MX2012001274A - Metodo para producir un polipeptido o virus de interes en un cultivo de celula continuo. - Google Patents

Abstract

Aquí se describe un sistema de cultivo de célula continuo de tipo quimiostato que combina ciertas ventajas de sistemas abiertos de perfusión y sistemas abiertos de quimiostato para mejorar el cultivo de células de mamífero, por ejemplo, células genéticamente modificadas, en particular en medios libres de suero o químicamente definidos. El sistema de cultivo continuo aquí descrito involucra cultivar células de mamífero en un sistema de cultivo de célula continuo, el cual comprende un dispositivo de retención de célula, en donde el sistema de cultivo de célula tiene una velocidad de dilución (D) de menos de aproximadamente 2 d-1, y una densidad de célula de menos de aproximadamente 2x107 célula/ml. También aquí se describe un método para producir un polipéptido y/o virus de interés en un cultivo de célula continuo, el método comprende cultivar células de mamífero que expresan el polipéptido y/o virus de interés en un sistema de cultivo de célula continuo, el cual comprende un dispositivo de retención de célula, en donde el sistema de cultivo de célula tiene una velocidad de dilución (D) de menos de aproximadamente 2d-1, y una densidad de célula de menos de aproximadamente 2x107 célula/ml; y recuperar el polipéptido y/o el virus de interés a partir del medio del sistema de cultivo de célula.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR UN POLIPÉPTIDO O VIRUS DE INTERÉS EN UN CULTIVO DE CELULAS CONTINUO Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos con núm. 61/230,313, presentada el 31 de julio de 2009, la cual se incorpora por este medio como referencia en su totalidad, y de cuya solicitud reclamamos prioridad.

Campo de la invención La presente invención se refiere a una estrategia de cultivo celular continuo para la producción de polipéptidos o virus de interés en cultivo de células de mamíferos. La estrategia de cultivo celular continuo que se describe en la presente combina las ventajas de las tecnologías de cultivo en perfusión y en quimiostato.

Antecedentes de la invención La capacidad de producir un virus o polipéptido de interés es cada vez más importante para la industria de la biotecnología. Durante las dos últimas décadas, los avances en biotecnología despertaron el interés de numerosos polipéptidos y virus que tienen un uso terapéutico potencial, como vacunas y productos farmacéuticos. La producción a gran escala generalmente implica la producción recombinante del virus o polipéptido de interés, por ejemplo, en células de bacterias, levaduras, insectos, mamíferos, o de otro tipo. La producción de polipéptidos o virus de interés en cultivos de mam íferos , en particular, tiene ventajas sobre la producción en bacterias u otros hospederos microbianos inferiores debido a la capacidad de las células de mam íferos para los procesos post-traducción para estructuras complejas de proteínas, a través, por ejemplo, del plegado y g licosilación dependientes de disulfuro.

Las célu las de mam íferos generalmente se propagan in vitro en uno de dos modos : como células independientes de anclaje que crecen libremente en suspensión en todo el volumen del cultivo , o como células dependientes de anclaje q ue requieren adhesión a un sustrato sólido para su propagación (es decir, creci m iento cel u la r de ti po monocapa). Se han desarrollado sistemas microportadores para dar cabida a ambos tipos de crecimiento . Por ejemplo, célu las dependientes de anclaje se pueden propagar en sistemas de m icroportadores que comprenden pequeñas partículas sólidas que se suspenden en el medio de cultivo mediante agitación lenta . Este sistema permite que las células depend ientes de anclaje se fijen a la superficie de las partículas en suspensión , y crezcan hasta la confluencia , m ientras que los microportadores permanecen suspendidos en el med io de cultivo. Por otra parte, se pueden usar microportadores macroporosos para contener células independientes de anclaje en biorreactores, por ejemplo, media nte la adhesión inespecífica de las células a la superficie de tales microportadores. Los cultivos de microportadores en suspensión ya sea de células independientes de anclaje o de células dependientes de anclaje son el med io que más se usa para la producción a gran escala de células y productos celulares.

Los cultivos en suspensión a gran escala pueden funcionar en un sistema cerrado, por ejemplo, como los sistemas cerrados por lote o lote alimentado, que son más sencillos de funcionar y expandir que los sistemas abiertos. Por lo general , en un sistema cerrado, las células, productos y/o productos de desecho no se eliminan (aunque se puede adicionar aire (por ejemplo, el oxígeno) y eliminar C02 por aireación). El perfil típico de crecimiento visto en los sistemas de crecimiento por lote involucra una fase de latencia, seguida de una fase exponencial, una fase estacionaria y una fase de declive. En tales sistemas de lotes, el entorno está ca m bi a ndo co nti n ua me nte , ya que los n utrie ntes se agota n y se acumulan metabolitos. En un sistema de lotes alimentados, los nutrientes esenciales se introducen continuamente en el sistema para prolongar el ciclo de crecimiento, aunque las células, productos, subproductos y productos de desecho, incluyendo los metabolitos tóxicos, no se eliminan. En consecuencia, la producción de un polipéptido o virus de interés mediante sistemas de lote o lote alimentado está limitada por la acumulación de células y sustancias nocivas, tales como metabolitos tóxicos.

Los cultivos en suspensión a gran escala también pueden funcionar en un sistema abierto, por ejemplo, un sistema de perfusión o un sistema de quimiostato. En un sistema de perfusión, un medio fresco se perfunde a través del cultivo, mientras que las células se conservan con una variedad de dispositivos de retención celular. Los tipos de dispositivos de retención celular incluyen, por ejemplo, microportadores, filtros giratorios de malla fina, fibras huecas, filtros de membrana de placa plana, tubos de sedimentación , dispositivos ultrasónicos de retención celular, y similares. Por lo general, los cultivos en perfusión están diseñados para aumentar las densidades celulares a un máximo, con dispositivos de retención celular que se diseñan y funcionan para tener una velocidad de retención celular de >90%. Tales cultivos suelen alcanzar densidades celulares de >2X1 07, a las cuales hay que suministrarles una alimentación de medio de cultivo celular a una velocidad de dilución mayor que aproximadamente 2.0 d'1. Sin embargo, es difícil mantener el estado estacionario del sistema debido al aumento incontrolado de la biomasa, y las condiciones de producción consistentes son difíciles de controlar y/o lograr.

Los sistemas de quimiostato funcionan con una entrada continua de medios y una salida de células y productos. En el sistema de quimiostato, no hay ningún dispositivo de retención celular, de tal manera que la concentración de células en el biorreactor y la concentración de células del sobrenadante recogido del biorreactor son sustancialmente idénticas. Típicamente, se introduce al reactor el medio de cultivo a una velocidad predeterminada y constante, lo que mantiene una baja velocidad de dilución del cultivo (por lo general 0.3 d' 1 a 0.8 d" 1). Para evitar el lavado de las células, generalmente se elige la velocidad de dilución menor que, a veces igual a, la velocidad de crecimiento específica celular máxima. Los líquidos del cultivo que contienen células, productos celulares, subproductos, residuos, etc. , se eliminan a la misma, o sustancialmente la misma velocidad. Los sistemas de quimiostato suelen proporcionar un alto grado de control, ya que los cultivos pueden equilibrarse, es decir, llegar a un estado estacionario a una velocidad de crecimiento específica equivalente a la velocidad de dilución. Este equilibrio es determinante de la concentración de las células, metabolitos, productos de desecho, productos expresados (por ejemplo, proteínas secretadas), etc. Las velocidades de crecimiento específicas en los sistemas de quimiostato suelen ser inferiores a la máxima velocidad de crecimiento debido a al menos un sustrato limitante. En algunos sistemas, sin embargo, los estados estacionarios se pueden mantener a velocidades de crecimiento máxima mediante el control y el ajuste de la biomasa, por ejemplo, en sistemas turbidostato de cultivos en quimiostato. Preferentemente, estos cultivos en quimiostato contienen una distribución homogénea de células (por ejemplo, suspensiones de células individuales) en todo el biorreactor. En comparación con el sistema de perfusión, sin embargo, el sistema de quimiostato típicamente resulta en menores densidades celulares. Por otra parte, una desventaja inherente de los sistemas de quimiostato es que la alimentación de las células no se puede controlar independientemente de la densidad celular en el sistema del biorreactor.

Los cultivos de células en suspensión para la producción de proteínas recombinantes en medio libre de suero y/o qu ímicamente definido también se limitan en que el medio libre de suero y/o químicamente definido, suele soportar velocidades de crecimiento más lentas en comparación con las células que crecen en medio que contiene suero. La disminución de las velocidades de crecimiento en el cultivo significa una disminución de la producción del polipéptido o virus de interés.

En consecuencia, se mantiene la necesidad de desarrollar sistemas de cultivo celular capaces de mantener la producción de un polipéptido o virus de interés, especialmente cultivos que se puedan mantener durante prolongados períodos de tiempo, por ejemplo, para satisfacer las demandas de aumento de la producción a bajo costo. La presente invención proporciona métodos y composiciones dirigidas a cubrir esta y otras necesidades.

Breve descripción de la i nvención En la presente se describe un cultivo celular continuo para la producción de polipéptidos y/o virus de interés en células de mamíferos, en particular, células independientes de anclaje. El método de cultivo celular continuo descrito en la presente combina las ventajas de los sistemas abiertos de perfusión y sistemas abiertos de quimiostato y permite mayor densidad celular y crecimiento celular, particularmente en los medios libres de suero o químicamente definidos. El aumento de la densidad celular y el crecimiento celular proporcionan el aumento de los rendimientos de las proteínas y/o virus de interés al tiempo que permite un mayor control sobre los parámetros del proceso.

Por consiguiente, un aspecto de la invención se refiere a un método para producir un polipéptido y/o virus de interés en un cultivo celular continuo, el método comprende cultivar células de mamíferos que expresan el polipéptido y/o virus en un sistema de cultivo celular continuo, donde el sistema de cultivo celular comprende un dispositivo de retención celular y tiene una velocidad de dilución menor que aproximadamente 2 d"1 y una densidad celular menor que aproximadamente 2X107 células/ml; y recuperar el polipéptido y/o virus de interés del medio eliminado del sistema de cultivo celular. En algunas modalidades, las células se modifican genéticamente para expresar de manera recombinante el polipéptido y/o virus de interés.

En algunas modalidades, el dispositivo de retención celular se elige para que tenga menor capacidad de retener las células que los dispositivos de retención celular típicos. En algunas modalidades, el dispositivo de retención cel u l ar prod u ce u n a velocidad de retenció n celular menor que aproximadamente 90%, menor que aproximadamente 85%, menor que aproximadamente 80%, o menor que aproximadamente 75%. En algunas modalidades, el dispositivo de retención celular comprende un microportador macroporoso, por ejemplo, una partícula a base de celulosa.

La velocidad de dilución y la densidad celular se mantienen preferentemente en valores o intervalos elegidos. En algunas modalidades, la velocidad de dilución es menor que aproximadamente 1 d"1 , por ejemplo, entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 1.0 d* 1. En algunas modalidades, la densidad celular es menor que aproximadamente 1 x1 07 células/ml. En algunas modalidades, la relación entre la velocidad de dilución y la velocidad de crecimiento específica (D/µ) del sistema de cultivo celular se mantiene en un valor o intervalo seleccionado. En algunas modalidades preferidas, el sistema de cultivo celular tiene una relación de la velocidad de dilución y la velocidad de crecimiento específica mayor que aproximadamente 1 , por ejemplo, entre aproximadamente 1 .2 y aproximadamente 5.0, o entre aproximadamente 1 .8 y aproximadamente 3. En algunas modalidades, la velocidad de crecimiento específica se mantiene entre 0.2 d"1 y 0.8 d"1.

Una ventaja de ciertas modalidades del sistema de cultivo celular continuo descrito en la presente es que el cultivo se puede mantener durante un período prolongado de tiempo. En algunas modalidades, por ejemplo, la velocidad de dilución y/o la densidad celular se mantienen durante al menos aproximadamente 80% de las veces que las células se cultivan en el sistema de cultivo celular continuo. En algunas modalidades las células se cultivan en el sistema de cultivo celular por más de 20 d ías, preferentemente más de 40 días, y con mayor preferencia, más de 50 días, por ejemplo, lo que permite una mayor producción del polipéptido y/o virus de interés, potencialmente a bajo costo.

Otra ventaja de ciertas modalidades del sistema de cultivo celular continuo es un incremento en la productividad volumétrica debido a una densidad celular superior, en comparación con un cultivo de quimiostato típico. Por ejemplo, en modalidades preferidas particulares, la productividad volumétrica aumenta en 70%, 90%, o más. Todavía otra ventaja de ciertas modalidades del sistema de cultivo celular continuo es una actividad específica mejorada de la proteína que se recupera, debido, por ejemplo, al tiempo de permanencia reducido en la unidad de cultivo, lo cual puede tener un efecto beneficioso en la estabilidad, estructura, y/o función de la proteína.

Otra de las ventajas de ciertas modalidades del sistema de cultivo celular continuo descrito en la presente es que el sistema es susceptible de expandirse para producciones a gran escala. Esto es mediante el aumento de la densidad celular y/o el crecimiento de las células, en comparación con los sistemas estándar de cultivo en quimiostato, el sistema de cultivo celular continuo descrito en la presente permite la producción a escala comercial de un polipéptido y/o virus de interés. Por ejemplo, en algunas modalidades, las células se cultivan en al menos aproximadamente 250 I de medio, por ejemplo, al menos aproximadamente 500 I, o al menos aproximadamente 1 .000 I de medio. En algunas modalidades preferidas, las células se cultivan en medio libre de suero y/o medios qu ímicamente definidos.

En algunas modalidades, el método comprende además una etapa de pre-cultivo, por ejemplo, para adaptar las células para la producción del polipéptido y/o virus de interés en un sistema de cultivo celular continuo como se describe en la presente. Así, en algunas modalidades preferidas, el método comprende, además, antes de la etapa de cultivo, precultivar las células en suspensión, por ejemplo, hasta que el cultivo alcance un volumen apropiado.

En una modalidad particular, el polipéptido de interés es una proteína de tipo desintegrina y metalopeptidasa con trombospondina de tipo 1 , motivo 1 3 (ADA TS1 3). En algunas modalidades, las células de mamífero son las células CHO, por ejemplo, células CHO genéticamente modificadas para expresar la proteína ADAMTS 1 3. En una modalidad particular, se proporciona un método para producir un polipéptido y/o virus de interés en un cultivo celular continuo, el método comprende: (a) cultivar las células de mam ífero independientes de anclaje que expresan el polipéptido y/o virus de interés en un sistema de cultivo celular continuo, donde el sistema de cultivo celular comprende un dispositivo de retención celular que tiene una velocidad de retención celular menor que 90%, y tiene una velocidad de dilución (D) entre 0.1 y 1 .0 d"1 y una densidad celular menor que 1 X 107 células/ml, y (b) recuperar el polipéptido y/o virus de interés del medio que se elimina del sistema de cultivo celular.

En otra modalidad particular, se proporciona un método para producir un polipéptido y/o virus de interés en un cultivo celular continuo, el método comprende: (a) cultivar las células CHO independientes de anclaje que expresan el polipéptido y/o virus de interés en un sistema de cultivo celular continuo, donde el sistema de cultivo celular comprende un microportador macroporoso como dispositivo de retención celular que tiene una velocidad de retención celular menor que 90%, y tiene una velocidad de dilución (D) entre 0.1 y 1 .0 d"1 y una densidad celular menor que 1 X 1 07 células/ml, y (b) recuperar el polipéptido y/o virus de interés del medio que se elimina del sistema de cultivo celular.

En otra modalidad particular, se proporciona un método para la producción de ADAMTS1 3 en un cultivo celular continuo, el método comprende: (a) cultivar las células de mamífero independientes de anclaje que expresan la proteína recombinante ADAMTS 13 en un sistema de cultivo celular continuo, donde el sistema de cultivo celular comprende un microportador macroporoso como dispositivo de retención celular que tiene una velocidad de retención celular menor que 90%, y tiene una velocidad de dilución (D) entre 0.1 y 1.0 d" 1 y una densidad celular menor que 1 X 107 células/ml, y (b) recuperar el ADAMTS1 3 del medio que se elimina del sistema de cultivo celular.

En otra modalidad particular, se proporciona un método para producir un polipéptido y/o virus de interés en un cultivo celular continuo, el método comprende: (a) cultivar las células de mamíferos independientes de anclaje que expresan el polipéptido y/o virus de interés en un sistema de cultivo celular continuo, donde el sistema de cultivo celular comprende un dispositivo de retención celular que tiene una velocidad de retención celular menor que 90% , y tiene una velocidad de dilución (D) entre 0.1 y 1 .0 d" 1 , una densidad celular menor que 1 X 107 células/ml, y una relación de la velocidad de dilución y la velocidad de crecimiento específica (D/µ) entre 1 .2 y 5, y (b) recuperar el polipéptido y/o virus de interés del medio que se elimina del sistema de cultivo celular, y además donde las células se cultivan en el sistema de cultivo celular por más de 50 d ías, y la velocidad de dilución, la densidad celular, y la relación de la velocidad de dilución y la velocidad de crecimiento específica cada uno se mantienen al menos 80% de las veces que las células se cultivan en el sistema de cultivo celular.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición que comprende un polipéptido y/o virus de interés producido según los métodos descritos en la presente, por ejemplo, una composición que comprende una proteína recombinante ADAMTS1 3 producida en consecuencia.

Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle a continuación.

Descripción detallada El sistema de cultivo celular continuo como se describe en la presente combina algunas de las ventajas del cultivo de células de mamíferos en perfusión y en quimiostato. Como se describió anteriormente, los sistemas de cultivo en perfusión funcionan mediante la perfusión de medio fresco a través del cu ltivo de cél ulas , m ientras que las células se mantienen mediante el uso de un dispositivo de retención celular; los sistemas de quimiostato funcionan mediante la entrada continua de medio y la salida de células y productos, sin un dispositivo de retención celular.

Como se usa en la presente "perfusión" se refiere al flujo continuo de una solución fisiológica de nutrientes a una velocidad constante, a través o sobre una población de células. Como los sistemas de perfusión generalmente implican la retención de las células dentro de la unidad de cultivo, los cultivos en perfusión se caracterizan por tener densidades de células relativamente altas, pero las condiciones de cultivo son difíciles de mantener y controlar. Además, dado que las células crecen y se mantienen dentro de la unidad de cultivo a altas densidades, la velocidad de crecimiento por lo general disminuye continuamente con el tiempo, dando lugar a la fase exponencial tardía o incluso estacionaria , del crecimiento celular. Por el contrario, "quimiostato" como se usa en la presente, se refiere a la entrada continua de una solución fisiológica de nutrientes, junto con una salida continua de células y otros productos con los medios que se eliminan, a través de un cultivo de células, por ejemplo, como en los sistemas de quimiostato. Sin embargo, debido a que las células se eliminan continuamente, el sistema de quimiostato normalmente sólo soporta densidades celulares menores.

La estrategia de cultivo continuo descrita en la presente comprende, generalmente, cultivar las células de mamíferos, por ejemplo, células independientes de anclaje, que expresan un polipéptido y/o virus de interés durante la fase de producción en un sistema de cultivo celular continuo. Por "células independientes de anclaje", se entiende células que se propagan libremente en suspensión en todo el volumen del cultivo, en lugar de adherirse o fijarse a un soporte sólido durante la propagación. El sistema de cultivo celular continuo comprenderá un dispositivo de retención celular similar al que se usa en un sistema de perfusión, pero que permita la eliminación continua de una parte importante de las células, preferentemente tal como un porcentaje menor que el de las células que se mantienen en el cultivo en perfusión. Por "dispositivo de retención celular" se entiende cualquier estructura capaz de mantener las células, particularmente células independientes de anclaje, en un lugar determinado durante el cultivo celular. Los ejemplos no limitantes incluyen microportadores, filtros giratorios de malla fina, fibras huecas, filtros de membrana de placas planas, tubos de sedimentación, dispositivos ultrasónicos de retención celular, y similares, que pueden mantener las células independientes de anclaje en biorreactores. Los polipéptidos y/o virus de interés (por ejemplo, un polipéptido recombinante y/o virus recombinante) se pueden recuperar del sistema de cultivo celular, por ejemplo, del medio que se elimina del sistema de cultivo celular.

El método para producir un polipéptido y/o virus de interés (por ejemplo, un polipéptido recombinante y/o virus recombinante) descrito en la presente comprende un método de cultivo celular que ofrece un sistema de cultivo de tipo quimiostato y que usa un dispositivo de retención cel ular. El sistema com prende cu ltiva r las células de mam íferos que expresan un polipéptido y/o virus de interés en un sistema de cultivo celular continuo con un dispositivo de retención celular. El papel del dispositivo de retención celular es para evitar la eliminación del cultivo de una parte, preferentemente una parte sustancial, de las células viables durante la reposición del medio de cultivo gastado con un medio fresco. Un dispositivo de retención celular exitoso debe cumplir con el mayor número posible de los siguientes requisitos: (1 ) mínimo daño celular o efecto sobre el crecimiento celular y la productividad, (2) retención selectiva de células viables solamente (las células inviables de preferencia se eliminan del cultivo, ya que ellas liberan metabolitos tóxicos en el medio de cultivo), (3) funcionamiento ininterrumpido durante largos períodos de cultivo, (4) bajo consumo de energía, (5) simplicidad de funcionamiento y mantenimiento (6), ampliación de capacidades para unidades de producción a gran escala, (7) estructura compacta, y (8) eficacia en función de los costos.

En modalidades particularmente preferidas, el dispositivo de retención celular que se usa permite la retención parcial de las células. Los dispositivos de retención celular y/o métodos se conocen bien en la materia. Muchos se basan en la sedimentación convencional, centrifugación y/o técnicas de filtración. Los ejemplos no limitantes de los dispositivos de retención celular incluyen microportadores, filtros giratorios, tales como filtros giratorios de malla fina, fibras huecas, filtros de membrana de placas planas, tubos de sedimentación, dispositivos ultrasónicos de retención celular, sedimentadores por gravedad, centrífugas, filtros de células acústicos, separadores de células en base a dielectroforesis, y similares (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 5,019,51 2; 5,626,734, las que se incorporan por este medio como referencia en su totalidad).

De acuerdo con una modalidad del sistema de cultivo descrito en la presente, los microportadores se pueden usar como dispositivo de retención celular. El microportador puede actuar como una superficie escalable de bajo costo en el que las células independientes de anclaje se pueden inmovilizar con el fin de favorecer la retención de la célula. Como se usa en la presente, "microportadores" se refiere a partículas suficientemente pequeñas como para que se usen en cultivos en suspensión, preferentemente con una velocidad de agitación que no cause un daño de cizalladura significativo a las células. Los microportadores pueden ser sólidos, porosos, o tener un núcleo sólido con una capa porosa. Los microportadores pueden ser, por ejemplo, sin limitación, de base celulosa o dextrano, y sus superficies (superficie exterior e interior en el caso de los portadores porosos) pueden estar cargadas positivamente. Más detalles acerca de los microportadores se pueden encontrar, por ejemplo, en WO 02/29083, que por este medio se incorpora como referencia en su totalidad.

En una modalidad, el microportador es un microportador macroporoso. Como se usa en la presente, "microportadores macroporosos" se refiere a partículas, por ejemplo, partículas a base de celulosa, las cuales tienen las siguientes propiedades: (a) son suficientemente pequeñas como para permitir el uso en cultivos en suspensión, preferentemente con una velocidad de agitación que no causa un daño de cizalladura significativo a las células, y (b) tienen poros y espacios interiores de tamaño suficiente para permitir que las células migren hacia los espacios interiores. Sus superficies (exterior e interior) en una modalidad pueden estar cargadas positivamente. En una modalidad, los portadores: (a) tienen un diámetro total de partícula entre aproximadamente 150 y aproximadamente 350 µ?t?; (b) tienen poros que tienen un diámetro promedio de apertura de poro entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40 µs?; y (c) tienen una densidad de carga positiva de entre aproximadamente 0.8 y 2.0 meq/g. En algunas modalidades, la carga positiva la proporcionan los grupos DEAE (?,?,-dietilaminoetilo). Los portadores porosos útiles incluyen, sin limitación, CYTOPORE 1™ y CYTOPORE 2™ (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Los microportadores macroporosos particularmente útiles son los portadores CYTOPORE 2™, que tienen un diámetro medio de partícula de 230 pm , un tamaño de poro promedio de 30 pm , y una densidad de carga positiva de 1 .8 meq/g.

En algunas modalidades, las unidades de cultivo se agitan. La agitación puede comprender revolver, agitar, balancear, vibrar, o similares, como se conoce en la materia. En una modalidad preferida, la agitación se logra con un impulsor de tipo Rushton, con deflectores. Los deflectores pueden estar en aproximadamente 140 rpm, lo que corresponde a una entrada de potencia/volumen específica de aproximadamente 40 W/m3. En algunas modalidades, la entrada de potencia/volumen específica es mayor que aproximadamente 40 W/m3, por ejemplo, aproximadamente 50 W/m3, aproximadamente 60 W/m3, aproximadamente 70 W/m3, aproximadamente 80 W/m3 o mayor. Se pueden usar otras velocidades como adecuadas en función de las células o cultivo en particular que se use.

La concentración de los microportadores como se describe en la presente es generalmente baja, por ejemplo, para ayudar a mantener la velocidad de dilución y de la densidad celular en intervalos específicos. En una modalidad , la unidad de cultivo puede comprender una cantidad de microportadores correspondiente a una concentración final de microportadores en el intervalo de 0.05-1 .0 g/l. En una modalidad, la concentración final de microportadores es aproximadamente 0.05-0.1 g/l. En una modalidad, la concentración final de microportadores es aproximadamente 0.1 -0.25 g/l. En otra modalidad, la concentración final de microportadores es aproximadamente 0.25-0.5 g/l. En otra modalidad, la concentración final de microportadores es aproximadamente 0.5-0.75 g/l. En otra modalidad, la concentración final de microportadores es aproximadamente 0.75-1 .0 g/l. En otra modalidad, la concentración de portadores se puede aumentar o reducir durante el cultivo continuo, por ejemplo, para ajustar la densidad de las células y las velocidades de dilución dentro de los intervalos predeterminados.

El sistema de cultivo de células continuo descrito tiene una velocidad de dilución preferida (D) y una densidad celular preferida. En particular, la velocidad de dilución y la densidad celular se mantienen en valores predeterminados o dentro de los intervalos predeterminados. Además, el sistema de cultivo celular co nti n u o descrito puede tener u na velocidad de crecimiento específica m ínima o un intervalo predeterminado de velocidades de crecimiento específicas durante todo el tiempo de proceso.

La velocidad de dilución (D) se refiere al volumen del medio suministrado por día dividido por el volumen del cultivo. Aunque el sistema de cultivo celular continuo descrito en la presente involucra la retención de células, la velocidad de dilución del sistema de cultivo celular continuo es generalmente menor que la de un cultivo en perfusión, por ejemplo, menor que aproximadamente 2 volúmenes de dilución/día (2 d'1 ). En una modalidad, la velocidad de dilución se mantiene a más que aproximadamente 0.2 d"1 a menos que aproximadamente 2.0 d" 1. En otra modalidad, la velocidad de dilución se mantiene a menos que aproximadamente 2.0 d" 1, por ejemplo, menor que aproximadamente 1 .8 d' 1 , por ejemplo, menor que aproximadamente 1 .5 d"1 , por ejemplo, menor que aproximadamente 1 .2 d'1 , etc. En otra modalidad, la velocidad de dilución se mantiene a menos que aproximadamente 1 .0 d"\ por ejemplo, menor que aproximadamente 0.9 d"1 , por ejemplo, menor que aproximadamente 0.8 d"1 , por ejemplo, menor que aproximadamente 0.7 d" 1 , por ejemplo, menor que aproximadamente 0.6 d" 1 , etc. En otra modalidad, la velocidad de dilución se mantiene a más que aproximadamente 0.2 d" 1 , por ejemplo, mayor que aproximadamente 0.3 d" , por ejemplo, mayor que aproximadamente 0.4 d' 1 , por ejemplo, mayor que aproximadamente 0.5 d"\ etc.

Además, en u n s istema de cu ltivo cel u la r conti nuo como se describe en la presente, la densidad celular se mantiene en un valor menor que la que se mantiene en un sistema de cultivo en perfusión, pero mayor que las densidades celulares que se logran en un sistema de quimiostato. En una modalidad, la densidad celular es menor que aproximadamente 2X107 célula/ml, por ejemplo, menor que aproximadamente 1 .5X1 07 célula/ml, por ejemplo, menor que aproximadamente 1 X107 célula/ml, por ejemplo, menor que aproximadamente 8X1 06 célula/ml, por ejemplo menor que aproximadamente 6X106 célula/ml, por ejemplo, menor que aproximadamente 5X106 célula/ml. En otra modalidad, la densidad celular puede ser mayor que aproximadamente 1 X1 06 célula/ml, por ejemplo, mayor que aproximadamente 1 .5X1 06 célula/ml, por ejemplo mayor que aproximadamente 2X106 célula/ml, por ejemplo mayor que aproximadamente 3X106 célula/ml, por ejemplo mayor que aproximadamente 4X10 célula/ml, etc. En otra modalidad, la densidad celular se mantiene entre aproximadamente 1.0X106 célula/ml a aproximadamente 2X106 célula/ml. En otra modalidad, la densidad celular se mantiene entre aproximadamente 2X106 célula/ml a aproximadamente 4X106 célula/ml. En otra modalidad, la densidad celular se mantiene entre aproximadamente 5X106 célula/ml a aproximadamente 1X107 célula/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 6X106 célula/ml a aproximadamente 8X106 célula/ml. En otra modalidad, la densidad celular se mantiene entre aproximadamente 1X107 célula/ml a aproximadamente 2X107 célula/ml.

Alguien con experiencia en la materia reconoce que el mecanismo por el cual pueden mantenerse las densidades celulares implica la disminución de la parte de células .que se mantienen con el dispositivo de retención celular, es decir, la velocidad de retención celular. Generalmente, un cultivo de perfusión tiene una velocidad de retención celular mayor que 90% o 95%, y, en muchos casos, cerca de 100%. En el sistema de cultivo celular continuo descrito, la velocidad de retención celular es menor que 90%. En una modalidad, la retención celular es menor que aproximadamente 85%, por ejemplo, menor que aproximadamente 75%. En una modalidad, la velocidad de retención celular es menor que aproximadamente 70%, por ejemplo, menor que aproximadamente 60%, por ejemplo, menor que aproximadamente 50%, por ejemplo, menor que aproximadamente 40%, por ejemplo, menor que aproximadamente 30%. En una modalidad, retención celular se mantiene entre aproximadamente 30% y aproximadamente 90%. En otra modalidad, retención celular se mantiene entre aproximadamente 30% y aproximadamente 80%. En otra modalidad, retención celular se mantiene entre aproximadamente 30% y aproximadamente 70%. En otra modalidad, retención celular se mantiene entre aproximadamente 40% y aproximadamente 60%. En otra modalidad, retención celular se mantiene entre aproximadamente 40% y aproximadamente 70%. En otra modalidad, retención celular se mantiene entre aproximadamente 50% y aproximadamente 90%. En otra modalidad, retención celular se mantiene entre aproximadamente 60% y aproximadamente 90%. En otra modalidad, retención celular se mantiene entre aproximadamente 70% y aproximadamente 90%. En otra modalidad, retención celular se mantiene entre aproximadamente 80% y aproximadamente 90%.

El cultivo también se puede caracterizar por la relación entre la velocidad de dilución y la velocidad de crecimiento específica. La velocidad de crecimiento específica (µ) se refiere al aumento de la masa celular por unidad de masa celular por día (en relación a la masa celular total): µ = (ln(XT / Xt-i))/((t)-(t-1)), en donde XT es la concentración de biomasa en el tiempo (t) y XM es la biomasa en el punto de tiempo anterior. Generalmente, la velocidad de crecimiento específica del sistema de cultivo continuo como se describe en la presente deberá ser constante dentro de un intervalo predeterminado, y preferentemente con un cierto nivel mínimo para garantizar un mínimo de expresión del polipéptido y/o virus que se asocie al crecimiento. Por ejemplo, la velocidad de crecimiento específica del sistema de cultivo continuo descrito en la presente descripción puede ser de aproximadamente 0.1 d'1 a aproximadamente 1 .0 d'1. En una modalidad, la velocidad de crecimiento específica mantenida por el sistema de cultivo continuo descrito en la presente descripción es mayor que aproximadamente 0.1 d \ por ejemplo, mayor que aproximadamente 0.1 5 d' 1 , por ejemplo, mayor que aproximadamente 0.2 d" 1 , por ejemplo, mayor que aproximadamente 0.25 d" 1 , por ejemplo, mayor que aproximadamente 0.3 d"1 , por ejemplo, mayor que aproximadamente 0.35d'\ etc. En otra modalidad , la velocidad de crecimiento específica mantenida por el sistema de cultivo continuo descrito en la presente descripción es menor que aproximadamente 1 .0 d" 1 , por ejemplo, menor que aproximadamente 0.8 d"1 , por ejemplo, menor que aproximadamente 0.7 d" 1 , por ejemplo, menor que aproximadamente 0.6 d" 1 , por ejemplo, menor que aproximadamente 0.5 d" 1 , por ejemplo, menor que aproximadamente 0.45 d" 1. En otra modalidad, la velocidad de crecimiento específica puede mantenerse entre aproximadamente 0.1 d" 1 a aproximadamente 0.45 d" . En una modalidad, la velocidad de crecimiento especifica mantenida por el sistema de cultivo continuo descrito en la presente descripción está entre aproximadamente 0.1 5 d"1 a aproximadamente 0.3 d" 1. En una modalidad , la velocidad de crecimiento específica mantenida por el sistema de cultivo continuo descrito en la presente descripción estás entre aproximadamente 0.2 d"1 a aproximadamente 0.25 d"1.

Como se describió anteriormente, el sistema de cultivo continuo descrito en la presente mantiene una densidad celular menor que aproximadamente 2X1 07 células/ml. Un mecanismo por el cual las densidades celulares se mantendrán como se describió anteriormente implica mantener una velocidad de dilución particular para la velocidad de crecimiento específica. Los cultivos en quimiostato tienen velocidades de dilución aproximadamente igual a las velocidades de crecimiento específicas para una relación de D/µ de aproximadamente 1 . Los cultivos en perfusión generalmente tienen velocidades de dilución absoluta superiores y velocidades de crecimiento específicas muy bajas, por lo que la relación de D/µ es significativamente mayor que 1 . En el sistema de cultivo continuo descrito en la presente, sin embargo, se mantiene preferentemente una velocidad de dilución que es ligeramente superior a la velocidad de crecimiento específica. En consecuencia, en el cultivo conti n uo d escrito en la presente , se m a ntiene una relación de D/µ mayor que 1 . En modalidades particularmente preferidas, la velocidad de dilución se calcula y se establece de acuerdo con la eficiencia del dispositivo de retención a fin de mantener la velocidad de crecimiento específica dentro de un intervalo predeterminado. En una modalidad, la relación de la velocidad de dilución a la velocidad de crecimiento específica es mayor que aproximadamente 1 .0, por ejemplo, mayor que aproximadamente 1 .2, por ejemplo, mayor que aproximadamente 1 .5, por ejemplo, mayor que aproximadamente 2, por ejemplo, mayor que aproximadamente 2.5. En otra modalidad, la relación de la velocidad de dilución a la velocidad de crecimiento específica es menor que aproximadamente 5, por ejemplo, menor que aproximadamente 4, por ejemplo, menor que aproximadamente 3. En una modalidad, la relación de D/µ está entre aproximadamente 1 .2 y aproximadamente 5. En otra modalidad, la relación de la velocidad de dilución a la velocidad de crecimiento específica está entre aproximadamente 1 .8 y aproximadamente 3. En otra modalidad, la relación de la velocidad de dilución a la velocidad de crecimiento específica está entre aproximadamente 2.0 y aproximadamente 2.5.

Los métodos de la invención se pueden llevar a cabo en una unidad de cultivo adecuado o biorreactor. El biorreactor puede ser de cualquier tamaño, siempre que sea útil para el cultivo de células, por ejemplo, células de mam íferos. Dado que los procesos con bajas densidades celulares son generalmente fáciles de escalar, los métodos de la invención pueden ser particularmente ventajosos para el cultivo a gran escala (es decir, con volúmenes de cultivos mayores que 250 I) y pueden ser particularmente susceptibles de escalar a partir de la escala pequeña de los cultivos de laboratorio (por ejemplo, 1 0 I) a cultivos a escala de producción (por ejemplo, 250 I o más) con una modificación mínima de las condiciones de cultivo. Las condiciones internas de la unidad de cultivo, que incluyen pero sin limitarse a, pH, p02, y temperatura, típicamente se controlan durante el período de cultivo. Una unidad de cultivo de producción se refiere a la unidad de cultivo final que se usa en la producción del polipéptido, virus y/o cualquier otro producto de interés. El volumen de una unidad de cultivo de producción a gran escala es generalmente mayor que aproximadamente 250 litros, y puede ser de aproximadamente 300, aproximadamente 500, aproximadamente 800, aproximadamente 1 000, aproximadamente 2500, aproximadamente 5000, aproximadamente 8000, aproximadamente 10,000, aproximadamente 12,0000 I o mayor, o cualquier volumen intermedio. Una unidad de cultivo o unidad de cultivo de producción adecuada puede estar compuesta por (es decir, construida de) cualquier material que sea adecuado para contener cultivos de células en suspensión en medio, bajo las condiciones de cultivo contempladas en la presente, y que es propicio para el crecimiento y viabilidad de células de mam íferos. Los ejemplos de materiales adecuados incluyen, sin limitación, vidrio, plástico y/o metal. En modalidades preferidas, el(los) material(es) no interfiere(n), o no interfiere(n) de manera significativa o sustancialmente, con la expresión y/o la estabilidad del producto deseado, por ejemplo, el polipéptido y/o virus de interés. Alguien con experiencia en la materia será consciente de , y será capaz de elegir, unidades de cultivo adecuadas para usar en la práctica del presente sistema de cultivo continuo.

En algunas modalidades, el proceso de cultivo celular funciona en más de una unidad de cultivo distinta, tales como mediante el uso de una o más unidades de cultivo semilla (propagación) seguido por el uso de la unidad de cultivo de producción. En algunas modalidades, entonces, el proceso implica la transferencia de aproximadamente 50 I del cultivo semilla de propagación (que tiene aproximadamente 1 .0X106 células/ml) en una unidad de cultivo de 250 I que contenga aproximadamente 1 50 I de medio de cultivo. En general, el sistema de cultivo continuo descrito en la presente sólo se aplica a las unidades de cultivo de producción. Por ejemplo, las células de mamífero semillas se pueden propagar primero, por ejemplo, en sistemas de lote, lote alimentado, perfusión y/o quimiostato, en una o más unidades de cultivo semilla. Después de la transferencia de las células a una unidad de cultivo de producción, las células se pueden cultivar de acuerdo con el sistema de cultivo continuo como se describe en la presente, por ejemplo, con un dispositivo de retención celular en un sistema de cultivo celular que tiene una velocidad de dilución menor que aproximadamente de 2 d" 1 y una densidad celular menor que aproximadamente 2X107 células/ml.

Alternativamente, la expansión de las células a la unidad de cultivo de producción y la fase de producción se puede realizar en una unidad de cultivo física. Por ejemplo, las células se pueden expandir a una escala de producción final y cambiar el proceso a las condiciones de producción, después de lo cual se pueden usar las condiciones para el sistema de cultivo celular continuo descrito en la presente.

Se ha descubierto inesperadamente que los métodos de cultivo de la invención se pueden usar para mantener las densidades celulares y la velocidad de dilución dentro de intervalos predeterminados, por ejemplo, para soportar fases de producción de una duración similar a la de los sistemas de quimiostato o perfusión. Por "intervalos predeterminados" se entiende intervalos objetivos, por ejemplo, los intervalos descritos en la presente para el funcionamiento de los sistemas de cultivo continuo de acuerdo a modalidades de la presente invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, el intervalo objetivo para la velocidad de dilución es entre 0.2 d" 1 a 2.0 d' 1 y la densidad celular es menor que 2X107 célula/ml. En otra modalidad, la velocidad de dilución se mantiene a menos que 2.0 d" 1 , por ejemplo, menos que 1.8 d"1, por ejemplo, menos que 1.5 d"1, o por ejemplo, menos que 1.2 d'\ y la densidad celular es menor que 1.5X107 célula/ml, por ejemplo, menor que 1X107 célula/ml, o por ejemplo, menor que 8X106 célula/ml. En algunas modalidades, la velocidad de crecimiento específica es 0.1 d"1 a 1.0 d"1y la relación de la velocidad de dilución a la velocidad de crecimiento específica es entre 1.2 y 5. En algunas modalidades, el intervalo objetivo para la velocidad de dilución es entre 0.5 d"1 a 1.0 d"1 y la densidad celular es menor que 5X106 célula/ml. En algunas modalidades, la velocidad de crecimiento específica es 0.15 d" a 0.3 d"1y la relación de la velocidad de dilución a la velocidad de crecimiento específica es entre 1.8 y 3. En algunas modalidades, la velocidad de crecimiento específica es 0.2 d*1 a 0.25 d" 1y la relación de la velocidad de dilución a la velocidad de crecimiento específica es entre 2.0 y 2.5. En una modalidad particularmente preferida, la densidad celular es 5 X 106 célula/ml o menos, la velocidad de dilución es menor que 0.6 d"1, y la velocidad de crecimiento específica es 0.18 a 0.27 d'1. En otra modalidad particularmente preferida, la densidad celular es menor que 5 X 106 célula/ml, la velocidad de dilución es entre 0.55 y 0.6 d'\ y la velocidad de crecimiento específica es 0.16 a 0.26 d'1. Las modalidades incluyen mantener la velocidad de dilución y/o la densidad celular y/o la velocidad de crecimiento específica y/o la relación de la velocidad de dilución a la velocidad de crecimiento específica dentro de un intervalo objetivo (por ejemplo, los que se exponen anteriormente) para al menos aproximadamente 50%, por ejemplo al menos aproximadamente 60%, por ejemplo, al menos aproximadamente 70%, por ejemplo, al menos aproximadamente 80%, por ejemplo, al menos aproximadamente 90%, por ejemplo, al menos aproximadamente 95%, por ejemplo, al menos aproximadamente 98% del tiempo de cultivo continuo total y/o el tiempo de la fase de producción.

El sistema de cultivo celular continuo descrito en la presente puede permitir la producción sostenida de un polipéptido y/o virus de interés a partir de células de mamíferos. En algunas modalidades, las células se cultivaron por un tiempo de cultivo celular continuo total de más que aproximadamente 7 d ías. En modalidades más preferidas, las cél ulas se cu ltiva ron por más de aproxi mada mente 9 d ías , más de aproximadamente 14 d ías, más de aproximadamente 21 días, más de aproximadamente 28 días, más de aproximadamente 35 días, más de aproximadamente 40 días, más de aproximadamente 45 días, o más de aproximadamente 50 días.

Los términos "medio de cultivo celular" y "medio de cultivo" (o simplemente "medio") se refieren a una solución de nutrientes que se usa para el cultivo de células eucariotas que normalmente proporciona al menos un componente de una o más de las siguientes categorías: (1 ) sales (por ejemplo, sodio, potasio, magnesio, calcio, etc.) que contribuyen a la osmolalidad del medio; (2) una fuente de energía, usualmente en forma de carbohidratos tales como la glucosa; (3) todos los aminoácidos esenciales, y por lo general el conjunto básico de veinte aminoácidos; (4) vitaminas y/o otros compuestos orgánicos necesarios en bajas concentraciones; y (5) elementos en trazas, donde los elementos en trazas se definen como compuestos inorgánicos que típicamente se requieren a concentraciones muy bajas, usualmente en el intervalo micromolar. La solución de nutrientes opcionalmente se puede suplementar con uno o más de los componentes de cualquiera de las siguientes categorías: (a) suero animal; (b) hormonas y otros factores de crecimiento tales como, por ejemplo, insulina, transferrina, y factor de crecimiento epidérmico; e (c) hidrolizados de plantas, levaduras y/o tejidos, lo que incluye hidrolizados de proteínas de los mismos.

El presente sistema de cultivo continuo encuentra uso particular, cuando se cultivan células de mam íferos que expresan un polipéptido y/o un virus de interés en medio libre de suero, medio químicamente definido, o medio que carece de componentes derivados de animales. Los medios químicamente definidos son los medios en los cuales todos los componentes tienen una estructura química conocida. Los medios químicamente definidos están disponibles de proveedores comerciales, tales como, por ejemplo, Sigma, JRH Biosciences, Gibco y Gemini. En otras modalidades de la invención, el medio puede contener un aminoácido(s) derívado(s) de cualquier fuente o método conocido en la materia, incluyendo, pero sin limitarse a, un aminoácido(s) que se deriva(n) de la adición de uno o más aminoácidos o de la adición de un hidrolizado de peptona o de proteínas (lo que incluye hidrolizado de un animal , levadura, o fuente(s) vegetal).

Se puede usar cualquier medio de cultivo celular que soporte el crecimiento y el mantenimiento celular en las condiciones de la invención. Típicamente, el medio contiene agua, un regulador de la osmolalidad, un amortiguador, una fuente de energía, aminoácidos, una fuente de hierro inorgánica o recombinante, uno o más factores de crecimiento sintéticos o recombinantes, vitaminas, y cofactores. En modalidades preferidas, el medio de cultivo carece de componentes derivados de animales. Como se usa en la presente, los componentes "derivados de animales", son cualquier componente que se produzca en un animal intacto (como, por ejemplo, las proteínas que se aislan y purifican a partir del suero), o que se producen por medio del uso de componentes que se producen en un animal intacto (como, por ejemplo, un aminoácido que se hace por medio del uso de una enzima que se aisló y purificó a partir de un animal para h idrolizar un material de origen vegetal) . Por el contrario, una proteína que tiene la secuencia de una proteína animal (es decir, tiene un origen genómico en un animal), pero que se produce in vitro en cultivos celulares (tales como, por ejemplo, en una célula de levadura o bacteria recombinante o en una línea continua de células eucariotas establecida, recombinante o no), por medio del uso de medios que carecen de componentes que se producen en, o se aislan y purifican a partir de, un animal intacto no es un componente "derivado de animal". Por ejemplo, la insulina que se produce en una levadura o una célula bacteriana, o la insulina que se produce en una línea celular establecida de mam íferos, tales como, por ejemplo, células CHO, BHK o HEK, o el interferón que se produce en las células Namalwa, no constituye un componente "derivado de animal". Por consiguiente, un medio de cultivo de células que carece de componentes derivados de animal es uno que puede contener proteínas de animal que se producen de forma recombinante; tal medio, sin embargo, no contiene, por ejemplo, suero animal o proteínas u otros productos que se purificaron a partir de suero animal. Tal medio puede, por ejemplo, contener uno o más componentes que se derivan de plantas.

En otras modalidades de la invención, el medio que se usa durante la fase de crecimiento celular contiene medio concentrado, es decir, medio que contiene una concentración de nutrientes más alta que la que normalmente es necesaria y normalmente se suministra a un cultivo en crecimiento. Alguien con experiencia en la materia reconocerá cuáles med ios ce l u l ares , med ios de in ocu lación , etc. so n apropiados para cultivar una célula en particular, por ejemplo, células animales (por ejemplo, células CHO). Por ejemplo, alguien con experiencia en la materia será capaz de seleccionar adecuadamente para un cultivo en particular la cantidad de glucosa y otros nutrientes, tales como glutamina, hierro, elementos en trazas, y similares, así como otras variables del cultivo, tales como, por ejemplo, la cantidad de espuma, osmolalidad, etc. (ver, por ejemplo, Mather, J . P. , y otros ( 1999) "Culture media, animal cells, large scale production," Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Vol. 2:777-785 (especialmente páginas 780 a 783); publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm . 2006/0121568 (especialmente párrafos

[0144] a

[0185] y

[0203] a [0331 ]) ; los que se incorporan por este medio como referencia en la presente descripción en su totalidad). La presente invención también contempla variantes de tales medios conocidos, que incluyen, por ejemplo, variantes de tales medios enriquecidos con nutrientes, medios concentrados, medios químicamente definidos, medios libres de suero, y medios que se modifican de otra manera de acuerdo con varias modalidades de la invención.

El sistema de cultivo continuo, no se limita a ningún tipo de célula de mamífero independiente de anclaje. Las células de mamíferos pueden ser células de mamífero que se modifican genéticamente que expresan un polipéptido recombinante (y/o virus recombinante) de interés, o células de mamífero sin modificar que expresan un polipéptido (y/o un virus) de interés. Un número de líneas de células de mamíferos son células hospederas adecuadas para la expresión recombinante de polipéptidos y/o virus. Las líneas de mamífero hospederas incluyen, por ejemplo, células COS, PER.C6, TM4, VERO, MDCK, BRL-3A, W138, Hep G2, M T, MRC 5, FS4, CHO, 293T, A431, 3T3, CV-1, C3H10T1/2, Colo205, 293, HeLa, células L, BHK, HL-60, FRhL-2, U937, HaK, células Jurkat, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x, mielomas murinos (por ejemplo, SP2/0 y NSO) y C2C12, así como líneas celulares de primates transformadas, hibrídomas, células normales diploides y cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario y explantes primarios. Cualquier célula de mamíferos que se puede adaptar al cultivo en suspensión se puede usar en el método de cultivo celular que se describe. Un ejemplo no limitante incluye células CHO, que son dependientes de anclaje cuando se cultivan en presencia de suero y superficies adecuadas, pero se adaptan fácilmente al crecimiento en cultivo en suspensión (véase, por ejemplo, Rasmussen 1998, Cytotechnology 28: pp31 -42, especialmente las páginas 34 - 37, con respecto al cultivo de una línea de células CHO libre de suero). También cualquier célula de mam ífero capaz de expresar el polipéptido y/o virus de interés (ya sea de producción recombinante o no) se puede usar en los métodos de cultivo celular descritos. En una modalidad, el método de cultivo celular continuo que se describe en la presente se puede usar para adaptar una línea celular dependiente de anclaje a una línea celular independiente de anclaje. Numerosas líneas celulares están disponibles de fuentes comerciales, tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, por sus siglas en inglés). En una modalidad, el sistema de cultivo celular continuo se usa para cultivar células CHO genéticamente modificadas.

Como se describe en la presente, el sistema de cultivo celular continuo permite la recuperación de un polipéptido y/o virus de interés (por ejemplo, un polipéptido recombinante y/o virus recombinante). El polipéptido y/o virus generalmente se recupera de medio gastado que se elimina del sistema. Las ventajas de las modalidades preferidas de la invención incluyen la reducción del tiempo de residencia de la proteína y/o virus en el biorreactor, lo que es particularmente útil para productos susceptibles a la degradación. Sin embargo, el sistema de cultivo celular continuo, como se describe en la presente no se limita a tales polipéptidos o virus lábiles, y se puede usar para la recuperación de otros polipéptidos o virus de interés.

La presente invención se refiere a métodos para el cultivo continuo mejorado a gran escala de células de mam ífero que expresan una o más proteínas y/o virus de interés, ya sea partir de genes endógenos o infección natural, o a consecuencia de la introducción en tales células de genes recombinantes que codifican las proteínas o los virus de interés. Estas proteínas incluyen , como ejemplos no limitantes, enzimas, hormonas, anticuerpos, receptores de proteína, proteínas de fusión (por ejemplo, la fusión de los receptores solubles y el dominio Fe de una IgG) , vacunas, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, proteínas del factor de la sangre etc. En una modalidad, la proteína de interés es la ADAMTS13. En otra modalidad, la proteína de interés es el Factor Vi l o Factor VI I I . En otra modalidad, la proteína de interés es el inhibidor de la alfa-1 -proteinasa.

La presente invención se refiere también a métodos para mejorar el cultivo continuo a gran escala de células de mam ífero que expresan uno o más virus de interés (lo que incluye las partículas virales y vectores virales), ya sean de tipo salvaje o recombinante. Los ejemplos no limitantes de tales virus de tipo salvaje o recombinante, partículas virales y/o vectores virales incluyen Adenovirus, Herpes virus, retrovirus, lentivirus, virus de la Influenza, etc. La producción de virus recombinantes, partículas virales y el uso de vectores virales recombinantes se conocen bien en el arte. Para la expresión del virus, el método de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para, pero sin limitarse a, la infección con y la expresión de virus no-líticos como por ejemplo Hepatitis A y TBE en, por ejemplo, células Vero, o lentivirus en, por ejemplo, HEK293 u otras líneas celulares humanas o de mam íferos.

Una vez que el medio se elimina de la unidad de cultivo, se puede someter a una o más etapas del proceso para obtener la proteína y/o virus de interés. Las etapas posteriores del proceso incluyen, sin limitación, centrifugación y/o filtración para retirar las células que no se eliminaron anteriormente del cultivo; cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía de exclusión molecular; procedimientos de electroforesis (por ejemplo, focalización isoeléctrica preparativa (I EF), solubilidad diferencial (por ejemplo, la precipitación por sulfato de amonio), extracción, y similares. Ver, generalmente, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, Nueva York, 1 982; y Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989.

En ciertas modalidades, las células de mam ífero se someten a una etapa pre-cultivo, por ejemplo, una etapa de pre-cultivo para la adaptación de las células para la producción del polipéptido y/o virus de interés. En algunas modalidades, la adaptación comprende pre-cultivar las células en suspensión, por ejemplo, por un tiempo para permitir que el cultivo alcance un volumen de trabajo final deseado, por ejemplo, de aproximadamente 5 I, aproximadamente 8 I, aproximadamente 10 I, aproximadamente 12 I, aproximadamente 1 5 I, o aproximadamente 20 I, etc. En este punto, el cultivo se puede cambiar a una alimentación y operación continua del medio de acuerdo con el sistema de cultivo celular continuo que se describe en la presente.

Las modalidades ejemplares de la invención que se describen en la presente se discuten en los Ejemplos a continuación. Los Ejemplos, sin embargo, y sus detalles particulares, de ninguna manera intentan limitar la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 : Se prepararon cultivos en quimiostato con una línea de células CHO recombinante que expresaba la ADAMTS 1 3 humana en medio BACD-A1 3 químicamente definido (formulación DMEM/F12 enriquecida), que se suplemento como se muestra en la Tabla 1 .1 .

Las células CHO recombinantes que expresaban la ADAMTS 13 humana se adaptaron a un medio químicamente definido, llamado medio BCS, como se muestra en la Tabla 1 .2.

Un banco celular de trabajo de desarrollo se descongeló y se preparó el inoculo de células en medio BCS. Las células se transfirieron a una unidad de cultivo de 10 I con impulsores de tipo Rushton y se cultivaron en cultivos en lote repetidos en medio BACD-A13 con parámetros controlados en línea, como sigue: pH 7.10, temperatura 36°C, y DO de saturación del aire 20%.

Después de dos ciclos en lotes, los cultivos alcanzaron un volumen de trabajo final de 10 I, y el cultivo se cambió a un medio continuo que se alimentó en el día 4 y funcionó hasta el d ía 18 en un modo de quimiostato.

A partir de este cultivo, se inoculó una segunda unidad de cultivo de 10 I con impulsor de tipo Rushton y un dispositivo de retención celular se inoculó por perfusión de tipo quimiostato, mediante el uso del mismo medio de cultivo celular, y se cultivaron durante ocho días en cultivo en lote repetido. Se añadieron microportadores CYTOPORE 2™ (GE Healthcare) (0.25 g/l), y la unidad de cultivo funcionó en modo de perfusión continua de tipo quimiostato en paralelo a la otra unidad de cultivo en modo quimiostato. Las unidades de cultivo se agitaron con impulsores de tipo Rushton, con deflectores a 140 rpm , lo que corresponde a una entrada de potencia/volumen específica de aproximadamente 40 W/m3.

Ambas unidades de cultivo funcionaron en paralelo durante 24 días. Los datos se calcularon en intervalos de 3 semanas y un intervalo adicional de 3 d ías (Tabla 1 .3. (Quimiostato) y Tabla 1 .4 (perfusión de tipo quimiostato). Los datos de cuatro intervalos de la Tabla 1 .3. (días 26-32; días 33-39; días 40-46; y días 47-49) se compararon directamente con los cuatro intervalos mostrados en la Tabla 1 .4 (días 9-15; días 16-22; días 23-29; y días 30-32).

Se tomaron muestras de las unidades de cultivo y se analizaron para la concentración de ADAMTS 1 3 por ELISA, y para la actividad de ADAMTS 13 por el ensayo de FRETS-73. Los conteos de células se determinaron por la tecnolog ía Nucleocounter. Para los cultivos de perfusión, el conteo total de células y el conteo de células en el sobrenadante se midieron por separado para calcular la retención celular relativa. Las velocidades de dilución se midieron y se usaron para calcular las velocidades crecimiento y las productividades volumétricas. Las ecuaciones se proporcionan a continuación.

La velocidad de crecimiento (µ) en el cultivo en quimiostato se calculó usando la ecuación: µ = D + In (XT / Xt-i ) / (t - t^), en la que D= velocidad de dilución, XT= densidad total de células en el tiempo t, y (t - t.i) = tiempo entre t y t.,.

La velocidad de crecimiento (µ) en el cultivo en perfusión de tipo quimiostato se calculó usando la ecuación µ = In (X, / Xt-i ) / (t - t.i) + D x (log medio XSN / log medio X)/ ( t - t. ; en la que D = velocidad de dilución, X, = densidad total de células en el tiempo t, (t - t.i) = tiempo entre t y t.i , log medio X = media logarítmica de la densidad celular total = (XT - Xt-i ) / ( ln( X, ) - In (Xt-i)), y log medio XSN = media logarítmica de la densidad celular del sobrenadante.

La velocidad de retención celular se calculó como = 100 x (1 - XSN / X)[%] La velocidad de crecimiento específica de las células en cultivo en lotes fue de 0.42 d"1. Después de cambiar a cultivo en quimiostato, se observó un descenso de la velocidad de crecimiento específica de aproximadamente 0.30 d"1 , lo cual es indicativo de condiciones limitantes del crecimiento en el medio químicamente definido. Las densidades celulares se equilibraron en el intervalo de 1 .8-2x106 células/ml. Bajo tales condiciones de cultivo continuo, se alcanzó el estado de equilibrio (a partir del intervalo de 12-18) , y se pudieron alcanzar más de 2500 U/l/d.

Como se señaló anteriormente, después de la inoculación de la unidad de cultivo con un dispositivo de retención celular, el día 18, las células se cultivaron adicionalmente en un modo de perfusión continuo de tipo quimiostato. Debido a la retención celular, la densidad celular en los cultivos en perfusión de tipo quimiostato se incrementó. Sin embargo debido a la velocidad de retención celular relativamente baja (media 72%, intervalo 60% - 84%), las densidades celulares se mantuvieron en un nivel relativamente bajo de < 1 x107 células/ml (media 4.93X106 células/ml) y la velocidad de dilución máxima fue de 0.62 d" 1.

La velocidad de retención celular baja también permitió a las célula mantener una velocidad constante de crecimiento específico de 0.1 8 a 0.27 d"1 sin dar lugar a densidades celulares excesivas. Esto se considera una ventaja para las células recombinantes, las cuales expresan proteínas recombinantes en una forma asociada al crecimiento. A pesar de una productividad específica reducida (por ejemplo, 974 mU/E06/d vs 1400 mU/E06/d) la productividad volumétrica se incrementó en más del 70% de 2648 U/l/d a 4538 U/l/d, debido a la dens idad celu la r a proxi m ad a mente 2.8 veces más a lta . La actividad específica de la proteína recombinante también mejoró (941 U/mg vs 834 U/mg), probablemente debido al tiempo de permanencia reducido en la unidad de cultivo, lo que mejora la estabilidad, o cualquier otro efecto beneficioso sobre la estructura y función de la ADAMTS13 recombinante que se expresa.

Ejemplo 2: Los cultivos de quimiostato se prepararon con una línea celular CHO recombinante que expresa la ADAMTS13 humana en el medio BACD-A13 químicamente definido (formulación de DMEM/F12 enriquecida), que se suplemento como se muestra en la Tabla 1 .1 .

Las células CHO recombinantes que expresaban la ADAMTS 1 3 humana se adaptaron a un medio químicamente definido, llamado medio BCS, como se muestra en la Tabla 1 .2. Se descongeló un banco celular de trabajo de desarrollo y se preparó el inoculo celular en medio BCS.

Las células se transfirieron a una unidad de 1 .5 I con impulsores de paleta y se cultivaron en cultivos repetidos en lote en medio BACD-A1 3 con pH 7.1 , temperatura 36°C, y DO de saturación del aire 20% que se controlaron en línea.

Después de dos ciclos en lote, los cultivos alcanzaron un volumen final de trabajo de 1 .5 I, y el cultivo se cambió a una alimentación de medio continua el día 5 y funcionó hasta el d ía 7 en modo quimiostato.

A partir de este cultivo se inoculó una segunda unidad que comprendía un dispositivo de retención celular con impulsores de paleta usa ndo el m ismo med io de cu ltivo ce lu la r y se cu ltivaron d ura nte un día en cultivo en lote. Se añadieron microportadores CYTOPORE 2™ (GE Healthcare) (0.25 g /I), y la unidad de cultivo funcionó en modo continuo de tipo quimiostato en paralelo a la otra unidad de cultivo en modo quimiostato.

Ambas unidades de cultivo funcionaron en paralelo por 28 días. Los datos se calcularon en 4 intervalos semanales (Tabla 2.1 (quimiostato) y 2.2 (modo de perfusión de tipo quimiostato)).

Se tomaron muestras de las unidades de cultivo y se analizaron para la concentración de ADAMTS1 3 por ELISA y para la actividad ADAMTS 13 por el ensayo FRETS-73. Los conteos de células se determinaron por la tecnolog ía Nucleocounter. Para los cultivos en perfusión de tipo quimiostato, el recuento total de células y el recuento de células en el sobrenadante se midieron por separado para calcular la retención celular relativa. Las velocidades de dilución se midieron y se usaron para calcular las velocidades de crecimiento y las productividades volumétricas.

La velocidad de crecimiento (µ) en el cultivo en quimiostato se calculó usando la ecuación: µ = D + In (X, / XT-1 ) / (t - t.,), en la que D= velocidad de dilución, X,= densidad total de células en el tiempo t, y (t - t.-?) = tiempo entre t y La velocidad de crecimiento (µ) en el cultivo en perfusión de tipo quimiostato se calculó usando la ecuación µ = In (XT / XT-1 ) / (t - t^) + D x (log medio XSN / log medio X)/ ( t - t.i); en la que D = velocidad de dilución, X, = densidad total de células en el tiempo t, (t - t.O = tiempo entre t y t.,, log medio X = media logarítmica de la densidad celular total = (XT - Xt.i) / (In (X,) - In (Xt-i)), y log medio XSN = media logarítmica de la densidad celular de sobrenadante.

La velocidad de retención celular se calculó como = 100 x (1 -XSN / X)[%] La velocidad de crecimiento específica de las células CHO recombinantes que expresaban ADAMTS-1 3 en cultivo en lote fue aproximadamente 0.51 d" 1. Después de cambiar a cultivo quimiostato, se observó un descenso en la velocidad de crecimiento específica a menos de 0.30 d"\ lo cual es indicativo de las condiciones limitantes de crecimiento en el medio químicamente definido. Las densidades celulares se equilibraron en el intervalo de 0.8-1 .2X106 células/ml con una velocidad de crecimiento específica de 0.25-0.27 d"1. Bajo tales condiciones de cultivo continuo, se alcanzó el estado de equilibrio (a partir del intervalo 16-36). La productividad media de todos los 4 intervalos a partir del día 09-36 fue de 920 U/l/d.

Como se describió anteriormente, después de la inoculación de la unidad de cultivo con un dispositivo de retención celular en el día 7, las células se cultivaron en modo continuo de tipo quimiostato. Los datos de los cuatro intervalos (d ías 9-1 5; días 16-22; días 23-29; y días 30-36) y los valores medios de los días 9-36 de la Tabla 2.1 se compararon directamente con los datos de cuatro intervalos (días 2-8; días 9-1 5; días 16-22; y d ías 23-29) y el valor medio de los días 2-29 de la Tabla 2.2.

El cultivo en perfusión de tipo quimiostato se operó después (sin un quimiostato como referencia) para otros 3 intervalos (días 30-36; días 37-43, y días 44-49) para demostrar la estabilidad a largo plazo de los cultivos en perfusión de tipo quimiostato. Los valores medios de las 7 semanas de cultivo continuo se proporcionan en la Tabla 2.2 (media de los días 2-49).

Debido a la retención celular, la densidad celular en los cultivos en perfusión aumentó. Sin embargo debido a la velocidad de retención celular relativamente baja (media de los días 02-29: 61 %, media de los días 02-49: 68%. intervalo 38% -72%), las densidades celulares se mantuvieron en un nivel relativamente bajo de <5x10e células/ml (media de días 02-49 = 3.49X106 células/ml). La velocidad de dilución máxima de aproximadamente 0.60 d"1 se alcanzó en el 3er intervalo y después se mantuvo constante entre 0.55 d"1 a 0.60 d' 1 hasta el final del experimento (media de los días 02-49: 0.55 d"1 ).

La velocidad de retención celular baja también permitió a las células mantener un ritmo constante de crecimiento específico de 0.16 a 0.26 d" 1 (media de los d ías 02-49: 0.22d" 1) sin dar lugar a densidades celulares excesivas. A pesar de la productividad específica reducida (por ejemplo 595 mU/E06/d vs 799 mU/E06/d) la productividad volumétrica se incrementó en más del 90% de 920 U/l/d a 1807 U/l/d (media de los 4 primeros intervalos), debido a la densidad celular aproximadamente 2.8X más alta. La productividad del cultivo de tipo quimiostato se mantuvo relativamente estable en el intervalo de 1 500-1600 U/l/d para los 3 intervalos adicionales.

Como en el Ejemplo 1 , se demostró que este enfoque de la estabilización de cultivos continuos en suspensión con una velocidad de retención celular baja puede compensar las desventajas de limitaciones de crecimiento severas bajo determinadas condiciones de cultivo (por ejemplo, al usar los medios químicamente definidos) . En consecuencia, el control de la retención celular permite que el cultivo se mantenga en densidades celulares relativamente moderadas y a velocidades de dilución relativamente bajas y constantes. Además, debido a la velocidad de retención celular relativamente baja, el cultivo retuvo más de las características de un cultivo en suspensión continua, como se muestra, por ejemplo, por las velocidades de crecimiento específicas.

Todas las patentes, publicaciones de patentes, y otras publicaciones mencionadas en la presente se incorporan por este medio como referencia, en la misma medida como si cada publicación, patente o publicación de patente individual se indicara de manera específica e individualmente y se incorporara como referencia.

Ciertas modificaciones y mejoras se producirán por aquellos con experiencia en la materia a partir de la lectura de la descripción anterior. Se debe entender que todas las modificaciones y mejoras se eliminaron en la presente por razones de concisión y legibilidad. No obstante, tales modificaciones y mejoras se contemplan como dentro del alcance de la presente invención y están apropiadamente dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (20)

REIVI N DICAC ION ES

1 . Un método para producir un polipéptido y/o virus de interés en un cultivo celular continuo, dicho método comprende (a) cultivar células de mam íferos que expresan el polipéptido y/o virus de interés en un sistema de cultivo celular continuo, en donde dicho sistema de cultivo celular comprende un dispositivo de retención celular y tiene una velocidad de dilución (D) de menos que 2 d"1 y una densidad celular de menos que 2 X 107 célula/ml; y (b) recuperar dicho polipéptido y/o virus de interés del medio que se elimina de dicho sistema de cultivo celular.

2. El método de la reivindicación 1 , en donde dicho dispositivo de retención celular produce una velocidad de retención celular de menos que 90%.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha velocidad de dilución es entre 0.1 y 1 .0 d' 1.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha densidad celular es menor que 1 X 107 célula/ml.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho sistema de cultivo celular tiene una relación de la velocidad de dilución y la velocidad de crecimiento específica (D/µ) entre 1 .2 y 5.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho sistema de cultivo celular tiene una velocidad de crecimiento específica de entre 0.2 d" 1y 0.8 d' 1.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas células se cultivan en dicho sistema de cultivo celular por más de 20 días.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas células se cultivan en dicho sistema de cultivo celular por más de 40 días.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas células se cultivan en dicho sistema de cultivo celular por más de 50 d ías.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha velocidad de dilución y dicha densidad celular se mantiene por al menos 80 % del tiempo en que las células se cultivan en dicho sistema de cultivo celular.

1 1 . El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho dispositivo de retención celular comprende un microportador macroporoso.

1 2. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas células se cultivan en un medio libre de suero.

1 3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas células se cultivan en al menos 250 I del medio.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas células son células independientes de anclaje.

1 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende, antes de la etapa de cultivo, pre-cultivar las células en suspensión.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas células se modifican genéticamente para expresar dicho polipéptido y/o virus de interés.

17. El método de la reivindicación 1 6, en donde dichas células son células CHO.

18. El método de la reivindicación 16, en donde dicho polipéptido es una proteína similar a la desintegrina y metalopeptidasa con trombospondina de tipo 1 , motivo 1 3 (ADA TS1 3).

19. Una composición que comprende un polipéptido y/o virus de interés producido de acuerdo con el método de cualquiera de las reivind icaci o nes a nteriores .

20. Una composición que comprende una proteina ADAMTS13 recombinante producida de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.