CN110201174A - 一种能够抗慢性感染和生物膜菌的药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能够抗慢性感染和生物膜菌的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括克林沙星与选自达托霉素、奥利万星的至少一种抗生素；所述药物组合物的活性成分还包括额外的抗生素，所述额外的抗生素选自万古霉素、美罗培南中的至少一种抗生素。本发明通过使用药物组合物，可以完全在体外清除持留菌，且能有效清除持续性生物膜感染，治愈了病灶，而且缓解炎症；另外本发明的药物组合物适用体内、体外、体表的感染治疗，使用范围广。

Description

一种能够抗慢性感染和生物膜菌的药物组合物及其用途

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种能够抗慢性感染和生物膜菌的药物组合物及其用途。

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在医疗保健和社区获得性金黄色葡萄球菌感染中高度流行。据了解，与MRSA感染相关的死亡率高达40％。金黄色葡萄球菌是一种机会性病原体，是引起皮肤感染的最常见原因，也可引起慢性感染，如心内膜炎、骨髓炎和人工关节持续感染。特别是留置设备更有利于生物膜的形成，使治疗复杂化，并导致长时间的慢性感染，针对这种感染，现有治疗很难彻底清除。在全球范围内，持续性和慢性感染对公共卫生是一个巨大的负担，因为它们会使住院时间延长、导致复发，使治疗成本和死亡风险至少增加三倍。

与浮游细胞相比，生物膜中的细菌对抗生素更具耐受性。研究表明，抗生素确实能穿透生物膜，但不能完全杀死生物膜中的细菌，这表明治疗细菌的耐受性不是由抗生素渗透受阻或基因耐药性决定的，而是由休眠的不生长或生长缓慢的持留细菌决定的。生物膜内的细菌是非常不均匀的，一些细胞生长缓慢，代表着静止相细菌，而另一些由于生物膜基质内的细胞密度高、营养不足和限氧环境，形成了休眠的持留细菌。

霍比(Hobby)等人于1942年首次发现，虽然99％的金黄色葡萄球菌细胞可以被青霉素杀死，但约1％的代谢静止或休眠的残余的细菌(persister cells)，即持留菌，没有被杀死。这些持留菌(persister cells)对青霉素没有耐药性，因为没有发生基因变化，而是对抗生素具有耐受性的表型变异。同样，青霉素也不能清除慢性感染。虽然金黄色葡萄球菌持留的机制在很长一段时间内基本不为人知，但最近的研究表明，金黄色葡萄球菌的持留菌与群体感应、色素沉着产生和代谢过程的变化，如氧化磷酸化、糖酵解、氨基酸和能量代谢通路有关。因此研究细菌持留性将有助于开发新的药物和治疗方法，更有效地根除持续感染。

因而，金黄色葡萄球菌可引起多种感染，其中许多感染与生物膜造成的慢性感染有关。在生物膜内，生长细菌和非生长细菌(如持留菌)共存，这使得彻底根除持续性和复发性感染具有挑战性。尽管具有临床意义，但目前大多数抗生素治疗主要杀灭生长中的细菌，对非生长持留菌活性较差，对包括生物膜感染在内的持续性感染的治疗效果有限。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种能够抗慢性感染和生物膜菌的药物组合物及其用途。

一种能够抗慢性感染和生物膜菌的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括克林沙星与选自达托霉素、奥利万星的至少一种抗生素。

进一步地，所述药物组合物的活性成分还包括额外的抗生素，所述额外的抗生素选自万古霉素、美罗培南中的至少一种抗生素。

进一步地，所述药物组合物的活性成分包括克林沙星与奥利万星。

进一步地，所述药物组合物的活性成分包括克林沙星、美罗培南、达托霉素。

进一步地，所述药物组合物的活性成分包括克林沙星、万古霉素、达托霉素。

本发明提供一种药物组合物在制备用于杀灭金黄色葡萄球菌的试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或者试剂盒包含美罗培南、达托霉素和克林沙星，任选地，所述金黄色葡萄球菌形成持留菌和/或生物膜。

本发明提供克林沙星在制备用于杀灭金黄色葡萄球菌的试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或试剂盒还包括达托霉素、奥利万星、美罗培南、万古霉素中的一种或多种，任选地，所述金黄色葡萄球菌形成持留菌和/或生物膜。

本发明提供一种克林沙星在制备用于治疗慢性金黄色葡萄球菌感染的药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒还包括达托霉素、奥利万星、美罗培南、万古霉素中的一种或多种，任选地，所述慢性金黄色葡萄球菌感染是持续性生物膜感染。

本发明提供一种包含上述药物组合物的药物制剂、医疗器械或消毒用品。

本发明提供一种治疗慢性金黄色葡萄球菌感染的方法，所述方法包括同时或贯序的施用选自下列抗生素中的一种或多种：美罗培南、达托霉素、奥利万星、克林沙星、万古霉素，任选地，所述慢性金黄色葡萄球菌感染是持续性生物膜感染

本发明通过使用药物组合物，可以在体外清除持留菌，且能有效清除持续性生物膜感染，治愈了病灶，而且缓解炎症；另外，本发明的药物组合物适用体内、体外、体表(包括皮肤，眼睛及五官部位)的感染治疗，使用范围广。本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了本发明实施例中的组合用药与单一用药的实验示意图；图1A为四组试验后单位体积内的菌落数示意图，图1B为四个实验后使用荧光染料可行性染色得到的细菌活/死比示意图，图1C为第1组处理后实验的生物膜生物量的影像图片，图1D为第2组处理后实验的生物膜生物量的影像图片，图1E为第4组处理后实验的生物膜生物量的影像图片，图1F为第3组处理后实验的生物膜生物量的影像图片，图1G为上述四组试验中量化的绝对生物膜生物量的示意图。

图2示出了本发明实施例中组合用药的实验效果示意图；图2A为五个实验中通过荧光染色得到细菌的活/死比示意图，图2B为五个实验中单位体积内菌落数的示意图，图2C为十三组实验的细菌活/死比示意图，图2D为十三组合实验的单位体积内菌落数示意图，图2E为不同菌株在不同组合药物处理下的细菌活/死比示意图，图2F为不同菌株在不同组合药物处理下单位体积的菌落数示意图。

图3示出了本发明实施例中药物活性的实验示意图；图3A示出了单一用药处理的时间-菌落数量折线图，图3B为组合用药处理所检测的单位体积内菌落数量示意图，图3C示出了联合用药杀灭生长阶段细菌的示意图，图3D示出了联合用药处理的时间-菌落数量折线图。

图4示出了本发明实施例中建立持续性感染小鼠模型的实验示意图，图4A为利用金黄色葡萄球菌株USA300的生长曲线建立不同生长阶段的时间点示意图，图4B为监测感染对数期和稳定期细菌一天后小鼠皮肤损伤的面积示意图，图4C为感染后14天，感染小鼠皮肤组织的细菌载量示意图；图4D为感染小鼠皮肤组织组织学检查结果示意图，图4E为未感染小鼠组织病理学检查结果示意图，图4F为对数期感染小鼠组织病理学观察结果示意图，图4G为稳定期感染小鼠组织病理学观察结果示意图，图4H为生物膜细菌感染小鼠组织病理学观察结果示意图。

图5示出了本发明实施例中组合用药治疗小鼠模型的实验示意图，图5A示出了小鼠皮肤感染的流程示意图，图5B为不同用药处理后皮肤损伤处的细菌负荷示意图，图5C为不同组合用药处理病变面积的比例示意图，图5D为未感染的病理学分析结构示意图，5E为未用药处理时的病理学分析结构示意图，5F为多西环素与利福平处理后的病理学分析结构示意图，5G为美罗培南、达托霉素与克林沙星组合药物处理后的病理学分析结构示意图，图5H为不同药物组合治疗后，组织中菌落数示意图。

图6示出了本发明实施例中组合用药对小鼠组织影响的实验示意图；图6A为不同组合药物下IL-17的数量示意图，图6B为不同组合药物下IL-1的数量示意图，图6C为不同药物治疗下的小鼠皮肤组织的大体病理示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种能够抗慢性感染和生物膜菌的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括氟喹诺酮类药物如克林沙星、环丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星中的至少一种与选自达托霉素、奥利万星的至少一种抗生素。优选的，所述药物组合物的活性成分包括克林沙星与选自达托霉素、奥利万星的至少一种抗生素；所述药物组合物的活性成分还包括额外的抗生素，优选的，所述额外的抗生素选自万古霉素、美罗培南中的至少一种抗生素。

本发明提供的药物组合物活性成分包括但不限于以下组合：

克林沙星与达托霉素组合，克林沙星与奥利万星组合，环丙沙星与达托霉素组合，莫西沙星与达托霉素组合，左氧氟沙星与达托霉素组合，环丙沙星与奥利万星组合，莫西沙星与奥利万星组合，左氧氟沙星与奥利万星组合，克林沙星、达托霉素和万古霉素组合，克林沙星、奥利万星和万古霉素组合，环丙沙星、达托霉素和万古霉素组合，莫西沙星、达托霉素和万古霉素组合，左氧氟沙星、达托霉素和万古霉素组合，环丙沙星、奥利万星和万古霉素组合，莫西沙星、奥利万星和万古霉素组合，左氧氟沙星、奥利万星和万古霉素组合，克林沙星、达托霉素和美罗培南组合，克林沙星、奥利万星和美罗培南组合，环丙沙星、达托霉素和美罗培南组合，莫西沙星、达托霉素和美罗培南组合，左氧氟沙星、达托霉素和美罗培南组合，环丙沙星、奥利万星和美罗培南组合，莫西沙星、奥利万星和美罗培南组合，左氧氟沙星、奥利万星和美罗培南组合。

优选的，本发明提供的药物组合物的活性成分包括克林沙星与奥利万星。

优选的，本发明提供的药物组合物的活性成分包括克林沙星、美罗培南、达托霉素。

优选的，本发明提供的药物组合物的活性成分包括克林沙星、万古霉素、达托霉素。

根据本发明的另一方面，本发明提供的药物组合物可制备用于杀灭金黄色葡萄球菌的试剂或试剂盒，所述试剂或者试剂盒包含美罗培南、达托霉素和克林沙星，其中所述金黄色葡萄球菌形成持留菌和/或生物膜。

根据本发明的另一方面，由克林沙星制备的试剂或者试剂盒可用于杀灭金黄色葡萄球菌，其中所述试剂或试剂盒还包括达托霉素、奥利万星、美罗培南、万古霉素中的一种或多种，其中所述金黄色葡萄球菌形成持留菌和/或生物膜；优选的，所述试剂或试剂盒还包括达托霉素和美罗培南；优选的，所述试剂或试剂盒还包括达托霉素与万古霉素；优选的，所述试剂或试剂盒还包括奥利万星。

由克林沙星制备的药物或试剂盒还可用于治疗慢性金黄色葡萄球菌感染，其中所述药物或试剂盒还包括达托霉素、奥利万星、美罗培南、万古霉素中的一种或多种，其中所述慢性金黄色葡萄球菌感染是持续性生物膜感染；优选的，所述试剂或试剂盒还包括达托霉素和美罗培南；优选的，所述试剂或试剂盒还包括达托霉素与万古霉素；优选的，所述试剂或试剂盒还包括奥利万星。

本发明提供的药物组合物及药物试剂盒可用于制成制剂、医疗器械或消毒用品，示例性的，医疗器械如注射器械、支架、导管或其它；消毒用品包括制成的消毒棉、消毒毛巾、消毒水等。

本发明提供一种治疗慢性金黄色葡萄球菌感染的方法，具体的，所述方法包括同时或贯序的施用选自下列抗生素中的一种或多种：美罗培南、达托霉素、奥利万星、克林沙星、万古霉素，其中所述慢性金黄色葡萄球菌感染是持续性生物膜感染；优选的，所述方法包括同时或者贯序的施用克林沙星、奥利万星的组合药物；优选的，所述方法包括同时或者贯序的施用克林沙星、达托霉素和美罗培南的组合药物；优选的，所述方法包括同时或者贯序的施用克林沙星、达托霉素和万古霉素的组合药物。

本发明提供以下实施例，对本发明的药物组合物进行验证。

实施例

如无特殊说明，本发明实施例使用的材料与方法如下：

(1)培养基、抗生素和化学药品

金黄色葡萄球菌USA300、CA-409、CA-127、GA-656分别取自美国典型微生物保藏中心(American Type Culture Collections(ATCC))，是在37℃条件下在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)和胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)(Becton Dickinson，USA)中培养。万古霉素、庆大霉素、利福平、左氧氟沙星、环丙沙星、莫西沙星、奥利万星均购自美国密苏里州的Sigma-Aldrich公司。达托霉素、美罗培南、托索沙星、克林沙星均产自AK科学公司(美国加州)。在实验室中制备药物原液，过滤消毒，并在规定浓度下使用。

(2)微量滴定板生物膜法

在TSB中培养过夜的金黄色葡萄球菌株，按1:100在TSB中稀释。然后，按照每份100μl将稀释液等分成若干份，利用96孔平底微量滴定板在37℃下静置培养24h后除去微量滴定板内的浮游细胞。需要添加的药物按照规定的浓度被添加到生物膜附着的微量滴定板中。为测定细胞和生物膜密度，取上清液，利用PBS缓冲液(1X)冲洗生物膜2次。为了对细菌细胞数量进行计数，在连续稀释和铺平板之前，用TSB对孔中的生物膜进行复苏，并用吸管尖刮除。为了用绿:红荧光的比值来评估细胞活力，以确定活:死细胞的比值，在确定活:死细胞的比值前，分别用SYBR Green I/PI染料对生物膜进行染色。简而言之，将SYBR GreenI(10000×stock)与PI(Propidium Iodide，碘化丙啶，20mM)分别以1:3的比例混合于蒸馏水中。SYBR Green I/PI的混合液添加到每个样本中，染料与需要检测样本的比例为1:10。BioTek仪器(VT，USA)采用Synergy H1微平板阅读器(微孔板检测仪器)，将需要检测的样本在室温黑暗中孵育20min后，分别在485nm、538nm和612nm激发波长下检测绿色和红色荧光强度。为了观察生物膜的生物量，在室温下用结晶紫染色剂(0.1％)染色15分钟。多余的染料用水冲洗，生物膜晾干。使用Keyence BZ-X710显微镜记录图像，使用Keyence公司(日本大阪)提供的BZ-X分析仪软件进行处理。

(3)小鼠皮肤感染模型

从Charles River获得6周龄的雌性瑞士韦伯斯特小鼠；将小鼠安置在BSL-2(二级生物安全防护实验室)住房条件下，每个笼子3至5只。所用动物均依照约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准的动物程序进行培养。采用金黄色葡萄球菌株USA300和纽曼株进行小鼠感染实验。将老鼠麻醉，刮去小鼠身上约3厘米×2厘米的皮肤，将不同时期的菌种采用皮下注射的方式接种至小鼠体内。在对数期接种，过夜培养的菌株在TSB中稀释1:100，37℃下培养2小时，在转速为220rpm下摇匀。稳定期接种采用37℃培养过夜培养。为制备生物膜接种剂，生物膜首先在前面描述的微滴度板中生长，然后复苏，用吸管尖刮除。采用连续稀释法和铺平板法对所有接种物进行定量。感染1周后开始治疗(具体见表1)，在指定时间点用卡尺测量皮损大小。治疗后1周处死小鼠，取皮肤组织，匀浆，连续稀释TSA琼脂平板上细菌计数。

(4)组织病理学

用中性缓冲液福尔马林对皮肤组织进行解剖、平整、固定24小时。将组织嵌入在石蜡内，切成5部分，而后放置在玻璃片中，组织切片用苏木精和伊红染色进行组织病理学评分。组织切片评估病变结壳形成、溃疡形成、增生、炎症、毛囊大小和细菌计数，并按0-3分进行评分(0＝无、1＝轻度、2＝中度和3＝重度)。累积病理评分表示每个病理参数的总和。评分由一名观察员与一名兽医病理学家协商完成。代表性图像采用Keyence BZ-X710显微镜拍摄。

(5)统计分析

统计分析采用双尾t检验和双侧方差分析进行。p值<0.05为差异有统计学意义。所有实验均进行了三次。使用GraphPad Prism(适用于Mac操作系统的软件)和MicrosoftOffice Excel(电子表格软件)进行分析。

实施例1

现有的技术中通常采用万古霉素进行感染的治疗，虽然万古霉素在体外杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方面非常有效，但在清除慢性金黄色葡萄球菌感染方面，万古霉素单一治疗可能不是最有效的。若使用万古霉素作为单一治疗或药物联合治疗至少6周；若采用联合用药，如联合多西环素与利福平联合用药，治疗最长10天；联合万古霉素、庆大霉素和利福平，治疗至少6周，联合用药还可用于治疗慢性感染，示例性的，用于治疗骨髓炎和人工关节感染等情况。

本实验采用四组不同的药物进行处理，通过实验验证药物效果，其中不添加药物(即空白none)为第1组实验，万古霉素(Vancomycin，Van)单独的药物为第2组实验；多西环素(Doxycycline，Dox)与利福平(Rifampin，Rif)联合为第3组实验；万古霉素(Vancomycin，Van)、庆大霉素(Gentamicin，Gen)和利福平(Rifampin，Rif)联合为第4组实验，处理4天后进行评估。图1示出了上述组合药物在体外杀死生物膜细菌的试验结果示意图。由图1可以看出，临床推荐的处理慢性金黄色葡萄球菌感染的方法在体外只能部分杀死生物膜细菌。图1A显示的是四组实验后单位体积内菌落的数量(取对数)，图1B为四个实验中使用荧光染料可行性染色(采用碘染色法)得到的细菌活/死比；图1C为第1组处理后实验的生物膜生物量的影像图片；图1D为第2组处理后实验的生物膜生物量的影像图片；图1E为第4组处理后实验的生物膜生物量的影像图片；图1F为第3组处理后实验的生物膜生物量的影像图片；图1G为上述四组试验中量化的绝对生物膜生物量。图中P<0.005代表为差异有统计学意义。

由实验可以得出，目前临床使用的组合并不能完全有效的清除生物膜细菌。为期4天的处理后，万古霉素单独处理，多西环素、利福平联合处理，万古霉素、庆大霉素和利福平的联合处理，都无法完全根除生物膜细菌；同时可以得出万古霉素、庆大霉素、利福平的组合，比单独的万古霉素杀死生物膜细菌的效果好，也比多西环素与利福平的组合杀死生物膜细菌的效果好；由此可以得出药物组合物比单一用药有效。

实施例2

金黄色葡萄球菌USA300菌株是一种常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)循环菌株，它的生物膜生长在96孔板(通过微量滴定板生物膜实现)上。为了确定一种有效的组合，本发明在体外生物膜模型中测试了多种药物组合：第1组为空白试验(none)，第2组为万古霉素(Vancomycin，Van)、达托霉素(Daptomycin，Dap)、妥索沙星(Tosufloxacin，Tosu)组合用药，第3组为美罗培南(Meropenem，Mer)、达托霉素(Daptomycin，Dap)、妥索沙星(Tosufloxacin，Tosu)组合用药，第4组为万古霉素(Vancomycin，Van)、达托霉素(Daptomycin，Dap)与克林沙星(Clinafloxacin，Clina)组合用药，第5组为美罗培南(Meropenem，Mer)、达托霉素(Daptomycin，Dap)、克林沙星(Clinafloxacin，Clina)组合用药。通过五组进行试验，结果如图2所示。其中图2A示出了上述五个实验中通过荧光染色得到细菌的活/死比，图2B示出了上述五个实验中单位体积内菌落数，由图2(A-B)可以得出万古霉素/美罗培南、达托霉素与妥索沙星组合用药仅部分根除生物膜细菌，处理后生物膜中剩下单位体积内(1ml)中10⁵个菌落；与此相反，万古霉素/美罗培南、达托霉素与克林沙星的组合用药，处理4天后生物膜完全消除，CFU(菌落数)为0，活/死比低于检测限值。

本发明进一步通过13组实验对各个组合药物进行实验验证，其中，第1组为空白试验，第2组为多西环素与利福平组合用药，第3组为万古霉素，第4组为美罗培南，第5组为达托霉素，第6组为克林沙星，第7组为万古霉素与达托霉素联合用药，第8组为万古霉素与克林沙星联合用药，第9组为美罗培南与达托霉素联合用药，第10组为美罗培南与克林沙星联合用药，第11组为达托霉素与克林沙星联合用药，第12组为万古霉素、达托霉素与克林沙星联合用药，第13组为美罗培南、达托霉素与克林沙星联合用药。图2C示出了上述多个实验的细菌活/死比，图2D示出了上述多个组合实验的单位体积内菌落数，图2(C-D)为美罗培南、达托霉素、克林沙星组合用药杀灭临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌做出了更有效验证。

上述实验中的药物浓度选择各个药物临床使用时体内能够达到的药物峰浓度进行验证。所述峰浓度如表1所示：

表1药物剂量、计划和给药

本发明进一步测试美罗培南、达托霉素和克林沙星组合用药根除不同金黄色葡萄球菌(包括其他临床分离的CA-409、CA-127和医院获得的GA-656株)生物膜细菌菌株的潜力。本发明通过实验验证不同用药对不同菌种的效果，第1组为空白实验(即不添加任何药物)、第2组为多西环素与利福平组合用药、第3组为美罗培南、达托霉素与克林沙星联合用药；使用美罗培南、达托霉素和克林沙星组合用药处理生物膜4天后，结果如图2(E-F)所示，其中图2E为CA-409、CA-127和GA-656在上述组合药物处理下的细菌活/死比；图2F示出了CA-409、CA-127和GA-656在上述用药组合下单位体积的菌落数；由如图2(E-F)可以看出，美罗培南、达托霉素和克林沙星联合后所有检测的MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)菌株均完全根除，活细胞水平未检测到。

需要补充的是，图2中多西环素(Doxycycline，Dox)，利福平(Rifampin，Rif)；文中相同的缩写均为同一种物质。

实施例3

本实施例验证抗氟喹诺酮类药物中克林沙星的耐药活性最佳。本实施例对不同氟喹诺酮类抗生素的抗生物膜活性进行排序，以确定联合药物中使用克林沙星的抗生物膜活性是药物本身独有的，还是可以被其他氟喹诺酮类抗生素所替代。为了验证想法，本实施例使用了纽曼金黄色葡萄球菌株，因为该菌株对大多数氟喹诺酮类药物敏感，可以消除由于固有耐药性而产生的任何混杂因素。其他氟喹诺酮类药物采用环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星中的一种与美罗培南、达托霉素进行组合；组合用药4天后，各药物组合均产生一定的抗持续性或抗生物膜活性，而与克林沙星组合用药是最有效的。相比之下，由其他喹诺酮类化合物处理的生物膜仍然含有10⁴-10⁸CFU/ml(每毫升内含有10⁴-10⁸个菌落)。结合使用时，根据生存能力评估和活细胞计数，喹诺酮类药物的活性由强到弱依次为(如表2所示)：克林沙星、环丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星。因此通过表2可以看出，克林沙星与其他氟喹诺酮类药物相比，对持留菌具有独特的强效活性。但完全清除生物膜持留菌需要克林沙星与美罗培南+达托霉素组合才可，克林沙星单独使用，或克林沙星与另一个药物组成的两药组合也不能完全清除生物膜持留菌。

表2氟喹诺酮类化合物杀灭生物膜细菌活性的排序

实施例4

为了确定其他的抗持久性候选药物，本实施例对新一代的脂糖肽进行验证，其中的脂糖肽包括奥利万星(oritavancin)和达巴万星(dalbavancin)；本实施例首先检测了单一的奥利万星和达巴万星对金黄色葡萄球菌持留菌的杀灭活性，并与空白对照、万古霉素形成四个实验，利用这四个药物进行单独处理。所得结果如图3A所示，图3A示出了四个实验中随着治疗天数的增加，检测的单位体积内菌落的数量(取对数)，如图3A所示，在三种药物中，奥利万星对持留菌的杀灭效果最好。在6天的药物暴露后，奥利万星杀死了10⁶CFU/ml持留菌，而达巴万星或万古霉素只杀死了约10²CFU/ml。

由于奥利万星具有较强的抗持留菌活性，本实施例评估了奥利万星在药物组合中的活性。所得结果如图3B所示，图3B示出了奥利万星与美罗培南、达托霉素和奥利万星组合用药，用药组合及处理结果如图3B所示，其中第1组为空白实验，第2组为多西环素与利福平联合用药，第3组为美罗培南与奥利万星联合用药，第4组为达托霉素与奥利万星联合用药，第5组为美罗培南、达托霉素与奥利万星联合用药，第6组为美罗培南、达托霉素与克林沙星联合用药；观察到的美罗培南、达托霉素和奥利万星联合用药对生物膜展现出部分活性，单位体积(1ml)减少的10⁵个实物菌落，这比通过单一药物治疗或两种药物组合效果要好，但仍不如克林沙星的药物组合。

由于奥利万星对生长阶段金黄色葡萄球菌(MIC值为0.03mg/L)具有较强的抑制作用，且在药物组合中具有模拟细胞壁和细胞膜抑制剂的双重作用机制，本发明用奥利万星替代美罗培南和达霉素进行了试验。图3C示出了奥利万星替代美罗培南和达霉素进行了试验的用药组合和试验结果，如图3C所示，其中，第1组为空白实验，第2组为多西环素与利福平联合用药，第3组为奥利万星，第4组为克林沙星，第5组为奥利万星与克林沙星联合用药，第6组为美罗培南、达托霉素与克林沙星联合用药，得出的结论是，奥利万星与克林沙星的组合也能够完全消除生物膜菌，这表明奥利万星可以替代本发明药物组合中针对活跃生长的细菌成分。但是，单一药物奥利万星不能杀死生物膜菌(4天治疗后CFU没有变化)，这进一步证实了药物组合对治疗生物膜细菌的重要性。其中的MIC为最小的抑菌浓度。

为了比较目前检测到的三种组合与克林沙星的活性，本实施例进行了一个时间-过程杀灭实验，图3D示出了随着四组实验治疗天数的增加检测的单位体积内菌落数，如图3D所示，奥利万星、克林沙星联合用药经过2天的处理可以杀灭所有的生物膜菌，而美罗培南/万古霉素、达托霉素与克林沙星联合用药需要4天的时间才能杀灭生物膜细菌。因而从数据可以得出，在治疗生物膜感染中的药物组合中包含一种抗持留菌药物是至关重要的，这些组合比目前临床使用的方案(多西环素+利福平)具有更好的活性。

实施例5

本实施例通过建立小鼠持续性皮肤感染模型，对药物组合物根除体外生物膜细菌的进行可行性验证。

由于由MRSA引起的皮肤和软组织感染的复发率高达45％。因此，为了开发更好的治疗持续性皮肤感染的方法，一个能够模拟患者持续性皮肤和组织感染的临床动物模型是至关重要的。建立一个持久的皮肤感染小鼠模型，本发明通过小鼠皮下注射感染不同形式(示例性的，对数期、稳定期和生物膜细菌)的金黄色葡萄球菌的临床结果进行评价。如图4B所示，与感染对数期细菌的小鼠相比，感染的稳定期细菌或生物膜细菌的小鼠出现更严重的皮肤损伤，需要至少一周的时间才能痊愈。此外如图4(C-D)所示，尽管同样都是使用等量的细菌(10⁸CFU)接种感染小鼠，但是与感染对数期细菌的小鼠相比，利用稳定期及生物膜细菌感染的小鼠，其培养物中含有更多的耐受细胞，其细菌负荷增加，并增加了组织病理学。

图4(E-H)高剂量(10⁸CFU)生物膜细菌感染小鼠，组织学表现为结壳、增生、免疫细胞浸润和局部病变/脓肿形成，而对数期感染小鼠，免疫细胞浸润和炎症或病变水平较低。总的来说，这些体内研究表明，持留菌(即稳定期细菌和生物膜细菌)感染的老鼠会导致一个更长期持续感染更严重的病变，这可以作为一种良好的持久性生物膜感染模型。

实施例6

本实施例通过验证美罗培南、达托霉素和克林沙星组合用药可消除小鼠皮肤持续感染模型中的生物膜感染，并对在体内根除持续性感染进行验证。本实施例采用13组方案进行治疗实验，其中，第1组为空白试验，第2组为多西环素与利福平组合用药，第3组为ADEP4(酰基缩酚酸肽抗生素)与利福平联合用药，第4组为果糖与庆大霉素，第5组为美罗培南，第6组为达托霉素，第7组为克林沙星，第8组为美罗培南与达托霉素联合用药，第9组为美罗培南与克林沙星联合用药，第10组为达托霉素与克林沙星联合用药，第11组美罗培南、达托霉素与克林沙星联合用药，第12组为万古霉素、达托霉素与克林沙星联合用药，第13组为美罗培南、达托霉素与莫西沙星联合用药。

由于上述药物组合在体外根除生物膜方面具有较强活性，本实施例对上述药物组合能在体内根除持续性感染进行了验证。为了评估药物组合治疗持续性皮肤感染的效果，本实施例选择了金黄色葡萄球菌USA300菌株的生物膜细菌感染小鼠，这是一种在宿主中引起持续性感染最具代表性的临床菌株。让菌株感染发展7天，鼠皮肤感染的过程如图5A所示，然后用不同的方案治疗7天。图5B示出了采用上述药物组合用药治疗后皮肤损伤处的细菌负荷，如图5B所示，利用多西环素、利福平组合用药(对照组临床使用)或万古霉素、达托霉素和克林沙星组合用药对感染的小鼠进行治疗后，这两种治疗方式可降低细菌载量(约1对数细菌(log of bacteria))，但不能清除感染。被认为可以根除慢性金黄色葡萄球菌感染的其他药物组合物，这些药物组合物对小鼠用药后的结果如图5C-G所示，图5C示出了上述组合用药后病变面积的比例，如图5C所示，ADEP4(酰基缩酚酸肽抗生素，已被证明能激活ClpP蛋白酶，可导致部分持留菌死亡但不完全)、利福平或果糖(frustose)与庆大霉素组合用药，生物膜感染模型中没有显示杀菌活性，反而增加了病变大小和炎症。图5(D-G)示出了不同组合的药物中组织病理学分析结构，可以看出美罗培南、达托霉素与克林沙星药物组合物完全清除了感染，减小了病灶大小，降低了组织病理学评分，完全治愈了病灶。

由于体内实验使用的是一株MRSA菌株USA300，为确保本发明的药物组合对其他金黄色葡萄球菌株有效，本实施例还采用一种甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌纽曼株(MSSA)感染小鼠，此外，为了进一步证实克林沙星与其他喹诺酮类药物相比，对该菌株的治疗活性仍优于其他喹诺酮类药物，采用下述组合药物进行治疗，用于进行验证：第1组为空白试验，第2组为克林沙星，第3组为美罗培南与达托霉素联合用药，第4组为美罗培南、达托霉素与克林沙星联合用药，第5组为美罗培南、达托霉素与莫西沙星联合用药，第6组为多西环素与利福平联合用药；图5H示出了上述药物组合治疗后，组织中菌落数(取对数)，由图5H可以看出，尽管莫西沙星和克林沙星对纽曼菌株具有相同的MIC值，但美罗培南、达霉素和莫西沙星联合治疗不能有效清除生物膜感染，而美罗培南、达霉素和克林拉星联合治疗却完全清除了感染。这说明克林沙星组合对MRSA菌株和MSSA菌株均有效，其独特的杀菌活性是莫西沙星所不能替代的。

实施例7

本实施例验证了生物膜细菌的消灭与组织炎症和免疫病理的解决有关。

金黄色葡萄球菌引起的皮肤感染可通过IL-17(由T细胞产生的一种前炎症细胞因子)产生的中性粒细胞募集清除。为了评估治疗的任何潜在免疫病理结果，本发明测量了感染部位IL-17和促炎细胞因子IL-1(白细胞介素-1)的水平，并进行了组织学检查。本实施例通过下述13组实验进行验证：第1组为未感染，第2组为未治疗，第3组为多西环素与利福平，第4组为ADEP4与利福平联合用药，第5组为庆大霉素、果糖联合用药，第6组为美罗培南，第7组为达托霉素，第8组为克林沙星，第9组为美罗培南与达托霉素，第10组为美罗培南与克林沙星，第11组为克林沙星与克林沙星，第12组为美罗培南、克林沙星与达托霉素联合用药，第13组为美罗培南、达托霉素与莫西沙星联合用药。

结果如图5A-C所示，美罗培南、达托霉素和克林沙星组合用药小鼠皮肤组织产生的IL-17(如图5A所示)和IL-1(如图5B所示)最低，与其他对照组相比，出现的严重炎症最少(如图5C所示)。这些数据支持了本实施例提出的假设。

图6A示出了上述组合药物下IL-17的数量。图6B示出了上述组合药物下IL-1的数量。图6C示出了不同药物治疗下的小鼠皮肤组织的大体病理(mm)。

通过上述实施例，本发明证明了将对生长期细菌具有高活性的药物如万古霉素或美罗培南，与具有强大的抗持留菌活性的药物，如克林沙星，结合起来，可以在体外完全根除金黄色葡萄球菌的生物膜细菌。相比之下，单一或两种药物，包括目前治疗持续性金黄色葡萄球菌感染的多西环素加利福平，未能在体外杀死所有生物膜细菌。通过本发明用生物膜接种细菌建立的慢性持续性皮肤感染小鼠模型，证明生物膜细菌比对数生长期金黄色葡萄球菌引起更严重和更持久的皮肤损伤，而本发明的药物组合物在体外清除生物膜细菌比目前的治疗方法(多西环素+利福平)更有效，完全消除了小鼠金黄色葡萄球菌的生物膜感染。同时验证了克林沙星在彻底消灭生物膜细菌的方面具有独特的高抗持留菌活性，是莫西沙星、左氧氟沙星、环丙沙星等氟喹诺酮类药物所不能替代的。本发明首次证明美罗培南、达托霉素和克林沙星联合治疗完全清除了持续性感染，更快治愈了病灶，炎症反应也较轻，而目前临床上推荐的治疗慢性组织感染的药物多西环素联合利福平治疗小鼠却没有达到这一效果。本发明还比较了在金黄色葡萄球菌生物膜感染小鼠模型中，其他治疗持续性感染的方法：庆大霉素+果糖和ADEP4+利福平和庆大霉素+果糖和ADEP4+利福平均不能根除或治愈小鼠持久的生物膜感染，而本发明的药物组合物克林沙星+美罗培南+达托霉素，在7天内完全根除和治愈了持留生物膜感染。本发明的研究通过证明(1)生物膜接种在小鼠皮肤持续性感染模型中比对数生长期细菌建立更持久和严重的感染；(2)针对生长和非生长持续菌的药物均能在体外完全消灭生物膜细菌；(3)以生长细菌为靶点的异丙沙星、美罗培南、达霉素组合用药，可消除严重的生物膜感染。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种能够抗慢性感染和生物膜菌的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的活性成分包括克林沙星与选自达托霉素、奥利万星中的至少一种抗生素。

2.根据权利要求1所述药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的活性成分还包括额外的抗生素，所述额外的抗生素选自万古霉素、美罗培南中的至少一种抗生素。

3.根据权利要求2所述药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的活性成分包括克林沙星与奥利万星。

4.根据权利要求2所述药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的活性成分包括克林沙星、美罗培南、达托霉素。

5.根据权利要求2所述药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的活性成分包括克林沙星、万古霉素、达托霉素。

6.根据权利要求1-5任意一项的药物组合物在制备用于杀灭金黄色葡萄球菌的试剂或试剂盒中的用途，其特征在于：所述试剂或者试剂盒包含美罗培南、达托霉素和克林沙星，任选地，所述金黄色葡萄球菌形成持留菌和/或生物膜。

7.克林沙星在制备用于杀灭金黄色葡萄球菌的试剂或试剂盒中的用途，其特征在于：所述试剂或试剂盒还包括达托霉素、奥利万星、美罗培南、万古霉素中的一种或多种，任选地，所述金黄色葡萄球菌形成持留菌和/或生物膜。

8.克林沙星在制备用于治疗慢性金黄色葡萄球菌感染的药物或试剂盒中的用途，其特征在于：所述药物或试剂盒还包括达托霉素、奥利万星、美罗培南、万古霉素中的一种或多种，任选地，所述慢性金黄色葡萄球菌感染是持续性生物膜感染。

9.一种包含权利要求1-5任意一项的药物组合物的药物制剂、医疗器械或消毒用品。

10.一种治疗慢性金黄色葡萄球菌感染的方法，其特征在于：所述方法包括同时或贯序的施用选自下列抗生素中的一种或多种：美罗培南、达托霉素、奥利万星、克林沙星和万古霉素，任选地，所述慢性金黄色葡萄球菌感染是持续性生物膜感染。