CN105779392A - 一种巨噬细胞培养基及培养方法 - Google Patents

一种巨噬细胞培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种巨噬细胞培养基及培养方法。所述巨噬细胞培养基，含有DMEM培养基、FBS、GM‑CSF、脂多糖和白介素‑14。所述巨噬细胞的培养方法，使用本发明巨噬细胞培养基、微载体和摇袋式细胞培养生物反应器培养巨噬细胞。本发明巨噬细胞培养基及培养方法可以缩短培养时间，减少人力资源消耗，能多大规模培养巨噬细胞。

Description

一种巨噬细胞培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种巨噬细胞培养基及培养方法。
背景技术
巨噬细胞是三大抗原提呈细胞之一，是参与非特异和特异性免疫的重要细胞。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。由于巨噬细胞具有较强的吞噬功能以及抗原提呈功能，所以在免疫学上具有较大的研究价值。
由于培养条件的限制，要获得大量的巨噬细胞非常困难，更是缺少大规模培养巨噬细胞的方法，限制了巨噬细胞的应用。现有技术中培养巨噬细胞的方法如下：分离外周血中的单个核细胞(PBMC)，将PBMC使用含有30ng/mLGM-CSF(粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子)、10％FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养基在37℃、5％CO2的培养箱中培养，使用的培养器皿为T25、T75或者T175的培养瓶，培养7天后收获贴壁细胞，即为巨噬细胞。该现有技术方案对巨噬细胞培养扩增有限，并且是针对小规模培养的方法，不适合大规模培养的需求，在细胞需求量增大时，操作繁琐，耗费大量人力和时间。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种巨噬细胞培养基及培养方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种巨噬细胞培养基，含有DMEM培养基、FBS、GM-CSF、脂多糖和白介素-14(IL-14)。
优选地，所述巨噬细胞培养基含有下述含量的下述组分：
进一步优选地，所述巨噬细胞培养基含有下述含量的下述组分：
进一步优选地，所述巨噬细胞培养基含有下述含量的下述组分：
一种巨噬细胞的培养方法，使用本发明巨噬细胞培养基、微载体和摇袋式细胞培养生物反应器培养巨噬细胞。
优选地，所述巨噬细胞的培养方法，包含以下步骤：
S1、用本发明巨噬细胞培养基重悬PBMC，使PBMC密度为0.5×106-2×106cells/mL，再将其接种于培养瓶，每3-4天换液一次；培养7天后弃去上清，加入胰酶-EDTA消化液消化至细胞完全脱落，加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清液；
S2、用本发明巨噬细胞培养基重悬细胞，调整细胞密度至5×104cells/mL，取4×107个细胞与4g微载体混合，将混合液加入摇袋式细胞培养生物反应器中在37℃、5％CO2条件下培养；20转/分钟培养3小时，50转/分钟培养至第3天，70转/分钟培养至第6天，每3天向反应器中添加100mL培养基；
S3、倒出反应器中的培养基，离心去除上清，PBS清洗2遍后用胰酶-EDTA消化液消化5分钟，加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清，用PBS重悬沉淀，过滤收集滤液即得巨噬细胞。
优选地，所述摇袋式细胞培养生物反应器为25型GE wave摇袋式细胞培养生物反应器。
优选地，所述微载体为Cytodex-1微球载体。
优选地，所述微载体在使用前进行预处理，预处理的方法为将Cytodex-1微球载体用DMEM培养基浸泡过夜。
优选地，所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的质量浓度百分数为0.02％，胰酶的质量浓度百分数为0.25％。
现有的细胞培养方法是使用培养瓶培养，每个培养瓶培养出来的最大细胞数为1×107个，因此如果要获得1×109个细胞，需要大量人力物力和时间，且巨噬细胞难被从培养瓶上消化下来，操作时间长，操作时污染风险大。与现有技术相比，本发明是一种大规模培养巨噬细胞的方法，可以获得109个以上细胞。本发明操作简便，只需要操作一台仪器和一个培养袋，单人就可以操作，可有效的缩短培养时间和操作时间，减少人力物力的浪费。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
实施例1
一种巨噬细胞培养基，含有下述含量的下述组分：DMEM培养基90v/v％，胎牛血清10v/v％，GM-CSF 30ng/mL，脂多糖100μg/L，IL-14 20ng/mL。
一种巨噬细胞的培养方法，使用上述巨噬细胞培养基、微载体和摇袋式细胞生物反应器，具体包括以下步骤：
S1、用淋巴细胞分离液自外周血中分离得到PBMC；用上述巨噬细胞培养基重悬PBMC，使PBMC的密度为0.5×106-2×106cells/mL，将其接种于T75培养瓶，培养7天，每3-4天换液一次；第7天弃去上清，加入胰酶-EDTA消化液消化至细胞完全脱落，加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清液；所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的质量浓度百分数为0.02％，胰酶的质量浓度百分数为0.25％；
S2、提前1天将4g Cytodex-1微球载体用50mL DMEM培养基浸泡过夜；用本发明巨噬细胞培养基重悬细胞，使其密度为5×104cells/mL，取4×107个细胞和微载体混合，将混合液加入25型GE wave摇袋式细胞培养生物反应器中在37℃、5％CO2条件下培养；20转/分钟培养3小时，50转/分钟培养至第3天，70转/分钟培养至第6天，每3天向反应器中添加100mL培养基；
S3、倒出反应器中的培养基，离心去除上清，PBS清洗2遍后用胰酶-EDTA消化液消化5分钟，所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的质量浓度百分数为0.02％，胰酶的质量浓度百分数为0.25％；加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清，用PBS重悬，用70μm孔径的细胞筛网过滤2次，收集滤液即得巨噬细胞。
实施例2
一种巨噬细胞培养基，含有下述含量的下述组分：DMEM培养基75v/v％，胎牛血清25v/v％，GM-CSF 15ng/mL，脂多糖80μg/L，IL-14 10ng/mL。
一种巨噬细胞的培养方法，使用上述巨噬细胞培养基、微载体和摇袋式细胞生物反应器，具体包括以下步骤：
S1、用淋巴细胞分离液自外周血中分离得到PBMC；用上述巨噬细胞培养基重悬PBMC，使PBMC的密度为0.5×106-2×106cells/mL，将其接种于T75培养瓶，培养7天，每3-4天换液一次；第7天弃去上清，加入胰酶-EDTA消化液消化至细胞完全脱落，加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清液；所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的质量浓度百分数为0.02％，胰酶的质量浓度百分数为0.25％；
S2、提前1天将4g Cytodex-1微球载体用50mL DMEM培养基浸泡过夜；用本发明巨噬细胞培养基重悬细胞，使其密度为5×104cells/mL，取4×107个细胞和微载体混合，将混合液加入25型GE wave摇袋式细胞培养生物反应器中在37℃、5％CO2条件下培养；20转/分钟培养3小时，50转/分钟培养至第3天，70转/分钟培养至第6天，每3天向反应器中添加100mL培养基；
S3、倒出反应器中的培养基，离心去除上清，PBS清洗2遍后用胰酶-EDTA消化液消化5分钟，所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的质量浓度百分数为0.02％，胰酶的质量浓度百分数为0.25％；加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清，用PBS重悬，用70μm孔径的细胞筛网过滤2次，收集滤液即得巨噬细胞。
实施例3
一种巨噬细胞培养基，含有下述含量的下述组分：DMEM培养基95v/v％，胎牛血清5v/v％，GM-CSF 50ng/mL，脂多糖160μg/L，IL-14 50ng/mL。
一种巨噬细胞的培养方法，使用上述巨噬细胞培养基、微载体和摇袋式细胞生物反应器，具体包括以下步骤：
S1、用淋巴细胞分离液自外周血中分离得到PBMC；用上述巨噬细胞培养基重悬PBMC，使PBMC的密度为0.5×106-2×106cells/mL，将其接种于T75培养瓶，培养7天，每3-4天换液一次；第7天弃去上清，加入含有胰酶-EDTA消化液消化至细胞完全脱落，加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清液；所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的质量浓度百分数为0.02％，胰酶的质量浓度百分数为0.25％；
S2、提前1天将4g Cytodex-1微球载体用50mL DMEM培养基浸泡过夜；用本发明巨噬细胞培养基重悬细胞，使其密度为5×104cells/mL，取4×107个细胞和微载体混合，将混合液加入25型GE wave摇袋式细胞培养生物反应器中在37℃、5％CO2条件下培养；20转/分钟培养3小时，50转/分钟培养至第3天，70转/分钟培养至第6天，每3天向反应器中添加100mL培养基；
S3、倒出反应器中的培养基，离心去除上清，PBS清洗2遍后用胰酶-EDTA消化液消化5分钟，所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的质量浓度百分数为0.02％，胰酶的质量浓度百分数为0.25％；加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清，用PBS重悬，用70μm孔径的细胞筛网过滤2次，收集滤液即得巨噬细胞。
对比例1
本对比例中采用的巨噬细胞培养基与实施例1相同。本对比例采用如下方法培养巨噬细胞：
S1、用淋巴细胞分离液自外周血中分离得到PBMC；用巨噬细胞培养基重悬PBMC细胞，使PBMC的密度为0.5×106-2×106cells/mL，将其接种于T75培养瓶，培养7天，每3-4天换液一次；第7天弃去上清，加入含有胰酶-EDTA消化液消化至细胞完全脱落，加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清液；所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的质量浓度百分数为0.02％，胰酶的质量浓度百分数为0.25％；
S2’、用巨噬细胞培养基重悬4×107个细胞，使细胞密度为4×104cells/mL，接种于10个T175的培养瓶中，每瓶100mL；每3天给培养瓶中的细胞换液一次，直至第6天；
S3’、弃去培养基，PBS清洗10个T175培养瓶2次，加入胰酶-EDTA消化液消化5分钟，加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清，用PBS重悬即得巨噬细胞。
效果实施例1、细胞计数及细胞活率
对各实施例、对比例中收集的巨噬细胞，采用细胞计数板、台盼蓝染色法进行细胞计数及活力计算，结果如表1-2所示。
表1、各实施例和对比例的细胞增殖结果表
分组 实施例1 实施例2 实施例3 对比例
细胞数量(千万个) 96.2 84.3 86.5 8.1
表2、各实施例和对比例的细胞活率结果表
分组 实施例1 实施例2 实施例3 对比例
细胞活率 98％ 96％ 94％ 86％
由表1可知，对比例1所得的巨噬细胞数仅为8.1千万个，远远少于实施例1-3所得的细胞数。实施例1-3所得的巨噬细胞数量为8.43-9.62亿个，是对比例1所得巨噬细胞数的10倍以上。由表2可知，对比例获得的巨噬细胞的活率为86％，实施例1-3获得的巨噬细胞的活率为94-98％，明显高于对比例获得的巨噬细胞的活率。所以，本发明巨噬细胞培养基及培养方法可以明显促进巨噬细胞的增殖。
效果实施例2、流式检测
将各实施例和对比例收集的巨噬细胞用流式仪分析其中CD14+细胞的表达量。结果如表3所示。
表3、细胞流式数据对比
分组 实施例1 实施例2 实施例3 对比例
CD14+含量 96％ 94％ 96％ 62％
CD14是巨噬细胞的特异性表面标志物，其阳性比例越高，代表细胞中巨噬细胞的含量越高。由表3可知，实施例1-3获得的细胞中CD14+细胞的含量为94-96％，对比例1获得的细胞中CD14+细胞的含量为62％。实施例1-3获得细胞中CD14+细胞的含量明显高于对比例1获得细胞的CD14+细胞含量，约为对比例1获得细胞中CD14+细胞含量的1.5倍。因此，本发明巨噬细胞培养基及培养方法获得的巨噬细胞的纯度更高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种巨噬细胞培养基，其特征在于，含有DMEM培养基、FBS、GM-CSF、脂多糖和白介素-14。
2.根据权利要求1所述的巨噬细胞培养基，其特征在于，所述巨噬细胞培养基含有下述含量的下述组分：
3.根据权利要求2所述的巨噬细胞培养基，其特征在于，所述巨噬细胞培养基含有下述含量的下述组分：
4.根据权利要求3所述的巨噬细胞培养基，其特征在于，所述巨噬细胞培养基含有下述含量的下述组分：
5.一种巨噬细胞的培养方法，其特征在于，使用本发明巨噬细胞培养基、微载体和摇袋式细胞培养生物反应器培养巨噬细胞。
6.根据权利要求5所述的巨噬细胞的培养方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1、用本发明巨噬细胞培养基重悬PBMC，使PBMC密度为0.5×106-2×106cells/mL，再将其接种于培养瓶，每3-4天换液一次；培养7天后弃去上清，加入胰酶-EDTA消化液消化至细胞完全脱落，加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清液；
S2、用本发明巨噬细胞培养基重悬细胞，调整细胞密度至5×104cells/mL，取4×107个细胞与4g微载体混合，将混合液加入摇袋式细胞培养生物反应器中在37℃、5％CO2条件下培养；20转/分钟培养3小时，50转/分钟培养至第3天，70转/分钟培养至第6天，每3天向反应器中添加100mL培养基；
S3、倒出反应器中的培养基，离心去除上清，PBS清洗2遍后用含有胰酶-EDTA消化液消化5分钟，加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清，用PBS重悬沉淀，过滤收集滤液即得巨噬细胞。
7.根据权利要求5或6所述的巨噬细胞的培养方法，其特征在于，所述摇袋式细胞培养生物反应器为25型GE wave摇袋式细胞培养生物反应器。
8.根据权利要求5或6所述的巨噬细胞的培养方法，其特征在于，所述微载体为Cytodex-1微球载体。
9.根据权利要求8所述的巨噬细胞的培养方法，其特征在于，所述微载体在使用前进行预处理，预处理的方法为将Cytodex-1微球载体用DMEM培养基浸泡过夜。
10.根据权利要求6所述的巨噬细胞的培养方法，其特征在于，所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的质量浓度百分数为0.02％，胰酶的质量浓度百分数为0.25％。
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