CN110331162A - 一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞及其制备方法和应用，提供一种稳定传代并带有人源主动脉夹层特异性遗传信息的多能干细胞系，从而可获得体外细胞模型模拟患者的部分病理状态并研究疾病的发生发展过程的细胞及分子机制，本发明公开一种特异性诱导多能干细胞的制备方法，其方法利用episomal质粒电转方法将转录因子直接转入细胞，操作简便，节省时间，为体外疾病细胞模型的建立创造了良好的条件，进一步提供了由动脉夹层特异性诱导多能干细胞系定向分化为具有AD病人特异性遗传信息的平滑肌细胞，以建立一个稳定的体外平滑肌细胞AD疾病模型，以及在制备人主动脉夹层细胞模型中的应用，用以应用在AD相关病理机制研究以及个体化药物筛选。

Description

一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及到一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞及其制备方法和应用。
背景技术
主动脉夹层(aortic dissection，AD)是指由于多种自身或外界因素使主动脉内膜发生急性损伤，高速血流由撕裂口进入主动脉内膜与中膜之间，从而形成一个假腔，随着血液的不断流入，假腔会沿着主动脉纵轴快速延伸，严重者可进展到腹主动脉及髂总动脉，随着血液的灌入假腔内压力逐渐增加，最终会导致主动脉壁破裂。主动脉夹层是一种严重危及人类生命的心血管急症，其发病急剧，具有高发病率及病死率，若未及时救治，急性主动脉夹层发生后48h内，病死率高达50％～68％，3个月内病死率可达90％。流行病学研究显示发病率约为3-5/10万人每年(Nienaber，CA,et al.Nature reviews disease primers,2016(2)：1-17)。主动脉夹层的发病机制十分复杂，虽然免疫炎症、遗传因素、高血压、氧化应激等多个方面因素可能参与，但迄今为止，关于AD疾病发生的分子机制并未完全阐明。
目前，主动脉夹层的研究主要在动物水平上进行，由于种属差异，动物模型与人类在各种生理系统上存在很大差异，很多研究结果不能直接应用于人类疾病。因此，如何建立一个“人源性”体外细胞模型对于AD等心血管疾病的研究十分重要。
人诱导多能干细胞(human induced Pluripotent Stem Cells，hiPSCs)的出现为转化医学和再生医学提供了强大的动力和革命性的模式转变，也为人类遗传性疾病的机制研究提供大量细胞来源。hiPSCs具有无限自我更新能力和多能性，可以分化成为人体内任意一种细胞，如平滑肌细胞、心肌细胞等，因而被广泛地应用于心血管疾病的研究中，在疾病模型建立、疾病分子机制研究以及新药研发等方面具有巨大的潜在价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的提供一种稳定传代并带有人源主动脉夹层特异性遗传信息的多能干细胞系及其制备方法及应用。
为实现上述目的，本发明提供一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采集人源性胸主动脉夹层手术丢弃的主动脉组织；
步骤二、将步骤一中的主动脉组织剪碎，经小组织块贴壁培养获得原代细胞；步骤三、将含有OCT4、KLF4、SOX2、L-MYC、Lin28、shp53基因的4个episomal 质粒经nucleofector电转入原代细胞，培养3-7天后将细胞转入预先铺有Matrigel 的培养皿培养，加入重编程培养液隔天换液培养，在胚胎干细胞样克隆长出后用多能干细胞培养液(TeSRE8，stemcelltechnologies)，每天换液培养，挑取克隆扩增，建立动脉夹层iPSC细胞系。
本发明的人源性胸主动脉夹层手术丢弃的主动脉组织来源于温州医科大学第一附属医院的一例48岁男性主动脉夹层病患血管替换手术丢弃的主动脉组织。
在本发明的另一方面，提供一种上述制备方法制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系。
制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系生长旺盛，细胞较小，核质比高，细胞核显著，细胞呈集落状生长，紧密堆积在一起，无明显细胞界限，整个克隆边缘平整光滑，细胞经过冻存复苏后仍具有良好的活力；上述细胞系传代稳定，生长状态良好，已能永生化。
在一个优选例中，本发明提供的一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系为：其于2019年4月17日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，中国典型培养物保藏中心位于：中国武汉，邮编：430072，培养物名称为人动脉夹层患者来源的诱导多能干细胞TAD-hiPSC2-2，保藏编号为CCTCC NO：C201955。
在本发明的另一方面，提供一种主动脉夹层平滑肌细胞模型，该主动脉夹层平滑肌细胞模型由上述保藏的诱导多能干细胞分化形成的平滑肌细胞。
在本发明的另一方面，提供一种主动脉夹层平滑肌细胞模型的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将动脉夹层iPSC细胞系接种至TeSR E8培养基中，培养一天；
步骤二、去除陈旧培养基，加入含1μM CP21R7和25ng/ml BMP4的N2B27培养基，培养3天；
步骤三、去除陈旧培养基，加入3ml含10ng/ml的PDGF-BB和2ng/ml的ActivinA 的N2B27培养基，培养两天，每天换液；
步骤四、将步骤三分化得到的细胞铺板接种至培养皿，并进行SMC marker特异性鉴定呈阳性的则为成功的主动脉夹层平滑肌细胞模型。
在本发明的另一方面，一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系在筛选或评估治疗主动脉夹层药物或者主动脉夹层检测试剂盒中的应用。
本发明提供一种稳定传代并带有人源主动脉夹层特异性遗传信息的多能干细胞系，从而可获得体外细胞模型模拟患者的部分病理状态并研究疾病的发生发展过程的细胞及分子机制，本发明公开一种特异性诱导多能干细胞的制备方法，其方法利用episomal质粒电转方法将转录因子直接转入细胞，操作简便，节省时间，为体外疾病细胞模型的建立创造了良好的条件，进一步提供了由主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系定向分化为具有AD病人特异性遗传信息的平滑肌细胞，以建立一个稳定的体外平滑肌细胞AD疾病模型，以及在制备人主动脉夹层细胞模型中的应用，用以应用在AD相关病理机制研究以及个体化药物筛选。
保藏信息
2019年4月17日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，中国典型培养物保藏中心的地址位于：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，武汉大学保藏中心，邮编：430072，培养物名称为人动脉夹层患者来源的诱导多能干细胞 TAD-hiPSC 2-2，保藏编号为CCTCC NO：C201955。
附图说明
图1为本发明从患者主动脉组织获取的细胞电转前的原代培养细胞；
图2为本发明主动脉夹层特异性诱导多能干细胞重编程过程细胞形态图，其中2(a)为电转后6天的原代细胞相差光学显微镜图，尚无胚胎干细胞样克隆出现；2(b)为原代细胞电转后培养13天时相差光学显微镜图，部分细胞聚集成团，形成胚胎干细胞样小克隆；2(c)为电转后培养19天时相差光学显微镜图，部分细胞聚集成团，形成较大胚胎干细胞样克隆；2(d)为将大克隆挑到12孔板中培养约5天时相差光学显微镜图，此时主动脉夹层患者特异诱导多能干细胞已初步建立；
图3为本发明制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞相差光学显微镜图下的形态图，细胞较小，排列致密呈团块状；
图4为本发明制备的动脉夹层患者特异性诱导多能干细胞的碱性磷酸酶染色结果图；
图5为本发明制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞的多能性免疫荧光鉴定结果，其中5(a)为OCT4鉴定结果；5(b)为SOX2鉴定结果；5(c) 为TRA-1-61鉴定结果；5(d)为TRA-1-81鉴定结果；
图6为本发明制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞的染色体核型(keryotype)分析结果。
图7a、b、c分别为本发明制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞诱导分化的血管平滑肌细胞特异性标志物a-SMA，SM22a，CNN1免疫荧光染色结果。
图8为本发明制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞诱导分化的血管平滑肌细胞在不同浓度TGF-b作用下胶原(Collagen1A1)表达结果。
具体实施方式
下面将结合附图以及实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明。
本发明提供一种永生化的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞，该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系。以下通过对主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系的构建、细胞形态特征、多能性测定、诱导分化来做一详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本实施方式文本为了使得书面整洁，将部分名称用缩写代替，本文本中出现缩写指代的中文名称如下表所示
实施例1主动脉夹层特异性诱导多能干细胞的制备
1、主动脉夹层特异性诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)取温州医科大学第一附属医院的一例48岁男性主动脉夹层病患血管替换手术丢弃的主动脉组织，用DPBS润洗，冲洗血液等杂质，吸走DPBS，然后用DMEM润洗，吸走DMEM，加入DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基约 1ml，将组织块浸没即可，用剪刀把组织块剪成1mm2大小的小块，贴附于培养瓶上壁，将小块尽量分开；
(2)加入3ml DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，置于37℃培养箱3～5h 后反转培养瓶，等待组织块贴壁，切勿吹动组织块，1周后可以观察到细胞迁移出组织块，贴壁生长。而后每隔1天换液。当培养皿中原代细胞长满后获得P0 代原代细胞，冻存保种并传代扩增培养；
(3)待原代细胞长满后，用0.05％TE消化成单个细胞，计数1x10^6个细胞进行离心(800rpm，10min)，吸弃上清，用加有四种质粒(包含转OCT4、KLF4、 SOX2、L-MYC、lin28、shp53基因或小RNA)的Lonza电转液重悬，然后使用特定程序进行电转，之后加入约500ul培养液重悬细胞，然后将细胞悬液缓慢分散接种于预热过的DMEM+10％FBS+1％青链霉素的培养基，每天换液，第6天将2x10^5个细胞传入预先铺有Matrigel的培养皿中，重编程培养液(Reproeasy(赛贝):(DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基)＝1:1)，加入Y27632以利于其贴壁，培养液：Y27632＝1000：1。其后用Reproeasy培养液(赛贝)，待出现小细胞克隆后，将培养液换为PSCeasy(赛贝)。出现较大克隆后，将单个克隆挑取到用预先铺有Matrigel的12孔板中，此时细胞为TAD-iPSC P0代；选择细胞致密、外周没有分化的克隆传代到预先铺有Matrigel的35mm2培养皿中，此时细胞为 P1代；选择细胞致密、外周没有分化的3个克隆传代到用预先铺有Matrigel的 35mm2板中，此时细胞为P2代，在培养皿中一直将细胞传代至P20代并每1代都进行保种。
其原代培养细胞如图1所示，主动脉夹层特异性诱导多能干细胞在制备过程中的形态如图2(a)、(b)、(c)、(d)所示，在电转培养至5天时部分细胞初步发生形态改变，培养13天时部分细胞聚集成团，形成小克隆，培养至19天时，部分细胞聚集成团，形成较大克隆。
最终克隆形成的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞如图3所示，干细胞原代细胞系和子代细胞系的细胞形态稳定性高，均表现为细胞较小，核质比高，细胞核显著，细胞呈集落状生长，紧密堆积在一起形成克隆，克隆内细胞无明显细胞界限。
2、主动脉夹层特异性诱导多能干细胞的多能性鉴定
对制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞进行OCT4、SOX2、TRA-1-60、 TRA-1-81免疫荧光染色，其结果如图5(a-d)所示，并进行碱性磷酸酶染色，其结果如图4所示，其结果均显示为阳性，其OCT4、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81 多能基因均有表达，证明其具备多能性。
3、染色体的核型分析
将培养中的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞，置于4℃下12小时后，加入秋水仙素，使秋水仙素终浓度为0.4μg/ml，再于37℃孵箱中继续培养10小时，采集分裂中期的细胞，用Carnoy固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)进行固定，然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemas染色液染色，于显微镜下计数染色体数，结果见图6。图6可见，主动脉夹层特异性诱导多能干细胞连续传代后，染色体仍保持人源性细胞染色体的特征，表现为二倍体核型，细胞染色体数目为 46，染色体数目和结构符合正常人体的遗传学特征。经过鉴定实施例1制备的主动脉夹层iPSC具备多能干细胞的特征，并且其增殖能力强，具有分化潜能。
实施例2主动脉夹层特异性诱导多能干细胞在制备主动脉夹层平滑肌细胞模型的应用
通过中胚层介导的平滑肌细胞定向分化
将实施例1中制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞按照5x105/皿接种至60mm2板中，在TeSR E8培养基中培养一天，第2天进行分化，吸尽陈旧培养基，加入含1μM CP21R7和25ug/ml BMP4的N2B27培养基，培养三天不换液，分化第4天更换成3ml含10ng/ml的PDGF-BB和2ng/ml的ActivinA的N2B27 培养基，分化第5天换液加入新鲜3ml含10ng/ml的PDGFBB和2ng/ml的 ActivinA的N2B27培养基，第6天细胞进行重新铺板，将细胞全部接种到用0.1％gelatin铺板的60mm2板上，对产生的具有动脉夹层特异性遗传信息的平滑肌细胞进行培养扩增。
实施例3主动脉夹层平滑肌细胞的表型鉴定
将实施例2中制备的主动脉夹层平滑肌细胞通过对平滑肌特异性标志物α- 平滑肌肌动蛋白α-SMA、细胞骨架相关蛋白SM22α和钙调节蛋白CNN1进行平滑肌细胞免疫染色鉴定诱导获得的细胞为平滑肌细胞，其分别采用Sigma公司的α-SMA抗体、Abcam公司的SM22α抗体以及Sigma公司的CNN1抗体进行免疫染色鉴定，其结果如图7a、b、c所示，α-SMA、SM22α、CNN1均有表达。
实施例4主动脉夹层平滑肌细胞的功能鉴定
主动脉夹层平滑肌细胞生长到70％左右时，换为含0.2％胎牛血清的DMEMF-12培养液进行饥饿培养一天，第二天继续分别用0n/ml、5ng/ml和 10ng/ml TGF-β处理主动脉夹层平滑肌细胞，如图8所示，可观察到主动脉夹层平滑肌细胞中COL1A1的表达随TGF-β刺激的加强而明显增加。
本发明制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞在诱导分化技术下可以分化为主动脉夹层平滑肌细胞，制备的主动脉夹层平滑肌细胞在细胞模型的应用上，能够在在细胞水平上用于AD相关病理机制的基础研究，并可用于AD疾病治疗及预防药物的研究。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、采集人源性胸主动脉夹层手术丢弃的主动脉组织；
步骤二、将步骤一中的主动脉组织剪碎贴壁培养获得原代细胞；
步骤三、将含有OCT4、KLF4、SOX2、L-MYC、Lin28、shp53基因的4个episomal质粒经nucleofector电转入原代细胞，培养3-7天后转入预先铺有Matrigel的培养皿培养，加入重编程培养液隔天换液培养，在克隆长出后用TeSR E8每天换液培养，挑取克隆扩增，建立动脉夹层iPSC细胞系。
2.一种根据权利要求1所述制备方法制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系。
3.根据权利要求2所述的一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系，其特征在于，其于2019年4月17日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，培养物名称为人主动脉夹层患者来源的多能干细胞TAD-hiPSC 2-2，保藏编号为CCTCC NO：C201955。
4.一种主动脉夹层平滑肌细胞模型，其特征在于，由权利要求3所述的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系诱导分化的平滑肌细胞。
5.根据权利要求4所述的一种主动脉夹层平滑肌细胞模型制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系接种至TeSR E8培养基中，培养一天；
步骤二、去除陈旧培养基，加入含1μM CP21R7和25ng/ml BMP4的N2B27培养基，培养3天；
步骤三、去除陈旧培养基，加入3ml含10ng/ml的PDGF-BB和2ng/ml的ActivinA的N2B27培养基，培养两天，每天换液；
步骤四、将步骤三分化得到的细胞铺板接种至培养皿，并进行SMC marker特异性鉴定，呈阳性的则为成功的主动脉夹层平滑肌细胞模型。
6.如权利要求2或3所述的一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系在筛选或评估治疗主动脉夹层药物或者主动脉夹层检测试剂盒中的应用。
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