 6.5×10<sup>9</sup> | 6.2×10<sup>9</sup> | 6.3×10<sup>9</sup> | 5.5×10<sup>9</sup> | 5.5×10<sup>9</sup> |
由表3可知，实施例1-5中间充质干细胞原代培养增殖速度较快，其中，实施例3增殖速度最快，同时细胞活率也最高，达99.1％，对比例3-4相对而言较慢，表明本申请中完全培养基的组分与配比能够提高细胞增殖速率。由表4可知，实施例1-5中间充质干细胞传代培养增殖速度较快，其中，实施例3增殖速度最快，对比例5-6相对而言较慢，表明本申请中的传代培养基的组分与配比能够提高细胞增殖速率。综上可知，本申请的制备方法加快了细胞的增殖速度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种含间充质干细胞因子的修复液的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
A.间充质干细胞复合因子的制备：经过脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养、间充质干细胞传代培养、上清液的收集和上清液的浓缩，得到间充质干细胞复合因子；
B.制备含间充质干细胞因子的修复液：提取夏枯草，得到夏枯草提取物；按重量份计，取夏枯草提取物、透明质酸钠、甘露醇、烟酰胺和寡肽-3搅拌混匀，得到第一混合物；
取甜菜碱、聚二甲基硅氧烷和氮酮球磨均匀，得到第二混合物；
取步骤A得到的间充质干细胞复合因子与第一混合物和第二混合物混匀、静置，得到含间充质干细胞因子的修复液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A所述的间充质干细胞复合因子的制备，具体步骤如下：
(1)脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：将人脐带组织用75％乙醇浸泡，组织两端各剪去1cm，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成小段，生理盐水清洗3次，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除静脉、动脉和羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎，转移至完全培养基进行原代细胞培养，培养至80％-90％融合时进行细胞传代；
(2)间充质干细胞传代培养：吸弃步骤(1)中待传代细胞的培养液，加入生理盐水洗涤组织贴壁面，加入0.25％胰酶，37℃孵育1-3min，待细胞变圆后，加细胞传代培养基终止消化，快速震荡，吹打细胞，吸出细胞悬液，加入生理盐水洗涤，离心，收集沉淀，用PBS缓冲液重悬沉淀，接种至细胞传代培养基进行P1代培养，细胞生长至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至P6代；
(3)上清液的收集：收集P2-P6代间充质干细胞培养的营养上清液，无菌生理盐水清洗细胞，加入0.25％胰酶消化细胞，无菌生理盐水重悬并离心，调整细胞浓度，超声破碎裂解细胞，离心，收集细胞裂解上清液，将营养上清液和细胞裂解上清液以体积比2:1混匀，得到收集后的上清液；
(4)上清液的浓缩：将步骤(3)得到的收集后的上清液用截留分子量为50KD和3KD的滤膜依次过滤、浓缩，0.22μm滤膜除菌过滤，得到间充质干细胞复合因子；
所述的完全培养基包括：达优MSCMB培养基85％-95％(v/v)、Helios血清替代物3％-8％(v/v)、谷氨酰胺1％-3％(w/v)、吡哆醇盐酸盐0.5％-3％(w/v)和乙醇胺0.5％-1％(v/v)；
所述的细胞传代培养基包括：α-MEM培养基90％-95％(v/v)、胎牛血清3％-6％(v/v)、α-酮戊二酸0.5％-1.2％(w/v)、山梨醇0.3％-0.8％(v/v)和银耳多糖1.2％-2％(w/v)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的原代细胞培养和传代培养所用的培养条件为37℃，5％CO2，湿度为95％。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述接种的细胞密度为1-3×104/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的完全培养基包括：达优MSCMB培养基90％-95％(v/v)、Helios血清替代物3％-5.7％(v/v)、谷氨酰胺1％-2％(w/v)、吡哆醇盐酸盐0.5％-1.5％(w/v)和乙醇胺0.5％-0.8％(v/v)。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的细胞传代培养基包括：α-MEM培养基92％-95％(v/v)、胎牛血清3％-5.1％(v/v)、α-酮戊二酸0.5％-0.8％(w/v)、山梨醇0.3％-0.5％(v/v)和银耳多糖1.2％-1.6％(w/v)。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的调整细胞浓度为1-3×104/mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B中所述的提取夏枯草的步骤包括：将夏枯草磨成粉，超声破碎20-30分钟，离心，收集上清，加入其重量4-6倍的质量分数为80％的乙醇溶液，提取三次，过滤、离心并且减压回收乙醇，得到夏枯草提取液。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B所述的含间充质干细胞因子的修复液中包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合因子5-10份、透明质酸钠1-5份、甘露醇10-16份、烟酰胺1-6份、甜菜碱1-5份、寡肽-3 0.5-3份、聚二甲基硅氧烷1.2-4.5份、氮酮0.3-1份和夏枯草提取物10-20份。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的制备方法制备得到的含间充质干细胞因子的修复液。
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