CN113521019A - 一种间充质干细胞上清液冻干制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞上清液冻干制剂及其制备方法。本发明以右旋糖酐40作为冷冻保护剂与间充质干细胞培养上清液混合，滤膜过滤除菌后依次进行特定的预冻、升华干燥和解析干燥步骤。与常规制备方法相比，本发明所述制备方法具有操作简单、成本低、安全有效的特点，制得的冻干制剂能够保持良好的活性、质量稳定，便于运输，能常温存储且有效期长。

Description

一种间充质干细胞上清液冻干制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞上清液冻干制剂及其制备方法
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells)MSCs是一类来源于早期中胚层，具有高度自我更新和多向分化能力的一类多能干细胞，由于其良好的自我分化、免疫调节和强大的抗炎能力，在临床治疗方面越来越多的受到专家的重视。MSCs培养液中含有大量的分泌因子，如细胞外囊泡(MSC-EV)即细胞外泌体可以分泌多种蛋白，比如生长因子和细胞因子等。这些蛋白对于控制感染、促进伤口愈合、抑制瘢痕形成具有显著功效。此效果已得到国内外广泛认同。目前国内外在储存细胞外囊泡的技术上还采用冷冻方法，以保持蛋白质活性。这无疑对产品的储藏、运送、使用都提出很高的要求，使产品的价格明显提高。
低温干燥的方法有效地防止了制品理化及生物特性的改变，对生物组织和细胞结构和特征的损伤较小，使其快速进入休眠状态，有效保护了许多热敏性药物生物制品有效成份的稳定性。如蛋白质、微生物类不会发生变性和丢失其生物活性；冻干制品在干燥后形态疏松、性状基本不发生改变，加水后能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性。由于干燥在真空条件下进行，对于一些易氧化的物质具有很好的保护作用。制品经过冻干后水份含量非常低，使制品的质量稳定性提高，污染变质的机会减小，这不仅方便了运输还延长了制品的有效期。然而，目前的上清液冷藏和冷冻方法需要的成本高，环境受限，物流要求极为严格，造成产品无法广泛使用，且价格昂贵。因此，极有必要提供一种质量稳定、便于运输、能常温存储且有效期长、成本较低的间充质干细胞上清液冻存工艺及冻干产品。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种细胞上清液冻干制剂及其制备方法。本发明制备方法具有操作简单、成本低、安全有效的特点，制得的冻干制剂能够保持良好的活性、质量稳定，便于运输，能常温存储且有效期长。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种间充质干细胞上清液冻干制剂的制备方法，包括：
将右旋糖酐40和第一注射用水混合，60-80℃搅拌溶解，加入第二注射用水混合，得混合液A；
将所述混合液A降至10～20℃，加入间充质干细胞上清液和第三注射用水，获得混合液B；
所述混合液B经滤膜过滤、分装后，依次经预冻、升华干燥和解析干燥，获得间充质干细胞上清液冻干制剂；
所述预冻为：将导热油降温设定为0.5-1.5h由+20℃～+25℃降至-8℃～-11℃后，保持维持0.6-1.5h；继续将导热油设定为0.3-1h由-8℃～-11℃降至-25℃～-28℃后，保持维持0.6-1h；再将导热油设定为0.1h降至预冻终点-45℃，保持维持1-2h；
所述升华干燥：1-2h由-45℃升温至-10℃，保持16-20h；0.3-0.5h由-10℃升温0℃，保持1-1.5h；升华干燥过程保持真空度0.1-0.15bar；
所述解析干燥为：0.3-0.5h由10℃升温至20℃，保持1-1.5h。
本发明中，将右旋糖酐40和第一注射用水混合，60-80℃搅拌溶解。其中，所述搅拌溶解的温度具体可为60℃、65℃、70℃、75℃、80℃；所述搅拌溶解的时间为40～60min，具体可为40min、45min、50min、55min、60min。
本发明中，将所述混合液A降至10～20℃，加入间充质干细胞上清液和第三注射用水，获得混合液B。其中，将所述混合液A降至10℃、15℃或20℃时，加入间充质干细胞上清液和第三注射用水，获得混合液B。
本发明中，所述细胞上清液占所述混合液B的体积百分比为60vol％；所述第一注射用水、第二注射用水和第三次注射用水的体积比为8:2:0-0.5。
一些具体实施例中，第三注射用水的体积视间充质干细胞上清液的体积而定，即加入间充质干细胞上清液之后，再添加第三次注射用水，使体系总体积达2.5L。如果混合液B中加入间充质干细胞上清液之后体积达2.5L，则无需添加第三注射用水，即第三注射用水的体积为0。
本发明制备方法中，所述右旋糖酐为右旋糖酐40，所述混合液B中，所述右旋糖酐40的浓度为40～80mg/ml，即每1ml混合液B中，右旋糖酐40的添加量为40～80mg，具体可为40mg、50mg、60mg、70mg、80mg。
本发明中，所述间充质干细胞培养上清液为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或胚胎间充质干细胞的培养上清液。一些具体实施例中，所述间充质干细胞培养上清液为脐带间充质干细胞培养上清液。
本发明中，所述间充质干细胞培养上清液的制备方法为：
步骤1、传到第四代的脐带间充质干细胞在DMEM培养基中培养，其中含10ngml- 1bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和10％FBS(胎牛血清)，从中提取外泌体，高速离心120,000×g,在0℃-4℃下离心一夜。
步骤2、当胚胎干细胞达到70％-90％融合的时候，将其在DMEM中培养，其中含有不含外泌体的2％FBS，培养20-28小时。
步骤3、收集培养基，以300×g在0℃-4℃下离心10分钟使细胞呈颗粒。
步骤4、收集上清液，以16,500×g(OptimaTM L-100XPultracentrifuge；
BeckmanCoulter,PaloAlto,CA,USA)在4℃下离心20分钟。
步骤5、通过0.2μm过滤装置移除细胞碎片。培养液是有条件设置(脐带间充质干细胞条件培养基)
步骤6、滤液以120,000×g在4摄氏度下离心90分钟。
步骤7、外泌体悬浮于磷酸盐缓冲液中，于-80℃冰箱保存。
本发明具体实施例中，间充质干细胞的上清液为实验室自行配制，按照以上方法配制。
一些实施方案中，所述滤膜过滤步骤中，滤膜的孔径为0.22um。
一些实施方案中，冻干工艺中：
所述预冻为：将导热油降温设定为0.5h由+25℃降-8℃后，保持维持0.6h；继续将导热油设定为0.3h由-8℃降至-25℃后，保持维持0.6h；再将导热油设定为0.1h由-25℃降至预冻终点-45℃，保持维持1.5h；
所述升华干燥：2h由-45℃升温至-10℃，保持16小时；0.5h由-10℃升温0℃，保持1小时；升华干燥过程保持真空度0.1bar；
所述解析干燥为：0.5h由10℃升温至20℃，保持1小时。
本发明提供的制备方法中，在所述解析干燥之后还包括抽真空、压塞的步骤。
进一步的，所述抽真空的时间为0.5h。
本发明还提供了由本发明制备方法制得的间充质干细胞上清液冻干制剂。
本发明以右旋糖酐40作为冷冻保护剂与细胞上清液混合，滤膜过滤除菌后依次进行特定的预冻、升华干燥和解析干燥步骤。本发明所述制备方法能够更加完好地维持原液的浓度和质量，且不会随着时间而发生变化，比常规冻干法更稳定，具有操作简单、成本低、安全有效的特点。同时，制得的冻干制剂能够保持良好的活性、质量稳定，便于运输，能常温存储且有效期长。
具体实施方式
本发明提供了一种细胞上清液冻干制剂及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
细胞培养上清液：细胞培养传代过程中，过滤细胞而留下的液体部分。内含大量细胞因子：HGF,VEGF,TGF-B,EGF.KGE,IGF,PDGF等。
MSC-EV:细胞外囊泡，是细胞培养过程中外泌到培养液中的物质，又称为细胞外泌体。广泛存在于细胞培养上清液中。
DMEM:脐带间充质干细胞条件培养基。
冻干工艺：将需要干燥的制品在低温下使其所含的水分冻结，然后在真空的环境下干燥，让水分由固体状态直接升华为水蒸气并从制品中排除而使制品活性干燥。
共(熔)晶点前保温预冻：本发明通过“共(熔)晶点温度前的保温预冻技术”，即制品在共(熔)晶点温度前2℃左右，保持预冻一段时间使制品在几乎一致的某个温度迅速降温至共(熔)晶点以下，这时处方中各组分在几乎相同的初始条件下由液态变成固态且冻结状态几乎一致。最大限度的降低了不同冻结状态的药品在升华后形成的产品质量差异。
共(熔)晶点温度：为溶液完全冻结固化的最高温度。对于溶液来说，冻结固化点就是熔化开始点，所以也称为共熔点温度。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(一)、处方：
每25000ml注射液包括以下组分：
脐带间充质干细胞培养上清液 15000ml
右旋糖酐40 1500g
注射用水 定容至25000ml(10000支)
注：(1)脐带间充质干细胞培养上清液(原料)
(2)右旋糖酐40(辅料-冻干赋形剂、保护剂)
(3)注射用水(溶剂)
(二)药液配制工艺过程
a.取约8000ml的常温注射用水于烧杯中，加入处方量的右旋糖酐40，加热至70℃后，充分搅拌使其完全溶解，0.2um滤膜过滤后加注射用水定容至10000ml，将上述药液降至15℃后再加入处方量的脐带间充质干细胞培养上清液，搅拌使其充分互溶后用常温注射用水定容至25000ml。
b.灌装：装量控制在2.5ml±0.01ml/支，半加塞
c.冻干：入箱，启动设备冻干。
(三)、冻干工艺过程
1.冻干
1.1产品预冻：导热油降温设定为0.5h由+25℃降至-8℃后，保持维持0.6h，继续将导热油设定为0.3h由-8℃降至-25℃后，保持维持0.6h，再将导热油设定为0.1h由-25℃降至预冻终点-45℃，保持维持1.5h。
1.2一次升华干燥：升华过程中导热油升温设定为2h由-45℃升至-10℃后保持16h，再将导热油升温设定为0.5h由-10℃升至0℃后保持1h，继续将导热油升温设定为0.5h由0℃升至10℃后保持1h，升华过程保持前箱掺入无菌空气，干燥箱真空度控制在0.10mbar。
1.3解析干燥、压塞：
到达一次升华终点后，导热油升温设定为0.5h由+10℃升至+20℃/h，当导热油温度达到+20℃时保持1h，导热油温度不变，关闭掺气阀保持0.5h后压塞，出箱。
实施例2～8
组成成分、工艺过程同实施例1；只有冻干工艺不同，具体参见表1：
表1.实施例2～8的冻干工艺汇总表
Figure BDA0003182061170000061
Figure BDA0003182061170000071
Figure BDA0003182061170000081
对比例1～6
冻干工艺与实施例1不同，配方组成及其他步骤参数同实施例1，具体参见表2：
表2对比例1～6的冻干工艺汇总表
Figure BDA0003182061170000082
Figure BDA0003182061170000091
测试例稳定性测试
分析：
统计学方法：本研究应用SPSS 22.0软件处理数据。计量资料用
Figure BDA0003182061170000093
表示，采用t检验。P＜0.05表示差异有统计意义。
分组：分为原液组、常规冻干组(常规组)、实验组，每组各50例进行数据分析。设备采用国际上先进的ZETAVIEW laser Scattering Microscopy进行检测分析，分别在溶解20分钟、溶解24小时进行效价分析。结果见表3～8。
表3.实验组与原液组溶解20分钟后效果对照分析
Figure BDA0003182061170000092
Figure BDA0003182061170000101
表4.实验组与原液组溶解24小时后效果对照分析
组别 样本数 粒径 浓度
原液 50 171.9±15.8 1.56×10<sup>9</sup>±0.13×10<sup>9</sup>
试验组 50 125.7±11.1 2.59×10<sup>10</sup>±0.14×10<sup>10</sup>
t值 - 12.72 0.11×10<sup>9</sup>
p值 - ＜0.05 ＜0.05
表5.常规组与原液组溶解20分钟后效果对照分析
组别 样本数 粒径 浓度
原液 50 125.2±12.7 2.73×10<sup>10</sup>±0.21×10<sup>10</sup>
常规组 50 129.4±12.1 2.54×10<sup>10</sup>±0.26×10<sup>10</sup>
t值 - 9.62 0.25×10<sup>10</sup>
p值 - ＞0.05 ＞0.05
表6.常规组与原液组溶解24小时后效果对照分析
组别 样本数 粒径 浓度
原液 50 171.9±15.8 1.56×10<sup>9</sup>±0.13×10<sup>9</sup>
常规组 50 158.4±11.9 5.88×10<sup>9</sup>±0.28×10<sup>9</sup>
t值 - 10.25 0.57×10<sup>9</sup>
p值 - ＜0.05 ＜0.05
表7.原液溶解20分钟和溶解24小时后效果对照分析
溶解时间 样本数 粒径 浓度
20min 50 125.2±12.7 2.73×10<sup>10</sup>±0.21×10<sup>10</sup>
24h 50 171.9±15.8 1.56×10<sup>9</sup>±0.13×10<sup>9</sup>
t值 - 12.15 0.18×10<sup>9</sup>
p值 - ＜0.05 ＜0.05
表8.实验组与常规组冻干24小时后效果对照分析
Figure BDA0003182061170000102
Figure BDA0003182061170000111
结果显示，实验组与原液溶解20分钟进行效果对照，二者无论是在粒径、外泌体浓度上都无显著差距(p＞0.05)，见表3；实验组与原液溶解24小时进行效果对照，二者的粒径和外泌体浓度均有显著差异(p＜0.05)，见表4；常规组与原液溶解20分钟进行效果对照，二者无论是在粒径、外泌体浓度上都无显著差距(p＞0.05)，见表5；实验组与原液溶解24小时进行效果对照，二者的粒径和外泌体浓度均有显著差异(p＜0.05)，见表6；原液溶解20分钟和24小时后效果进行分析，二者在粒径和外泌体浓度均有显著差异(p＜0.05)，见表7；实验组与常规组冻干24小时后效果对照分析，二者的粒径和外泌体浓度均有显著差异(p＜0.05)，见表8。
以上结果表明，原液随着溶解的时间越长，外泌体在粒径大小和浓度上均会发生变化，且变化均是会导致效果下降。常规方法冻干，虽能较好地实现性质稳定，但与本实验方法尚有差距，本发明制备工艺能够更加完好地维持原液的浓度和质量，且不会随着时间而发生变化，比常规冻干法更稳定。此方法无论在工艺上，还是操作流程上，实现了简单，高效，经济实用，容易推广和使用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞上清液冻干制剂的制备方法，其特征在于，包括：
将右旋糖酐40和第一注射用水混合，60-80℃搅拌溶解，加入第二注射用水混合，得混合液A；
将所述混合液A降至10～20℃，加入间充质干细胞上清液和第三注射用水，获得混合液B；
所述混合液B经滤膜过滤、分装后，依次经预冻、升华干燥和解析干燥，获得间充质干细胞上清液冻干制剂；
所述预冻为：将导热油降温设定为0.5-1.5h由+20℃～+25℃降至-8℃～-11℃后，保持维持0.6-1.5h；继续将导热油设定为0.3-1h由-8℃～-11℃降至-25℃～-28℃后，保持维持0.6-1h；再将导热油设定为0.1h降至预冻终点-45℃，保持维持1-2h；
所述升华干燥：1-2h由-45℃升温至-10℃，保持16-20h；0.3-0.5h由-10℃升温0℃，保持1-1.5h；升华干燥过程保持真空度0.1-0.15bar；
所述解析干燥为：0.3-0.5h由10℃升温至20℃，保持1-1.5h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述所述细胞上清液占所述混合液B的体积百分比为60vol％；所述第一注射用水、第二注射用水和第三次注射用水的体积比为8:2:0-0.5。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述右旋糖酐为右旋糖酐40，所述混合液B中，右旋糖酐40的浓度为40～80mg/ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞上清液为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或胚胎间充质干细胞的培养上清液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞培养上清液的制备方法为：间充质干细胞在DMEM培养基中培养到第四代，经梯度离心，收集上清液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.22um。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述预冻为：将导热油降温设定为0.5h由+25℃降-8℃后，保持维持0.6h，0.3h由-8℃降至-25℃后，保持维持0.6h；0.1h由-25℃降至预冻终点-45℃，保持维持1.5h；
所述升华干燥：2h由-45℃升温至-10℃，保持16小时；0.5h由-10℃升温0℃，保持1小时；升华干燥过程保持真空度0.1bar；
所述解析干燥为：0.5h由10℃升温至20℃，保持1小时。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，在所述解析干燥之后还包括抽真空、压塞的步骤。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述抽真空的时间为0.5h。
10.权利要求1～9任一项所述制备方法制得的间充质干细胞上清液冻干制剂。
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