CN109749984A - 一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺，包括以下步骤：(1)浸润片状载体；(2)接种并培养贴壁细胞；(3)消化细胞，对片状载体袋内的细胞进行1‑15次短时消化：(3.1)第一次消化；(3.2)多次消化；(4)转移。本发明能将片状载体上的细胞消化，并放大培养；细胞消化后分离简单，直接放出消化好的细胞悬液即可；同时采用1‑15次短时消化片状载体上的细胞，解决细胞内外表面消化时间不同步的问题，可以收获更多的细胞和保持收获的细胞有较高的活性。

Description

一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体的说是涉及一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺。

背景技术

片状载体培养细胞的工艺，发展至今，已非常成熟。但片状载体培养细胞有非常大的局限性。不能连续放大培养。主要原因在于片状载体消化困难。

微载体培养细胞的工艺，发展至今，也已经非常成熟。相对于片状载体消化困难，在这方面有它独到的优势。但消化后，细胞和微载体的分离，也是相当困难。不配备相应的分离设备，根本无法分离。

市场上产品消化转移放大能力有限，且污染风险较高。如方瓶转瓶，细胞工厂。而市场上类似产品微载体的消化转移放大过程中，细胞和微载体难以分开。目前市场上无片状载体消化转移放大的工艺。由于片状载体是一种提供3D结构表面积的介质，导致细胞消化时，载体内部和外部细胞消化的时间不同步。同时片状载体的3D结构，使得消化后的细胞难以掉落和分散均匀。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺，包括以下步骤：

(1)浸润片状载体：将10％DMEM加入到片状载体袋并使其达到工作体积，通5％CO2的混合气体后，将片状载体袋放入摇床，平衡时间在10h以上，以便浸润片状载体；设定摇床：温度为37℃，摇摆速度10rpm，摇床角度7°；

(2)接种并培养贴壁细胞：

(2.1)接种细胞浓度1-9E+5个/ml；

(2.2)接种参数：温度37℃，摇摆速度2-55rpm，摇床角度2-15°，5％CO2的混合气体；

(2.3)混匀：向步骤(1)中平衡后的片状载体袋接种细胞后，片状载体袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞；将片状载体袋置于摇床上，同时通5％CO2的混合气体后，混匀2-100分钟；摇床设置：摇摆转速2-55rpm，温度37℃，摇床角度2-15°；

(2.4)细胞贴壁：混匀后静置培养0.1-2h观察袋内液体澄清；

(2.5)细胞培养：袋内澄清后，摇床设置为摇摆转速设为10rpm，温度37℃，摇床角度7°，通5％CO2的混合气体；自第二天开始，每天取样测糖浓度，并计算日糖耗，维持糖浓度在1.0g/L以上；

(3)消化细胞

当细胞生长到一定天数，日糖耗在2-10g/L时，对片状载体袋内的细胞进行1-15次短时消化：

(3.1)第一次消化：加入PBS清洗2次后，以浸润片状载体为标准向片状载体袋内加入0.01-0.5％的胰酶，消化1-60min后轻拍袋子使细胞从片状载体上脱落，然后加10％血清培养基中和，轻拍袋子多次，使细胞进一步脱落并分散均匀，且大多数为单个形态，直接从袋内放出细胞悬液并收集即可，加入PBS清洗1次，放出含细胞的PBS液并收集；取样，细胞分散程度观察，用台盘蓝对细胞染色并细胞计数和计算细胞活率；

(3.2)多次消化：以浸润载体为标准向(3.1)中消化后的片状载体袋内加入0.01-0.5％的胰酶，消化1-60分钟后轻拍袋子使细胞从片状载体上脱落，然后加10％血清培养基中和，轻拍袋子多次，使细胞进一步脱落并分散均匀，且大多数为单个形态，直接从袋内放出细胞悬液并收集即可，加入PBS清洗1次，放出含细胞的PBS液并收集；取样，细胞分散程度观察，用台盘蓝对细胞染色并细胞计数和计算细胞活率，多次重复本实验步骤；

(4)转移：将步骤(3)消化后细胞活率在90％以上的细胞混合，并计算细胞总细胞数；将细胞悬液以一定细胞的密度接种到已提前平衡过夜的5-15倍体积的片状载体袋或细胞培养器中，或者将细胞悬液和片状载体一起放大接种到5-15倍体积的片状载体袋或细胞培养器中。

上述技术方案中，所述贴壁细胞包括HEK293细胞、VERO细胞、HEK293t细胞、CEF细胞、CHO细胞、BHK细胞、ST细胞、MARC145细胞、PK15细胞和二倍体细胞。

上述技术方案中，所述片状载体袋为装有片状载体的细胞培养袋，所述片状载体的密度为5-100g/L。

上述技术方案中，所述片状载体袋的规格为0.1L-5000L。

上述技术方案中，步骤(3)中对片状载体袋内的细胞进行1-15次短时消化，每次消化的消化时间为1-40min。

进一步的，步骤(3)中对片状载体袋内的细胞进行1-15次短时消化，每次消化的消化时间为5-15min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、能将片状载体上的细胞消化，并放大培养。

2、细胞消化后分离简单，直接放出消化好的细胞悬液即可。

3、采用1-15次短时消化片状载体上的细胞，解决细胞内外表面消化时间不同步的问题，可以收获更多的细胞和保持收获的细胞有较高的活性。

4、采用片状载体袋作为消化转移的反应器，便于采用轻拍等震动手段，可使消化好的细胞更好悬浮及分散。

附图说明

图1为实施例1中VERO细胞20L片状载体袋日糖耗曲线；

图2为实施例2中CHO细胞20L片状载体袋日糖耗曲线。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本发明是如何实施的。

本发明提供了一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺，包括以下步骤：

(1)浸润片状载体：将10％DMEM加入到片状载体袋并使其达到工作体积，通5％CO2的混合气体后，将片状载体袋放入SKC200摇床，平衡时间在10-16h，以便浸润片状载体；设定摇床：温度为37℃，摇摆速度10rpm，摇床角度7°；

(2)接种并培养贴壁细胞:

(2.1)接种细胞浓度1-9E+5个/ml；

(2.2)接种参数：温度37℃，摇摆速度5-15rpm，摇床角度2-15°，5％CO2的混合气体；

(2.3)混匀：向步骤(1)中的片状载体袋接种细胞后，片状载体袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞；将片状载体袋置于摇床上，同时通5％CO2的混合气体后，混匀2-100分钟；摇床设置：摇摆转速10-30rpm，温度37℃，摇床角度6-9°；

(2.4)细胞贴壁：混匀后静置培养0.1-2h观察袋内液体澄清；

(2.5)细胞培养：袋内澄清后，摇床设置为摇摆转速设为10rpm，温度37℃，摇床角度7°，通5％CO2的混合气体；自第二天开始，每天取样测糖浓度，并计算日糖耗，当糖浓度低于1g/L时，换液；

(3)消化细胞

当细胞生长到一定天数，日糖耗在2-10g/L时，对片状载体袋内的细胞进行1-15次短时消化：

(3.1)第一次消化：加入PBS清洗2次后，以浸润片状载体为标准向片状载体袋内加入0.01-0.5％的胰酶，消化1-60min后轻拍袋子使细胞从片状载体上脱落，然后加10％血清培养基中和，轻拍袋子多次，使细胞进一步脱落并分散均匀，且大多数为单个形态，直接从袋内放出细胞悬液并收集即可，加入PBS清洗1次，放出含细胞的PBS液并收集；取样，细胞分散程度观察，用台盘蓝对细胞染色并细胞计数和计算细胞活率；

(3.2)多次消化：以浸润载体为标准向(3.1)中消化后的片状载体袋内加入0.01-0.5％的胰酶，消化1-60分钟后轻拍袋子使细胞从片状载体上脱落，然后加10％血清培养基中和，轻拍袋子多次，使细胞进一步脱落并分散均匀，且大多数为单个形态，直接从袋内放出细胞悬液并收集即可，加入PBS清洗1次，放出含细胞的PBS液并收集；取样，细胞分散程度观察，用台盘蓝对细胞染色并细胞计数和计算细胞活率，多次重复本实验步骤；

(4)转移：将步骤(3)消化后细胞活率在90％以上的细胞混合，并计算细胞总细胞数；将细胞悬液以一定细胞的密度接种到已提前平衡过夜的5-15倍体积的片状载体袋或细胞培养器中，或者将细胞悬液和片状载体一起放大接种到5-15倍体积的片状载体袋或细胞培养器中。

其中，步骤(3)中对片状载体袋内的细胞进行1-15次短时消化，每次消化的消化时间优选为1-40min，更进一步的，每次消化的消化时间5-15min。

本发明中，所述贴壁细胞包括HEK293细胞、VERO细胞、HEK293t细胞、CEF细胞、CHO细胞、BHK细胞、ST细胞、MARC145细胞、PK15细胞和二倍体细胞。

本发明中，所述片状载体袋为装有片状载体的细胞培养袋，片状载体的密度为5-100g/L。所述片状载体袋结合摇床的使用方式为专利名称为一种连续大规模生产重组腺病毒的方法、专利申请号2018108834940.0中所公开的使用方式：将细胞培养袋放置在摇床的托盘上，并通过三气控制器给细胞培养袋通气；细胞培养袋内填充有的片状载体为专利名称为用于细胞培植的一次性固定床装置、专利申请号为201820246494.5中所公开的细胞载体，包含有若干个呈弧型连接的片状纤维叶片，且所述的若干个呈弧型连接的片状纤维叶片呈向外辐射张开设置。

本发明中，所述片状载体袋的规格为0.1L-5000L。

本发明中，步骤(3)消化细胞中，对消化后的袋子进行有效的震动。可以是拍打，也可以采用蠕动泵快速进液-出液循环吹打或者使用设备震动。

实施例1

本实施例以VERO细胞的消化转移为例。

实验材料：

3L载体培养袋:1个；10％DMEM：6L；0.25％胰酶:500mL；PBS:2L；水浴锅：一台；SKC200系列的摇床；血球计数板；台盼蓝；EP管。

贴壁细胞：VERO细胞。

实验方法：

1、平衡：将10％DMEM加入到1L片状载体袋，通5％CO2的混合气体，然后将片状载体袋放入SKC200摇床，平衡时间在10小时以上，以便浸润片状载体。设定摇床：温度为37℃，摇摆速度10rpm，摇床角度7°。

2、接种VERO细胞：

2.1将方瓶中消化后的细胞接种到片状载体袋中，细胞个数3.6E+8个，接种浓度3.6E+5个/ml，工作体积1L。

2.2接种参数：温度37℃，摇摆速度10rpm，摇床角度7°，5％CO2的混合气体。

2.3混匀：向平衡后的片状载体袋中接种VERO细胞后，片状载体袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞。将片状载体袋放摇床上，通5％CO2的混合气体，混匀15-25分钟。摇摆转速20rpm。温度37℃.摇床角度7°。

2.4细胞贴壁：静置培养30min后片状载体袋内液体澄清。

2.5细胞培养：片状载体袋澄清后，摇摆转速设为10rpm，温度37℃，摇床角度7°，5％CO2的混合气体。自第二天开始，每天取样测糖浓度，计算日糖耗；当糖浓度低于1g/L时，换液。

3、消化细胞：VERO细胞日糖耗到6.36g/天时，放出培养基，进行1-15次短时消化：

3.1第一次消化：加入PBS清洗2次。以浸润载体为标准加入0.25％的37℃胰酶，消化12分钟后轻拍袋子使细胞从载体上脱落，加10％血清培养基中和，轻拍袋子多次，使细胞进一步脱落并分散均匀，且大多数为单个形态，直接从袋内放出细胞悬液并收集即可，加入PBS清洗1次，放出含细胞的PBS液并收集。取样，细胞分散程度观察。收获结果：第一次消化收获的细胞分散度较好。有少量成团。用台盘蓝对细胞染色并细胞计数，细胞数为1.5E+9个。计算细胞活率99.2％。然后按第一次消化步骤重新消化2次。

3.2第二次消化，细胞分散程度观察：收获的细胞分散度较好。有少量成团。用台盘蓝对细胞染色并细胞计数，计数为：2.61E+9个，活率为98.5％。

3.3第三次消化，细胞分散程度观察：收获的细胞分散度较好。有少量成团。用台盘蓝对细胞染色并细胞计数为2.02E+9个，活率为95.8％。

4、转移：将细胞活率在90％以上的细胞混合，并计算细胞总数：6.13E+9个。将细胞悬液，接种到已提前平衡过夜的20L片状载体袋中。具体步骤同3L片状载体袋。观察细胞贴壁情况：50分钟后，袋内澄清。

5、细胞生长环境监测。每天测生长液的糖浓度等，计算日糖耗，如图1所示。根据糖浓度等进行灌加培养。灌加时，糖浓度维持在1.0g/L以上。

实施例2：

本实施例以CHO细胞的消化转移为例，其它贴壁细胞消化时间类似。

1、细胞接种参数(细胞个数3.6E+8个，接种浓度3.6E+5个/ml。工作体积1L)与实施例1有细微区别，实验材料，接种方法除细胞为CHO细胞外均按实施例1进行。

2、当日糖耗在8.24g时消化CHO细胞，消化步骤同实施例1中步骤(3)。消化结果：第一次消化收获的细胞分散度较好。有少量成团。用台盘蓝对细胞染色并细胞计数，细胞数为2.06E+9个。计算细胞活率98.7％。然后按第一次消化步骤重新消化2次。第二次消化，细胞分散程度观察：收获的细胞分散度较好。有少量成团。用台盘蓝对细胞染色并细胞计数，计数为：3.46E+9个，活率为98.5％。

第三次消化，细胞分散程度观察：收获的细胞分散度较好。有少量成团。用台盘蓝对细胞染色并细胞计数为2.44E+9个，活率为96.8％。

将细胞活率在90％以上的细胞混合，并计算细胞总数：7.96E+9个。将细胞悬液，接种到已提前平衡过夜的20L片状载体袋中，观察细胞贴壁情况：50分钟后，袋内澄清。每天测生长液的糖浓度等，计算日糖耗，如图2所示。根据糖浓度等进行灌加培养。灌加时，糖浓度维持在1.0g/L以上。

本发明中，其它的贴壁细胞，如HEK293细胞、HEK293t细胞、CEF细胞、BHK细胞、ST细胞、MARC145细胞、PK15细胞和二倍体细胞等均可通过实施例1中利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺进行消化转移放大。

实施例3

本实施例探索利用片状载体进行消化转移时，VERO细胞消化时间。

1实验材料：

VERO细胞糖耗在4-8g/天的3L载体培养袋1个；SKC200摇床1台；三通瓶3个；鲁尔接头取样器10个；PBS溶液2L，自配；血球计数板：上海血精；台盘蓝溶液；0.25％胰酶500mL；10L废液收集瓶一个。

2.实验方法：

2.2准备工作

将2LPBS溶液的三通瓶与载体培养袋连接，500mL0.25％胰酶三通瓶与载体细胞培养袋连接。然后一起放到37℃控温摆床。

2.2消化：

VERO细胞日糖耗到4.94g/天时。放出培养基，加2LPBS清洗3次。再加500mL胰酶，温度37℃，摇摆速度30rpm进行消化。每5min取样一次。台盘蓝染色，细胞计数。

3.实验结果：

VERO细胞在日糖耗为4.94g时的消化结果，见表1所示。取样细胞来自细胞袋。

表1片状载体袋内消化VERO细胞时间和细胞数量统计表

由表1可知，利用片状载体进行消化转移时，VERO细胞单次消化时间在5-60min时，细胞的活性在95％以上，1-15min及35min时，细胞的活性为100％，根据实验操作及细胞收获综合考虑，优选单次消化时间1-40min，更为优选的为5-15min。本发明采用1-15次短时消化片状载体上的细胞消化，解决细胞内外表面消化时间不同步的问题。可以收获更多的细胞和保持收获的细胞有较高的活性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (6)

1.一种利用片状载体袋进行细胞消化转移的放大工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)浸润片状载体：将10％DMEM加入至片状载体袋并使其达到工作体积，通5％CO2的混合气体后，将片状载体袋放入摇床，平衡时间在10h以上，以便浸润片状载体；设定摇床：温度为37℃，摇摆速度10rpm，摇床角度7°；

(2)接种并培养贴壁细胞:

(2.1)接种细胞浓度1-9E+5个/ml；

(2.2)接种参数：温度37℃，摇摆速度2-55rpm，摇床角度2-15°，5％CO2的混合气体；

(2.3)混匀：向步骤(1)中平衡后的片状载体袋接种细胞后，片状载体袋内浑浊，显微镜下看到大量未贴壁细胞；将片状载体袋置于摇床上，同时通5％CO2的混合气体后，混匀2-100分钟；摇床设置：摇摆转速2-55rpm，温度37℃，摇床角度2-15°；

(2.4)细胞贴壁：混匀后静置培养0.1-2h观察袋内液体澄清；

(2.5)细胞培养：袋内澄清后，摇床设置为摇摆转速设为10rpm，温度37℃，摇床角度7°，通5％CO2的混合气体；自第二天开始，每天取样测糖浓度，并计算日糖耗，维持糖浓度在1g/L以上；

(3)消化细胞

当细胞生长到一定天数，日糖耗在2-10g/L时，对片状载体袋内的细胞进行1-15次短时消化：

(3.1)第一次消化：加入PBS清洗2次后，以浸润片状载体为标准向片状载体袋内加入0.01-0.5％的胰酶，消化1-60min后轻拍袋子使细胞从片状载体上脱落，然后加10％血清培养基中和，轻拍袋子多次，使细胞进一步脱落并分散均匀，且大多数为单个形态，直接从袋内放出细胞悬液并收集即可，加入PBS清洗1次，放出含细胞的PBS液并收集；取样，细胞分散程度观察，用台盘蓝对细胞染色并细胞计数和计算细胞活率；

(3.2)多次消化：以浸润载体为标准向(3.1)中消化后的片状载体袋内加入0.01-0.5％的胰酶，消化1-60分钟后轻拍袋子使细胞从片状载体上脱落，然后加10％血清培养基中和，轻拍袋子多次，使细胞进一步脱落并分散均匀，且大多数为单个形态，直接从袋内放出细胞悬液并收集即可，加入PBS清洗1次，放出含细胞的PBS液并收集；取样，细胞分散程度观察，用台盘蓝对细胞染色并细胞计数和计算细胞活率，多次重复本实验步骤；

(4)转移：将步骤(3)消化后细胞活率在90％以上的细胞混合，并计算细胞总细胞数；将细胞悬液以一定细胞的密度接种到已提前平衡过夜的5-15倍体积的片状载体袋或细胞培养器中，或者将细胞悬液和片状载体一起放大接种到5-15倍体积的片状载体袋或细胞培养器中。

2.根据权利要求1所述的一种利用片状载体袋消化转移的放大工艺，其特征在于，所述贴壁细胞包括HEK293细胞、VERO细胞，HEK293t细胞、CEF细胞、CHO细胞、BHK细胞、ST细胞、MARC145细胞、PK15细胞和二倍体细胞。

3.根据权利要求1所述的一种利用片状载体袋消化转移的放大工艺，其特征在于，所述片状载体袋为装有片状载体的细胞培养袋，所述片状载体的密度为5-100g/L。

4.根据权利要求1所述的一种利用片状载体袋消化转移的放大工艺，其特征在于，所述片状载体袋的规格为0.1L-5000L。

5.根据权利要求1所述的一种利用片状载体袋消化转移的放大工艺，其特征在于，步骤(3)中对片状载体袋内的细胞进行1-15次短时消化，每次消化的消化时间为1-40min。

6.根据权利要求5所述的一种利用片状载体袋消化转移的放大工艺，其特征在于，步骤(3)中对片状载体袋内的细胞进行1-15次短时消化，每次消化的消化时间为5-15min。