CN110124041A - 一种能够抗持留菌和生物膜菌的药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够抗持留菌和生物膜菌的药物组合物及用途，抗持留菌和生物膜菌的药物组合物的活性成分包括：DNA合成抑制剂类抗生素、细胞壁抑制剂类抗生素及蛋白质抑制剂类抗生素中的至少一种；所述药物组合物在制备试剂或试剂盒中的用途为用于杀灭铜绿假单胞菌引起的感染、慢性持续感染及生物膜感染；本发明的药物组合物通过克林沙星与头孢呋辛、庆大霉素的组合，能够快速彻底的清除持续感染肺部的铜绿假单胞菌，对铜绿假单胞菌引起的慢性持续感染及生物膜感染有明显的治疗作用。

Description

一种能够抗持留菌和生物膜菌的药物组合物及其用途
技术领域
本发明属于抗生素领域，特别涉及一种能够抗持留菌和生物膜菌的药物组合物及其用途。
背景技术
铜绿假单胞菌是一种高度耐药的机会性革兰氏阴性菌(Stover et al.2000)，可导致住院患者或免疫系统受损的人发生严重感染。烧伤创口、囊性纤维化、急性白血病、器官移植和静脉吸毒者感染的风险很高(Aloush et al.2006)。由铜绿假单胞菌引起多起院内感染该种案例早有记录((Bodey et al.1983；Cross et al.1983)。
细菌细胞可能由于表观遗传变化而逃避抗生素的作用，这些细胞被称为持留菌(Wood，Knabel，and Kwan 2013)。许多慢性感染与细菌以多细胞聚集的生物膜形式在人体表面和组织中繁殖有关(Costerton，Stewart，and Greenberg 1999a；Wolfmeier etal.2018)，这些以固定菌群的形式及其固有的耐药性是许多持久性和慢性细菌感染的根源。在不断增长的细菌种群中，持留菌的增长速度保持在对数增长中段，最大可达到接近1％的固定增速(Lewis 2008)，直至增殖速度下降，细胞数不再增加的细菌静止期。同样，生长缓慢的细菌生物膜中含有大量的持留菌，生物膜限制了免疫系统的免疫物质进入，以及持续抵抗抗生素攻击，因此无论是静止期细菌或增长期细菌或生物膜菌内菌含有持留菌，可以解释为何慢性感染在体内具有一定的抗性，以及治疗后的频繁复发。
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是肺囊性纤维化(CF)主要的病原体，目前采用最有效的抗生素治疗也无法根除这种持续感染(Costerton.Stewart.and Greenberg 1999b；Hoiby 1993)。这是由于细菌生物膜对抗生素治疗具有耐药性或耐受性，并能逃避宿主免疫防御机制((Costerton，Stewart，and Greenberg 1999b；J W Costerton et al.1995)。根据约翰霍普金斯抗生素指南(2017年约翰霍普金斯医院)：采用高剂量的抗生素组合协同(β-内酰胺类抗生素+氨基糖苷类)可以改善临床上宿主免疫功能不全造成的严重铜绿假单胞菌感染，抗生素组合的结论来源于对囊性纤维化患者的痰中铜绿假单胞菌的检测(Scribner et al.1982)。对于多重耐药的铜绿假单胞菌菌株，可以在上述抗生素组合中添加粘菌素(Florescu et al.2012)。但由于抗生素耐药性的增加，针对铜绿假单胞菌的有效药物种类有限(Rossolini和Mantengoli 2005)，难以有效的根除铜绿假单胞菌，因此需要更好的治疗方法。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种能够抗持留菌和生物膜菌的药物组合物及其用途。
一种能够抗持留菌和生物膜菌的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括：DNA合成抑制剂类抗生素、细胞壁抑制剂类抗生素及蛋白质抑制剂类抗生素中的至少一种，所述细胞壁抑制剂类抗生素包括头孢呋辛，所述蛋白质抑制剂类抗生素包括庆大霉素，所述DNA合成抑制剂类抗生素包括克林沙星。
进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步地，所述药物组合物还包括额外的活性成分，所述额外的活性成分包括细胞膜抑制剂类抗生素、磺胺类药物、RNA合成抑制剂类抗生素和呋喃妥英中的至少一种，所述细胞膜抑制剂类抗生素包括粘菌素，所述磺胺类药物包括磺胺甲恶唑，所述RNA合成抑制剂类抗生素包括利福平。
一种药物组合物在制备能够抗持留菌和生物膜菌的试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或试剂盒包含头孢呋辛、庆大霉素和克林沙星。
克林沙星在制备能够抗持留菌和生物膜菌的试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或试剂盒还包含头孢呋辛和/或庆大霉素。
进一步地，所述试剂或试剂盒用于杀灭铜绿假单胞菌引起的感染、慢性持续感染及生物膜感染，任选地所述感染是肺部感染。
进一步地，所述铜绿假单胞菌包括静止期铜绿假单胞菌、增长期铜绿假单胞菌和铜绿假单胞菌生物膜菌，任选地所述铜绿假单胞菌是铜绿假单胞菌生物膜菌。
一种药物组合物在制备能够抗持留菌和生物膜菌的药物制剂、医疗用品或日用品中的用途，所述药物制剂、医疗器械或日用品均包含上述药物组合物。
一种治疗肺部感染尤其是慢性持续感染及生物膜感染的方法，所述方法包括同时或贯序施用选自下列的抗生素：头孢呋辛、庆大霉素和克林沙星。
进一步地，所述肺部感染由铜绿假单胞菌引起。
本发明的药物组合物通过克林沙星与头孢呋辛、庆大霉素的组合，能够快速彻底的清除造成肺部慢性持续性感染的铜绿假单胞菌，对铜绿假单胞菌引起的持续性肺部感染有明显的治疗作用，有效治疗铜绿假单胞菌引起的肺部囊性纤维化。本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了根据本发明实施例中铜绿假单胞菌的CFU计数值与不同抗生素处理时间的关系图；
图2示出了根据本发明实施例中SYBR Green I/PI法检测活菌占比与绿/红荧光强度比之间的关系线；
图3示出了根据本发明实施例SYBR Green I/PI法测定的活菌与死菌比例图，图3A为活菌与死菌的比例随着药物处理时间延长的变化图，图3B为药物处理10天后，各抗生素对应的活菌与死菌比值柱状图；
图4示出了根据本发明实施例中单一药物与药物组合对静止期细菌和生物膜菌的治疗效果图，图4A为克林沙星联合用药和单一用药对静止期细菌的处理结果，图4B为克林沙星联合用药和单一用药对生物膜菌的处理结果；
图5示出了根据本发明实施例中药物组合物对肺部感染的小鼠模型治疗效果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种能够抗持留菌和生物膜菌的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括：细胞壁抑制剂类抗生素、蛋白质抑制剂类抗生素和DNA合成抑制剂类抗生素中的至少一种。所述细胞壁抑制剂类抗生素优选为头孢呋辛，所述蛋白质抑制剂类抗生素优选为庆大霉素，所述DNA合成抑制剂类抗生素优选为克林沙星。
所述药物组合物还包括额外的活性成分，所述额外的活性成分包括细胞膜抑制剂类抗生素、磺胺类药物、RNA合成抑制剂类抗生素和呋喃妥英中的至少一种，所述细胞膜抑制剂类抗生素优选为粘菌素，所述磺胺类药物优选为磺胺甲恶唑，所述RNA合成抑制剂类抗生素优选为利福平。
本发明提供的药物组合物活性成分包括但不限于以下组合：
克林沙星和头孢呋辛组合，克林沙星和庆大霉素组合，头孢呋辛和庆大霉素组合，头孢呋辛和粘菌素组合，庆大霉素和粘菌素组合，头孢呋辛、庆大霉素和粘菌素组合，克林沙星、庆大霉素和头孢呋辛组合。
优选的，本发明提供的药物组合物的活性成分包括克林沙星、庆大霉素和头孢呋辛。
根据本发明的另一方面，本发明提供的药物组合物可用于制备能够抗持留菌和生物膜菌的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含头孢呋辛、庆大霉素和克林沙星，所述试剂或试剂盒用于杀灭铜绿假单胞菌引起的感染、慢性持续感染及生物膜感染，所述感染优选为肺部感染。
根据本发明的另一方面，克林沙星在制备能够抗持留菌和生物膜菌试剂或试剂盒时，所述试剂或试剂盒还包含头孢呋辛和/或庆大霉素。优选的，所述试剂或试剂盒还包含头孢呋辛和庆大霉素。
根据本发明的另一方面，本发明的药物组合物及药物组合物制备的试剂或试剂盒用于治疗铜绿假单胞菌，所述铜绿假单胞菌包括：静止期铜绿假单胞菌、增长期铜绿假单胞菌和铜绿假单胞菌生物膜。优选地，铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌生物膜。
根据本发明的另一方面，组合药物与药学上可接受的载体或赋形剂结合后也可用于制备能够抗持留菌和生物膜菌药物制剂、医疗用品和日用品中。示例性的：药物制剂包括口服剂，注射剂、吸入剂、膏剂型(体外皮肤黏膜用)、肠道给药剂等制剂；医疗用品包括导管、支架、封堵器、雾化器等用于输送、释放药物组合物的用品；日用品包括消毒剂、洗手液等用品。
由头孢呋辛、庆大霉素和克林沙星组合的药物可以与药学上可接受的载体或赋形剂进行组合制备成试剂、试剂盒，用于治疗铜绿假单胞菌造成人体不同部位(包括体内及体表)的持续感染。
本发明还提供了一种治疗肺部感染的方法，其中肺部感染主要为铜绿假单胞菌引起的慢性持续性肺部感染，具体的，治疗方法包括同时或贯序施用选自下列的抗生素：头孢呋辛、庆大霉素和克林沙星。
通过以下实施例对各药物及药物组合物治疗铜绿假单胞菌进行示例性说明。
实施例
准备菌株、抗生素和培养基：
菌株采用铜绿假单胞菌PAO-1型号的菌株；培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，菌落形成单位(CFU)计数培养板为胰蛋白胨大豆琼脂板(TSA)；抗生素为选用头孢呋辛、粘菌素、庆大霉素、克林沙星、利福平、磺胺甲恶唑、呋喃妥英抗生素原液后，稀释于各抗生素对应的溶剂中，形成10mg/ml的抗生素溶液。
菌株培养：在TSB中放入PAO-1菌株，在恒温37℃、转速200rpm的条件下，培养过夜，确保菌株大量繁殖后，得到静止期铜绿假单胞菌，所得到的静止期铜绿假单胞菌株中会存在持留菌。将各种抗生素(25μM)分别加入到500μL静止期铜绿假单胞菌的培养液中，在37℃下静置培养。
在本发明实施例所进行的实验中均采用上述抗生素溶液和细菌菌株。
实施例1测试单组分药物对静止期铜绿假单胞菌灭活能力。
本实施例中采用CFU计数法和SYBR Green I/PI法分别进行药物灭活能力检测。菌落形成单元法(CFU)测定琼脂平板上生长的活细胞数，是评价抗生素杀灭静止期细菌能力最常用的判断方法。但CFU计数法的一个主要缺点是细菌在琼脂平板上生长的时间很长(1-3天)，而且没有计入在菌落数中存活但不能培养的细菌亚群。
为了更快速地量化药物治疗后活细胞的数量，本实施例还采用了SYBR Green I/PI法(Klockgether et al.2010)来评估铜假绿单细胞均的抗生素敏感性(Feng etal.2014)。SYBR Green I是一种渗透性染料，可将所有活细胞染成绿色，而PI是一种不渗透性染料，可将受损的细胞膜染成红色(Nicoletti et al.1991)，利用荧光显微镜或荧光微平板阅读器可以通过细菌染色后呈现的不同颜色来测量细菌样本的活/死比。因此通过SYBR Green I/PI法与CFU计数法同时进行检测，以获取最准确的实验结果。
CFU计数法：选用50μL添加了抗生素培养液的悬浮液，将悬浮液涂覆到TSA板上，再将涂覆后的TSA板恒温37℃下过夜培养。在抗生素添加后的第2、4、6和10天，用CFU计数法测定活菌细胞数量。
SYBR Green I/PI法：每次测定时，将SYBR Green I核酸染料与PI染料按照1:3的比例混合后，加入到100μl的蒸馏水中形成混合染料。将经过抗生素处理的铜绿假单胞菌培养液利用新鲜的TSB进行稀释，其中培养液与新鲜TSB的比例为1:50。将10μl的SYBR GreenI/PI混合染料加入到100μl的新鲜TSB稀释后培养液中，每个抗生素对应的培养液经过染料混合后在室温无光条件下培养20min，培养后将每组抗生素样品转移至96孔板中。再分别以485nm、538nm和612nm为激发波长进行绿光和红光激发，利用BioTek仪器(VT，USA)的Synergy H1荧光微板阅读器测定每个样品的绿色和红色荧光强度。在抗生素添加后的第2、4、6和10天，均采用上述实验过程进行测定。
为了制定活菌比例与红/绿荧光比之间的回归方程与回归曲线，制备了不同比例的活细菌和70％异丙醇灭活细菌：0:10、1:4、5:5、4:1和10:0，所用的活菌与灭活菌混合前均采用新鲜的TSB溶液稀释50倍。将各比例的活/灭活铜绿假单胞菌与SYBR Green I/PI染料混合注入96孔板各孔中，测定各比例的绿/红荧光比，用最小二乘拟合分析生成标准曲线和方程。再利用所得标准方程计算实验中不同抗生素作用下的铜绿假单胞菌的活细胞百分率。使用Keyence BZ-X710荧光显微镜对活细胞和死细胞进行荧光成像，并使用Keyence提供的BZ-X分析仪进行处理。
实验结果：用CFU计数法测定结果如图1所示，示出了10天内不同抗生素对静止期铜绿假单胞菌CFU值的影响图。由图1可知2天后，克林沙星对静止期细菌的灭活能力最高，培养板中CFU为0。头孢呋辛和粘菌素、磺胺甲恶唑对静止期细菌的灭活能力均高于无药对照组，庆大霉素、利福平、呋喃妥英对静止期铜绿假单胞菌的灭活能力较差。
SYBR Green I/PI法测定不同比例的活菌与灭活菌的荧光结果如图2，图2依据荧光显微镜下不同比例的活细菌和70％异丙醇灭活细菌所显示的绿/红荧光强度比值，拟合出活菌占比与绿/红荧光强度比之间的关系图，由图2可知铜绿假单胞菌PAO-1型活菌占比与绿/红荧光比值之间呈线性关系。
SYBR Green I/PI法测定本实施例中不同抗生素处理下的结果如图3，在第2、4、6和10天分别用SYBR Green I/PI对96孔板上对培养的细菌进行染色后，测定得到绿/红荧光比即活菌与死菌的数量比与药物作用时间的关系如图3所示。在图3中，图3A为活菌与死菌的比例随着药物处理时间延长的变化图，图3B为药物处理10天后，各抗生素对应的活菌与死菌比值柱状图。
由图3A可知SYBR Green I/PI法测定的各抗生素作用下的活菌与死菌数量比与时间关系图与CFU法测定的关系图变化一致。由图3A可知头孢呋辛、粘菌素、磺胺甲恶唑和克林沙星对铜绿假单胞菌的灭活能力最好；庆大霉素、利福平和呋喃妥英的灭活能力较差。
由抗生素处理10天后在荧光显微镜下观察各抗生素组的荧光图，结果表明经过头孢呋辛、粘菌素、克林沙星和磺胺甲恶唑处理的静止期细菌有较大的死亡，剩余活菌数量较少，而庆大霉素、利福平和呋喃妥英处理后，依然有较多的细菌存活。荧光显微镜下的结果与图3的结论相符，说明SYBR Green I/PI法能够准确测定出铜绿假单胞菌存活情况。
根据图2中拟合出活菌占比与绿/红荧光强度比之间的回归方程，可依据不同抗生素组中绿/红荧光强度的比值计算出各抗生素处理后的铜绿假单胞菌活菌比例，得到如表1所示的结果。
表1抗生素处理10天后剩余铜绿假单胞菌活菌的数量(抗生素浓度：25μM)
抗生素名称 剩余活菌比例(％)
未使用抗生素的空白对照组 58.096
粘菌素(Coli) 11.696
头孢呋辛(Cef) 15.456
克林沙星(Clin) 18.016
磺胺甲恶唑(Sul) 18.096
庆大霉素(Gen) 20.976
利福平(Rif) 22.096
呋喃妥英(Nit) 25.296
实验结论:无论采用CFU计数法还是采用SYBR Green I/PI法，均可得出各抗生素对静止期铜绿假单胞菌的灭活能力排序为克林沙星>粘菌素>庆大霉素>头孢呋辛>磺胺甲恶唑>利福平>呋喃妥英。
实施例2测试单组分药物对增长期铜绿假单胞菌灭活能力。
通过文献表明最低抑菌浓度(MIC)值较低的抗生素对增长期细菌有较强灭活作用(Zhang 2005；Niu，Cui，Yee，et al.2015；Niu，Cui，Shi，et al.2015)，即可通过最低抑菌浓度(MIC)值来测试各药物对增长期细菌的灭活能力。
实验过程：将96孔板的各孔中均加入90μL新鲜的TSB培养液，再将10μL含有1*109个铜绿假单胞菌接种到每孔中的TSB培养液中，将浓度为10mg/ml各抗生素溶液连续稀释至16，8，4，2，1和0μg/mL，将稀释后不同浓度的同种抗生素分别添加到接种后的96孔板中，每种抗生素对应不同的浓度均重复2到3次，即16μg/mL的头孢呋辛加入到96孔板的2个或3个孔内，8μg/mL的头孢呋辛加入到96孔板的2个或3个孔内，其余浓度的其他抗生素同样如此。将96孔板恒温37℃下静置过夜，测定各抗生素对铜绿假单胞菌抑制增长的MIC值。
实验结果：各抗生素的MIC值如表2所示：
表2六类抗生素的MIC值
抗生素种类 抗生素名称 MIC(μg/mL)
细胞壁抑制剂 头孢呋辛 16
细胞膜抑制剂 粘菌素 4
蛋白质合成抑制剂 庆大霉素 1
DNA合成抑制剂 克林沙星 1
RNA合成抑制剂 利福平 16
磺胺类药物 磺胺甲恶唑 16
呋喃妥因 呋喃妥因 >16
由表2可知，粘菌素和克林沙星在处理铜绿假单胞菌PAO-1菌株MIC值最低，说明粘菌素和克林沙星均能够有效抑制增长期的细菌。而庆大霉素对增长期细菌有较强的抑制作用，但对静止期细菌活性抑制作用较差。头孢呋辛和磺胺甲恶唑对增长期细菌抑制作用较弱，利福平和呋喃妥因对增长期细菌没有较为明显的抑制作用。
综合实施例1和实施例2的结果可知，在各类抗生素中，对铜绿假单胞菌的静止期细菌和增长期细菌治疗作用较强的为头孢呋辛、粘菌素、庆大霉素和克林沙星。
实施例3测试组合药物对铜绿假单胞菌生物膜的灭活能力：
铜绿假单胞菌生物膜的制备：首先将铜绿假单胞菌PAO-1菌株接种于5ml新鲜TSB培养液中，静置过夜，得到含有持留菌的静止期细菌，将静止期细菌按1：100的比例稀释在新鲜TSB培养液中，选取100μl稀释后的细菌液放入到96孔板的各孔内，将96孔板盖好后置于恒温37℃下静置过夜。铜绿假单胞菌聚集形成的生物膜会附着于平板底部，除去96孔板各孔中的上清液，得到位于96孔板底部完整的生物膜，铜绿假单胞菌生物膜中含有能够持续感染的持留菌。
实验过程：选用克林沙星、头孢呋辛、庆大霉素和粘菌素分别进行组合得到三联用药：克林沙星+头孢呋辛+庆大霉素、头孢呋辛+庆大霉素+粘菌素和多组两组用药：头孢呋辛+庆大霉素、头孢呋辛+粘菌素、克林沙星+头孢呋辛、克林沙星+庆大霉素、庆大霉素+粘菌素。将各组合药物和单一药物分别加入到含有持留菌的静止期铜绿假单胞菌的培养液中，在37℃下静置培养，用药2天和4天后进行CFU计数。
将各组合药物和单一药物采用MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)缓冲液(1X)(由Sigma-Aldrich原料稀释至10X MOPS，再稀释至1X)配制成最终药物浓度，将配置好的药物添加至底部附着有铜绿假单胞菌生物膜的96孔板中，用药2天和4天后进行CFU计数，每次铺平板计数前用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗生物膜。
实验结果：各药物组合及单一药物对静止期细菌和细菌生物膜处理后的CFU值如图4所示，在图4中图4A为克林沙星联合用药和单一用药对静止期细菌的处理结果，图4B为克林沙星联合用药和单一用药对细菌生物膜的处理结果。由图5A可知，只有克林沙星作为单一药物在4天后完全将109CFU的静止期细菌消灭，而粘菌素、头孢呋辛和庆大霉素单一药物只能将109CFU的细菌降低至107CFU左右。对于组合药物，庆大霉素+粘菌素的组合在4天后完全杀灭细菌，头孢呋辛+庆大霉素+克林沙星组合能够在2天后完全杀灭静止期细菌。
由图4B可知，单一药物中只有克林沙星能够在4天后杀灭铜绿假单胞菌生物膜，而对于药物组合，庆大霉素+克林沙星的组合能够在4天后杀灭铜绿假单胞菌生物膜，头孢呋辛+庆大霉素+克林沙星组合能够在2天后完全杀灭铜绿假单胞菌生物膜。在单一药物或者没有克林沙星的两种药物组合中，只能够消灭生物膜中103CFU/ml的细菌，而含有克林沙星的两种药物组合只剩余了102CFU/ml的细菌，消灭了至少107CFU/ml。
因此，克林沙星对杀灭静止期细菌和细菌生物膜的作用较强，且头孢呋辛+庆大霉素+克林沙星组合对治疗静止期细菌和细菌生物膜的效果最好，治疗时间最短。说明克林沙星单独使用即可杀灭体外的铜绿假单胞菌持留菌和生物膜菌，而头孢呋辛+庆大霉素+克林沙星的药物组合能够更快速彻底清除体外的铜绿假单胞菌持留菌和生物膜菌。
综上，本发明实施例抗持留菌和生物膜菌的最佳药物组合物为头孢呋辛+庆大霉素+克林沙星组合，为了验证该联合药物对活体的治疗效果，建立了铜绿假单胞菌持留菌肺部感染的小鼠模型，并对感染的小鼠进行用药治疗，联合药物中头孢呋辛在给药剂量为40mg/kg，庆大霉素给药剂量为30mg/kg，克林沙星给药剂量为40mg/kg。具体过程如实施例4所示。
实施例4组合药物对小鼠模型的治愈测试。
制备小鼠感染的持留菌：将铜绿假单胞菌接种到5ml的TSB培养液中，置于37℃、恒定转速下培养过夜，将培养液在4℃、2700xg的离心力下离心15min，得到含有持留菌的重悬菌体，并将重悬菌体放置在1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。为了造成肺部的持续感染，将浓缩后的重悬菌体与预先加入缓冲液的9ml TSA琼脂培养液在50℃下混合，再加入重矿物油混合，将混合后的细菌嵌入琼脂珠中，用于感染。感染时以C57BL型6只小鼠为试验对象，以107CFU/ml为接种量。
铜绿假单胞菌肺部持续感染的小鼠模型：选用C57BL型6只雄性小鼠(22-22g，6-8周龄)。小鼠感染前，往小鼠的腹腔注射氯胺酮(50mg/ml)和西拉嗪(5mg/ml)，在0.9％NaCl浓度下，以0.002ml/g体重给药。小鼠完全麻醉后，采用仰卧位，将50μl含有细菌悬液(107CFU/ml)的琼脂珠采用气管插管滴注法进入小鼠肺部，对小鼠进行感染。由于使用琼脂珠、矿物油和用于感染的静止期细菌，随着铜绿假单胞菌在肺部的繁殖稳定，会形成含有持留菌的生物膜菌，造成了小鼠难以治愈的持续性肺部感染，小鼠感染后的第3天，小鼠肺部的CFU数值达到最高，至此建立了稳定的持续性肺部感染模型。
药物治疗小鼠的持续性肺部感染：为了测试不同药物和药物组合，对应设置各组小鼠，每组5只，为了验证克林沙星在药物组合中的作用，将左氧氟沙星作为对照进行测试。测试组为：(1)药物空白组即磷酸缓冲液(PBS)组；(2)头孢呋辛(40mg/kg)+庆大霉素(30mg/kg)组；(3)头孢呋辛(40mg/kg)+克林沙星(40mg/kg)组；(4)头孢呋辛(40mg/kg)+庆大霉素(30mg/kg)+左氧氟沙星治疗(40mg/kg)组；(5)克林沙星(40mg/kg)组；(6)头孢呋辛(40mg/kg)+庆大霉素(30mg/kg)+克林沙星(40mg/kg)组。每组小鼠均采用腹腔内治疗，治疗7天后，处死小鼠，无菌环境下切除小鼠全肺后，将肺部匀浆后置于1ml PBS中，稀释至合适浓度后，选取100μl的肺匀浆涂覆在TSA琼脂板上，将涂覆后的TSA琼脂板置于37℃下过夜培养后CFU计数。
治疗结果：各组药物小鼠感染后的第3天，小鼠肺部的CFU数值达到108CFU/g左右的峰值。各组药物的治疗结果如图5所示，对于(1)药物空白组，感染7天后，由于宿主对细菌感染的免疫清除，药物空白组的细菌下降至108CFU/g；对于(2)头孢呋辛+庆大霉素组，细菌由108CFU/g降低至104CFU/g；对于(3)头孢呋辛+克林沙星组和(5)克林沙星组，将细菌降低104或103CFU/g，但不能完全清除感染细菌；只有(6)头孢呋辛+庆大霉素+克林沙星组才能完全清除肺部细菌；(4)头孢呋辛+庆大霉素+左氧氟沙星治疗组无法清除肺部细菌，仍然由近104CFU/g的细菌剩余。
由实验4可知，本发明实施例所采用的药物组合物：头孢呋辛+庆大霉素+克林沙星组合，能够有效治疗铜绿假单胞菌引起的肺部持续感染及生物膜感染，也说明联合药物中克林沙星对持留菌的灭活作用较好。
由上述实施例可得，本发明药物组合的活性成分最佳为孢呋辛、庆大霉素和克林沙星，该种药物组合不仅能够彻底的杀灭静止期和增长期的铜绿假单胞菌，对含有持留菌的铜绿假单胞菌生物膜菌同样能够快速消灭。本发明的药物组合物在生物治疗方面同样具有较好的治疗效果，能够彻底治愈铜绿假单胞菌引起的持续性肺部感染。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种能够抗持留菌和生物膜菌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分包括：DNA合成抑制剂类抗生素、细胞壁抑制剂类抗生素及蛋白质抑制剂类抗生素中的至少一种，所述细胞壁抑制剂类抗生素包括头孢呋辛，所述蛋白质抑制剂类抗生素包括庆大霉素，所述DNA合成抑制剂类抗生素包括克林沙星。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括额外的活性成分，所述额外的活性成分包括细胞膜抑制剂类抗生素、磺胺类药物、RNA合成抑制剂类抗生素和呋喃妥英中的至少一种，所述细胞膜抑制剂类抗生素包括粘菌素，所述磺胺类药物包括磺胺甲恶唑，所述RNA合成抑制剂类抗生素包括利福平。
4.一种药物组合物在制备能够抗持留菌和生物膜菌的试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含头孢呋辛、庆大霉素和克林沙星。
5.克林沙星在制备能够抗持留菌和生物膜菌的试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包含头孢呋辛和/或庆大霉素。
6.根据权利要求4或5的用途，其特征在于，所述试剂或试剂盒用于杀灭铜绿假单胞菌引起的感染、慢性持续感染及生物膜感染，任选地所述感染是肺部感染。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述铜绿假单胞菌包括静止期铜绿假单胞菌、增长期铜绿假单胞菌和铜绿假单胞菌生物膜菌，任选地所述铜绿假单胞菌是铜绿假单胞菌生物膜菌。
8.一种药物组合物在制备能够抗持留菌和生物膜菌的药物制剂、医疗用品或日用品中的用途，其特征在于，所述药物制剂、医疗用品或日用品均包含权利要求1-3任一项的药物组合物。
9.一种治疗肺部感染的方法，其特征在于，所述方法包括同时或贯序施用选自下列的抗生素：头孢呋辛、庆大霉素和克林沙星。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肺部感染由铜绿假单胞菌引起。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117442739A (zh) * 2023-12-26 2024-01-26 苏州大学 一种联合复方药在病原细菌持留感染治疗中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1241405A (zh) * 1999-07-22 2000-01-19 蒋勤 一种强力抗菌药品口服淋霉净
US20170007616A1 (en) * 2014-01-27 2017-01-12 Susanne GARDNER Antimicrobial formulations and applications thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1241405A (zh) * 1999-07-22 2000-01-19 蒋勤 一种强力抗菌药品口服淋霉净
US20170007616A1 (en) * 2014-01-27 2017-01-12 Susanne GARDNER Antimicrobial formulations and applications thereof
US10682360B2 (en) * 2014-01-27 2020-06-16 Susanne GARDNER Antimicrobial formulations and applications thereof

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C MICHELET, ET A.,: "Comparative Activities of New Fluoroquinolones, Alone or in Combination with Amoxicillin, Trimethoprim-Sulfamethoxazole, or Rifampin, against Intracellular Listeria monocytogenes", 《ANTIMICROB AGENTS CHEMOTHER》 *
CUI P, ET AL.,: "Disruption of Membrane by Colistin Kills Uropathogenic Escherichia coli Persisters and Enhances Killing of Other Antibiotics", 《ANTIMICROB AGENTS CHEMOTHER》 *
DOMENECH A, ET AL.,: "Experimental Study of Clinafloxacin Alone and in Combination in the Treatment of Ciprofloxacin-Susceptible and -Resistant Pneumococcal Meningitis", 《MICROB DRUG RESIST》 *
G.C. JOSEPHS, ET AL.,: "Efficacy of rifampicin combination therapy on selected non mycobacteria organisms isolated from a tertiary health institution in Benin city", 《JOURNAL OF MEDICINE AND BIOMEDICAL RESEARCH》 *
ISAAC OLUFEMI OLATOYE, ET AL.,: "Multidrug Resistant Escherichia coli O157 Contamination of Beef and Chicken in Municipal Abattoirs of Southwest Nigeria", 《NATURE AND SCIENCE》 *
J VAZQUEZ, ET AL.,: "Sparfloxacin and clinafloxacin alone or in combination with gentamicin for therapy of experimental ampicillin-resistant enterococcal endocarditis in rabbits", 《J ANTIMICROB CHEMOTHER》 *
M CORMICAN, ET AL.,: "Extended Spectrum Beta-Lactamase Production and Fluorquinolone Resistance in Pathogens Associated with Community Acquired Urinary Tract Infection", 《DIAGN MICROBIOL INFECT DIS》 *
R WISE, ET AL.,: "In Vitro Activity of PD 127,391, an Enhanced-Spectrum Quinolone", 《ANTIMICROB AGENTS CHEMOTHER》 *
SIMMONS NA, ET AL.,: "Potentiation of inhibitory activity of colistin on Pseudomonas aeruginosa by sulphamethoxazole and sulphamethizole", 《BR MED J》 *
TONY ANTONIOU, ET AL.,: "Ciprofloxacin-induced theophylline toxicity: a population-based study", 《EUR J CLIN PHARMACOL》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117442739A (zh) * 2023-12-26 2024-01-26 苏州大学 一种联合复方药在病原细菌持留感染治疗中的应用

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