CN114432161A

CN114432161A - 一种具有抗衰老和皮肤修复效果的人脐带间充质干细胞活性因子液的制备方法和应用

Info

Publication number: CN114432161A
Application number: CN202011122957.5A
Authority: CN
Inventors: 王建辉; 张晓娟; 孙海星; 林思妮; 白玉杰; 张艳; 吴东颖; 董红宇
Original assignee: Shandong Jingwei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Jingwei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2022-05-06

Abstract

本发明公开了一种具有抗衰老和皮肤修复效果的人脐带间充质干细胞活性因子液的制备方法和应用，其包括以下步骤：1、人脐带间充质干细胞的原代分离与传代培养，饥饿法获取活性因子溶液，对活性因子进行过滤浓缩并冻干；2、本发明还提供了一种人脐带间充质干细胞活性因子的化妆品。元宝枫籽油与皮肤脂质相似，给皮肤提供多种脂肪酸和维生素，平衡皮肤的渗透力。同时，元宝枫籽油中还含有的特殊功能成分——神经酸（Nervonic Acid），又名鲨鱼酸（Selacholeic Acid），元宝枫籽油脂肪酸组成中神经酸的含量为5%~6%。人脐带间充质干细胞在分裂过程中分泌的细胞因子与元宝枫籽油通过合理配比，在化妆品行业有很广泛的应用，应用前景良好。

Description

一种具有抗衰老和皮肤修复效果的人脐带间充质干细胞活性因子液的制备方法和应用

技术领域

本发明属于皮肤抗衰老及美白修复技术领域，具体涉及一种具有抗衰老和皮肤修复效果的人脐带间充质干细胞活性因子液的制备方法和应用。

背景技术

人脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)可以从新生儿脐带中的华通氏胶分离提取，其优点是来源广泛、采集方便、可以体外大量增殖、免疫原性弱、无伦理问题等优点。

然而，研究表明，在体外扩增培养后的间充质干细胞会随着培养时间的延长，分化能力逐渐减弱；通过静脉注射或者局部注射的体外扩增培养的间充质干细胞，只有极少量细胞存活下来，而这少量存活的细胞通过分泌大量的活性因子, 活性因子一般是指干细胞培养过程中，通过细胞分泌到培养基中具有极高生物活性的可溶性蛋白质或者多肽物质等，例如表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素（IL）、各种胶原蛋白（如I，II，III，IV型）等而发挥作用。

研究发现，多种细胞因子发挥网络式的调节作用，直接或者间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移。它们可以参与维持细胞骨架稳定，保护细胞；促进皮肤新陈代谢，改善皮肤微循环；促进自身干细胞向衰老凋亡部位迁移迁移和分化，修复组织；促进细胞增殖，促进弹性纤维和胶原蛋白的合成，具有很好的抗衰老，美白肌肤，防紫外辐射，愈合伤口，祛疤痕，除皱，组织修复等功效。

元宝枫（acer truncatum bunge）属于属于槭树科槭属多年生乔木，是我国特有的品种，多见于安徽南部、甘肃南部、吉林以南及内蒙古等地。元宝枫籽中含油率高，可达45%~48%。元宝枫籽油是不饱和脂肪酸较高（＞92%）的不干性油，富含人体必需的脂肪酸，脂溶性维生素等。元宝枫籽油与皮肤脂质相似，给皮肤提供多种脂肪酸和维生素，平衡皮肤的渗透力。

同时，元宝枫籽油中还含有的特殊功能成分——神经酸（Nervonic Acid），又名鲨鱼酸（Selacholeic Acid），元宝枫籽油脂肪酸组成中神经酸的含量为5%~6%。神经酸是大脑神经组织和细胞的一种核心天然成分，是大脑细胞、视神经细胞、周围神经生长、再发育和维持所必需的营养物质，能够修复受损神经细胞，提高神经细胞的活跃性以延缓衰老；此外神经酸对修复硬化的心脑血管壁及调节血脂具有重要作用。干细胞活性因子与元宝枫籽油通过合理配比，在化妆品行业有很广泛的应用，应用前景良好。

发明内容

本发明提供一种分离人脐带间充质干细胞活性因子的方法，它包括如下步骤：

a、间充质干细胞的分离与培养：从健康的足月的新生儿脐带中分离出脐带间充质干细胞，用无血清培养基进行扩增和传代培养；

b、活性因子的收集：细胞培养至密度达到80%左右为宜，通过饥饿法培养48-72h，收集含有活性因子的上清液；

c、活性因子的浓缩：将上述得到的含有活性因子的上清液，先采用0.22μm滤膜，确保活性细胞因子溶液无菌；然后通过50KDa超滤膜，收集透析液，再将透析液通过3KDa超滤膜，收集截留液（按照2.5×10⁶细胞/毫升进行浓缩），得到活性因子浓缩液。

步骤a中，所述的脐带来源：产妇检测乙肝、丙肝、梅毒和HIV全阴性，正常剖宫产或者顺产；产妇年龄小于28周岁的健康足月新生儿。

本发明中脐带间充质干细胞分离方法为：通过酶解（胶原酶、透明质酸酶、中性蛋白酶）脐带组织块，培养所得。

本发明还提供一种人脐带间充质干细胞活性因子冻干粉的制备方法，它包括如下步骤：将步骤c中得到的细胞因子浓缩液添加保护剂获得冻干粉原液，然后冻干，得到脐带间充质干细胞活性因子冻干粉。

冻干粉原液冻干前添加保护剂，成分及含量如下：3-o-乙基抗坏血酸 1g/100mL、牛磺酸0.15g/100mL、α-酮戊二酸-L-精氨酸 0.5g/100mL、甘露醇5g/100mL、海藻糖3g/100mL、人白蛋白0.5mL/100mL。

其中，冻干粉原液按照3mL/支分装；冻干条件为：压强20~50Pa，温度-30℃~26℃的的冻干条件下冻干24~36h。

本发明还提供上述方法制备得到脐带间充质干细胞活性因子冻干粉。

本发明还提供具有抗衰老和皮肤修复效果的人脐间充质干细胞活性因子精华液组合物的应用。

其中，活性因子冻干粉制剂1瓶配1支5mL冻干粉溶媒组合成外用化妆品，1支5mL冻干粉溶媒成分及含量如下：烟酰胺 3g/100mL，高分子透明质酸钠（大于80KDA）0.25/100mL，中分子量透明质酸钠（10~80KDA）0.15g/100mL，小分子量透明质酸钠（小于10KDA）0.05g/100mL，乳化剂Span80-PEG-40氢化蓖麻油（质量比1：3）3g/100mL，元宝枫籽油1.0mL/100mL，防腐剂羟基苯甲酯0.15g/100mL，无菌超纯水补足100mL。将5mL溶媒倒入冻干粉中，轻轻震荡，静置5min，制成含有元宝枫籽油的精华液。

元宝枫种子中含油量高达45%-48%，是不饱和脂肪酸含量较高（>90%）的不干性油。元宝枫籽油含有人体必须脂肪酸油酸（25%）和亚油酸（36%），两者占脂肪酸总量的60%以上。元宝枫籽油中还富含维生素E（125mg/100g），维生素E可以防治皮肤弹性降低、皮脂腺作用减退，保水性能减少，过剩色素沉着等皮肤老化的外观症状。

有益效果

本发明有益效果是：（1）通过饥饿法提高细胞因子的产量，又不会引入血清替代物或者胎牛血清中的复杂成分，减少了用于抗衰老、美容中存在的免疫排斥反应；（2）然后通过超滤膜去除活性因子中大分子活性因子（大于50KDa）和小分子活性因子（小于3KDa），然后制备成冻干粉，保质期可以长达3年，获得的细胞因子浓度更高；（3）本发明的脐带间充质干细胞活性因子可以参与维持细胞骨架稳定，保护细胞；促进皮肤新陈代谢，改善皮肤微循环；促进自身干细胞向衰老凋亡部位迁移迁移和分化，修复组织；促进细胞增殖，促进弹性纤维和胶原蛋白的合成，具有很好的抗衰老，美白肌肤，防紫外辐射，愈合伤口，祛疤痕，除皱，组织修复等功效；（4）元宝枫籽油与皮肤脂质的相似性，能为皮肤提供多种活性成分和必需脂肪酸，可平衡皮肤的渗透能力，在化妆品中应用效果良好，具有良好的市场前景；神经酸可以达到真皮层，并且在皮肤表面无油腻感，能有效提高皮肤屏障的修复率。

附图说明

附图1是HUcMSC原代分离培养4天倒置显微镜照片；

附图2是HUcMSC培养至第三代的倒置显微镜照片；

附图3是第三代脐带间充质干细胞的流式细胞分析结果；

FITCmouse Anti-Human CD90；PEMouseAnti-Human CD44

PerCP-CyTM 5.5 Mouse Anti-Human CD 105；APC Mouse Anti-Human CD 73

附图4是细胞划痕实验的0,12,24h细胞增殖照片；

附图5是有痘印志愿者使用前后的对比；

附图6是有眼角细纹志愿者使用前后的对比图；

附图7是细胞活性因子精华液的保湿性评价。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒说明书选择。

实验试剂及仪器

表1：实验试剂及购买厂家

实施例1

本发明脐带间充质干细胞活性因子冻干粉的制备。

一、脐带来源

胎儿父母签署脐带捐赠知情者同意书，孕妇产妇检测乙肝、丙肝、梅毒和HIV全阴性，正常剖宫产或者顺产；产妇年龄小于28周岁的健康足月新生儿；分娩同时采集到的检查结果合格的脐带。

二、制备方法

1、人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）培养上清液的获取：

（1）在无菌条件下，将捐赠的脐带使用眼科剪剪碎成3-5mm³大小左右的组织块；

（2）使用胶原酶、透明质酸酶、中性蛋白酶对组织块在37℃条件下进行消化，消化至大组织块消失；

（3）在无菌条件下，使用细胞筛对消化液进行过滤，将过滤液进行离心收集细胞，加入完全培养基[98%（v/v）12-725F+2%（v/v）PALL]，在T25培养瓶中对细胞进行培养，3-5天换液，当P0代MSC密度达到80%左右，进行传代培养，P0带培养4天后，倒置显微镜下观察，如附图1所示；

（4）将收集到的细胞接种到T75培养瓶中，进行扩增培养，当P2代细胞密度达到80%左右，调整细胞浓度3~5×10⁶个/ml/管，保存至液氮储存系统中；

（5）按照需求对细胞进行复苏，并传代培养。当传代至P4后，使用完全培养基对细胞进行培养，使用倒置显微镜对细胞形态进行观察，如附图3所示；当细胞密度达到80%左右，将完全培养基吸出，加入无血清基础培养基进行饥饿培养48h后，收集培养上清液，临时不处理的培养基放置于-80冰箱保存；

2、过滤与浓缩

对收集到的无血清培养上清液进行处理：首先3000×g，4℃，离心15min去除培养上清液中的大分子片段；然后使用0.22μm过滤膜过滤，去除未离心来下的小细胞碎片；然后将上清液依次通过50KAD滤膜，收集低于50KDA的细胞活性因子滤出液，再将滤出液使用3KDA滤膜进行浓缩（按照2.5×10⁶细胞/mL），收集浓缩液。

三、实验结果

1、人脐带间充质干细胞的形态

取培养3-5天的P0代细胞倒置显微镜观察，结果如图1所示；取P4代细胞倒置显微镜观察，结果如图2所示；

2、人脐带间充质干细胞的免疫表型

取P4代细胞进行流式检测，检测结果如图3所示：细胞高表达CD73，CD90，CD105，但不表CD44，符合人脐带间充质干细胞的表面标志特征；

3、细胞活性因子浓缩液中细胞因子含量测定

用美国RD公司生产的试剂盒对浓缩液中的表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）和血管内表皮生长因子（VEGF）为代表的细胞活性因子进行检测。检测结果如表2所示：

表2：检测活性因子种类及结果

。

四、细胞活性因子冻干粉的制备

在上述实验中获得的细胞活性因子浓缩液中加入一定量的冻干保护剂，成分及含量如下：3-o-乙基抗坏血酸 1.0g/100mL、牛磺酸0.15g/100mL、α-酮戊二酸-L-精氨酸 0.5g/100mL、甘露醇5g/100mL、海藻糖3g/100mL、人白蛋白0.5mL/100mL；

冻干粉原液按照3mL/支分装；冻干条件为：压强20~50Pa，温度-30℃~26℃的的冻干条件下冻干24~36h。

五、人脐带间充质干细胞活性因子精华液溶媒的制备

1、活性因子精华液溶媒的成分组成

冻干粉溶媒成分及含量如下：烟酰胺 3g/100mL，高分子透明质酸钠（大于80KDA）0.25g/100mL，中分子量透明质酸钠（10~80KDA）0.15g/100mL，小分子量透明质酸钠（小于10KDA）0.05g/100mL，乳化剂Span80-PEG-40氢化蓖麻油（质量比1：3）3g/100mL，元宝枫籽油1.0mL/100mL，防腐剂羟基苯甲酯0.15g/100mL，无菌超纯水补足100mL。将5mL溶媒倒入冻干粉中，轻轻震荡，静置5min，制成含有元宝枫籽油的精华液；

2、活性因子精华液溶媒的制备过程

（1）按照配方称量甘油、乳化剂、元宝枫籽油，防腐剂于烧杯中，63±2℃，100rpm，搅拌均匀，形成均一的油相，将去离子水缓慢滴加到油相中，将水全部滴加完后，继续搅拌25~30min，形成均一透明的乳化液；

（2）将乳化液降温至30℃，加入高分子透明质酸钠（大于80KDA）0.25/100mL，中分子量透明质酸钠（10~80KDA）0.15g/100mL，小分子量透明质酸钠（小于10KDA）0.05g/100mL，烟酰胺3g/100m，搅拌透明质酸钠完全溶解，出料；

（3）将活性因子精华液溶媒按照5mL每瓶分装于西林瓶中。

实施例2细胞划痕实验

一、实验流程

（1）使用marker笔在6孔板背后均匀画直线，大约每隔0.5-1cm画一道，横穿过孔。每孔至少穿过五条线；

（2）在孔中加入约5×10⁵个细胞，加入完全培养基，使其过夜能铺满孔；

（3）第二天用无菌枪头垂直于背后横线在孔内形成划痕，枪头要垂直，不能倾斜；

用PBS清洗6孔板，去除划痕处的细胞，加入无血清培养基和1支冻干粉的水溶液，3个孔作为实验组，3个孔作为对照组；

放入二氧化碳培养箱中培养。按0,12,24h进行拍照；

二、实验结果

在二氧化碳培养箱中培养0,12,24小时后进行拍照记录。冻干粉对细胞的增殖影响如附图4所示。

实施例3志愿者直接涂抹测试：

一、招募志愿者120名，均为女性，年龄25~40岁，分为3组，每组共40名。面部有痘印的平均分到3组中，每组25人；眼角有细纹的平均分到3组，每组15人。实验前均得到志愿者的知情同意，并经伦理委员会批准；

二、实验方法

实验组40人，每天早晚洁面后，在脸部涂抹由实施例1制备人脐间充质干细胞活性因子精华液组合物，用量为每次0.5-0.7mL，并均匀涂抹至脸部，每天2次，使用周期为30天；

对照组40人，每天早晚洁面后，在脸部涂抹由市面上购买的水光针，用量为每次0.5-0.7mL，均匀涂抹至脸部，每天2次，使用周期为30天；

三、实验结果

观察实验组志愿者肌肤，面部痘印有改善的达到21人；眼角细纹抚平的达到11人。总有效率达到80%；观察对照组志愿者肌肤，有效率低于本发明的人脐带间充质干细胞活性因子精华液；

具体肤质改善情况见附图，附图5是有痘印志愿者使用前后的对比图；附图6是有眼角细纹志愿者使用前后的对比图。

实施例4精华液的保湿评价

一、实验条件

招募志愿者15人，均为女性，年龄25-40岁；

室温在20±2℃，相对湿度（RH）55%±3%。测试者在测试前30min进入测试环境中安静等待，测试前10min漏出上臂，用德国CK34皮肤测试仪检测上臂内侧；

二、测试过程

按照2μL±0.01μL细胞活性因子精华液/cm²的用量涂抹至志愿者上臂内侧同一位置，分别测试使用产品后每小时受试者部位的水分值，并记录其数值。每个数值重复测量3次；

三、实验结果

使用细胞活性因子精华液后，皮肤水分增长率（WRG）在40%以下，视产品保湿效果不明显；WRG在40%~70%，视产品保湿有效；WRG在70%以上，视产品保湿效果明显。

保湿效果评价公式：

WRG=（M_测量值-M_空白值）/M_空白值×100%

细胞活性因子精华液通过小分子量的透明质酸钠对皮肤进行补水，并通过活性因子中的大分子蛋白，高分子的透明质酸钠以及元宝枫籽油中的不同链长脂肪酸可以有效的锁住水分；

在涂抹0h~4h内，志愿者使用细胞活性因子精华液产品的总有效率会随着时间的增加（0h~4h），一直处于缓慢下降的趋势，0h时为87%，1h为79%，2h为73%，3h~4h为69%，以上数据可以从侧面证明该产品的保湿功效可以长达4h。具体的效果如附图7所示。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种分离人脐带间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：包括以下步骤：

c、活性因子的浓缩：将上述得到的含有活性因子的上清液，先采用0.22μm滤膜，确保活性细胞因子溶液无菌；然后通过50KDa超滤膜，收集透析液，再将透析液通过3KDa超滤膜，收集截留液（按照2.5×106细胞/mL进行浓缩），得到活性因子浓缩液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤a中，所述的脐带来源：产妇检测乙肝、丙肝、梅毒和HIV全阴性，正常剖宫产或者顺产；产妇年龄小于28周岁的健康足月新生儿；

所述的脐带间充质干细胞分离方法为：通过酶解（胶原酶、透明质酸酶、中性蛋白酶）脐带组织块，培养所得；

所述的活性因子浓缩液中收集分子量在3KDA~50KDA的活性因子。

3.权利要求1或2所述方法制备得到活性因子浓缩液。

4.一种人脐带间充质干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：包括的步骤：取权利要求3所述的细胞因子浓缩液添加保护剂获得冻干粉原液，然后使用冻干机进行真空冻干，得到脐带间充质干细胞活性因子冻干粉。

5.根据要求4所述的方法，其特征在于：

步骤4中冻干粉原液冻干前添加保护剂，成分及含量如下：

3-o-乙基抗坏血酸 1.0g/100mL、牛磺酸0.15g/100mL、α-酮戊二酸-L-精氨酸 0.5g/100mL、甘露醇5g/100mL、海藻糖3g/100mL、人白蛋白0.5mL/100mL；

所述冻干粉原液按照3mL/支分装；

所述的冻干条件为：压强20~50Pa，温度-30℃~26℃的的冻干条件下，真空冻干24-36h。

6.权利要求5所述方法制备得到脐带间充质干细胞活性因子冻干粉。

7.权利要求3所述活性因子浓缩液与权利要求5所述活性因子冻干粉在抗衰老和皮肤美白、修复化妆品中的用途。

8.一种细胞因子化妆品，其特征在于：活性因子冻干粉制剂1瓶配1支5mL冻干粉溶媒直接用作化妆品，其中1支5mL冻干粉溶媒成分及含量如下:

烟酰胺 1~4g/100mL、高中低不同分子量透明质酸钠0.2~1.0g/100mL，甘油3~8mL/100mL，元宝枫籽油0.5~1.5mL/100mL，乳化剂1~3g/100mL。