CN109125399A - 粉防己提取物的抗菌作用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了粉防己提取物在抑制细菌生长中的应用。本发明所述粉防己提取物采用乙醇进行提取。本发明所述粉防己提取物能够抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。本发明还公开了粉防己提取物作为具有抑制细菌生长作用的添加剂在家用产品、消毒用品或个人护理产品中的应用。

Description

粉防己提取物的抗菌作用
技术领域
本发明属于植物化学领域，具体涉及粉防己提取物的抗菌作用，尤其涉及其在抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌领域中的应用。
背景技术
目前国内外多数抗菌添加剂以合成化合物为主。虽然这些化合物具有快速杀灭致病微生物，有效浓度低等优点，但其毒性、刺激性又不同程度地影响人体健康。抗生素的滥用，也导致了耐药细菌的出现，导致细菌感染类的疾病越来越难治愈。随着天然、安全与环保要求的提出，植物抗菌添加剂越来越为人们所青睐。
防己科千金藤属植物粉防己(Stephania tetrandra S.Moore)的干燥根具有祛风止痛，利水消肿之功效。用于风湿痹痛，水肿脚气，小便不利，湿疹疮毒。现代分析表明，粉防己含多种生物碱，其中粉防己碱(特船君)(tetrandrine)治风湿关节炎和高血压症均有效。
粉防己的主要功效包括：钙通道阻滞剂；高血压病；抗心肌缺血作用；抗心律失常作用；降压作用；抗过敏作用；高血压危象；心绞痛。
迄今为止，本领域尚未发现粉防己具有任何抗菌功效。因此，本发明首次提出了粉防己提取物具有抗菌功效。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染，金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起特应性皮炎、湿疹、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。临床常使用抗生素进行治疗，严重感染时需用糖皮质激素进行治疗。
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常被称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜(禽)，常引起严重腹泻和败血症。
通过创造性的劳动，发明人意外地发现粉防己提取物有抑菌的作用。也就是说，粉防己提取物具有抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的作用，可作为功能添加剂应用到家用产品、消毒用品或个人护理产品中。
发明内容
本发明首次发现粉防己提取物有抑菌作用，尤其是对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有强效抑菌作用。因此，粉防己提取物可以作为功能添加剂应用到家用产品、消毒用品或个人护理产品中。
一方面，本发明提供了粉防己提取物在抑制细菌生长中的应用。
在一些实施方式中，所述粉防己提取物通过溶剂提取法制备。在一些优选的实施方式中，所述粉防己提取物采用70％的乙醇进行提取。
在本发明一些优选的实施方式中，粉防己提取物可用于抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
另一方面，本发明提供了粉防己提取物作为具有抑制细菌生长作用的添加剂在家用产品、消毒用品或个人护理产品中的应用。
在一些实施方式中，所述家用产品、消毒用品或个人护理产品包含浓度至少为0.125g/ml的粉防己提取物。在一些优选的实施方式中，所述家用产品、消毒用品或个人护理产品包含浓度至少为0.25g/ml的粉防己提取物。
在一些实施方式中，家用产品、消毒用品或个人护理产品中使用的粉防己提取物通过溶剂提取法制备。在一些优选的实施方式中，所述粉防己提取物采用70％的乙醇进行提取。
在本发明一些优选的实施方式中，所述家用产品、消毒用品或个人护理产品能够抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
发明详述
本发明首次发现粉防己提取物具有抗菌功效，对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌尤其有效。此外，本发明还首次提供了粉防己提取物作为具有抑菌功能的添加剂在家用产品、消毒用品或个人护理产品中的应用。
粉防己是一种中药名，是防己科千金藤属植物粉防己(Stephania tetrandraS.Moore)的干燥根。我国南方大部分地区有分布，主产于浙江、安徽、湖北、江西等省。具有祛风止痛，利水消肿之功效。用于风湿痹痛，水肿脚气，小便不利，湿疹疮毒。迄今为止没有任何文献公开报道粉防己具有抑菌功效，尤其是针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌功效。
粉防己提取物可以采用常规方法进行提取制备。在本发明中，粉防己提取物采用溶剂提取法进行制备。提取过程中采用的提取溶剂可以是本领域已知的任意溶剂，例如极性溶剂和非极性溶剂。在一个具体的实施方式中，提取溶剂可以采用乙醇。在一个更加具体的实施方式中，提取溶剂采用70％的乙醇。
粉防己提取物的抑菌作用相对于化学合成的化合物而言具有许多优点。首先，天然中草药作为原料提取得到的粉防己提取物更加符合天然、安全和环保的要求。在消费者群体中，中草药提取物作为抑菌剂将具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。其次，中草药作为原料提取得到的粉防己提取物在毒性和刺激性方面显著优于现有技术常规使用的化学品抑菌剂。第三，由于抗生素的滥用，导致了细菌耐药性的出现，因此以中草药为原料的粉防己提取物将越来越为消费者所接受。
现有技术对粉防己提取物的研究重要集中于其中的多种生物碱。粉防己的药用价值目前主要体现在粉防己碱(一种生物碱)在风湿性关节炎和高血压方面的疗效。然而，本发明人意外地发现粉防己提取物具有抑菌功效，对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌尤其有效。
金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性菌，在许多严重感染中均伴有金黄色葡萄球菌。目前临床上通常采用光谱抗生素进行治疗。但是，采用抗生素治疗易引发细菌耐药性问题，常常需要采用更加强效的抗生素进行治疗。然而，本发明提供了一种针对金黄色葡萄球菌尤其有效的以中草药为原料的粉防己提取物。在最低至0.25g/ml的使用浓度下，本发明的粉防己提取物即可产生抑菌作用。
大肠杆菌常常引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，甚至可引起腹泻。目前针对感染大肠杆菌的治疗以支持性治疗为主。若患者出现腹泻，即补充失去的水分和电解质。可使用抗革兰氏阴性菌细菌药物，但部分药物常常无效。相反，本发明提供了一种针对大肠杆菌尤其有效的以中草药为原料的粉防己提取物。在最低至0.125g/ml的使用浓度下，本发明的粉防己提取物即可产生抑菌作用。
具体实施方式
本发明的发明人意外地发现：粉防己提取物具有抑菌功效，可以作为功能添加剂应用到家用产品、消毒用品或个人护理产品中。文献中均未涉及粉防己提取物具有抑菌功效，也未涉及将其作为具有抑菌作用的功能添加剂加入到家用产品、消毒用品或个人护理产品中。
因此，本发明首次提出粉防己提取物的抑菌功效，同时其也可以作为具有抑菌作用的功能添加剂加入到家用产品、消毒用品或个人护理产品中。
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。
实施例1：粉防己提取物的制备
取粉防己药材，粉碎，称取100g倾入玻璃烧杯内，加入70％乙醇800mL，充分搅拌后置室温下提取3h，期间间断性进行搅拌，3h后以滤纸(新星公司的定性滤纸，直径9cm，中速，孔径15-20μm)过滤提取液，残渣再加入70％乙醇800mL在室温下进行提取，间断性进行搅拌，3h后以滤纸过滤提取液；残渣再加入70％乙醇800mL，搅拌混匀后置室温下过夜，以滤纸过滤提取液，合并3次提取液，在减压条件下回收乙醇至体积约100mL，备用。
实施例2：粉防己提取物抑菌作用
1.培养基和试剂
1.1标准菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC 6358)、大肠杆菌(ATCC 8739)、白色念珠菌(ATCC 10231)。
1.2培养基：
胰蛋白胨大豆琼脂培养基(细菌培养)(BD difcoTMTryptic Soy Agar(TSA)胰酶大豆琼脂，BD公司)[按说明书配制,121℃(151b)，15min高压灭菌后使用]
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(白色念珠菌培养)(BD difcoTMPotato Dextrose Agar(PDA)，BD公司)[按说明书配制,121℃(151b)，15min高压灭菌后使用]
2.操作步骤
2.1抑菌片的制备：抑菌剂载体为7mm直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置120℃烤干2h，保存备用。
2.2取无菌并干燥的滤纸片，每片滴加实施例1制备的粉防己提取液10μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿中，置室温下自然干燥5min后备用。
2.3对液体抑菌剂的阴性对照样本：可取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌去离子水10ul，干燥后备用。
2.4阳性对照样本：采用滴露原液(生产商利时洁家化(中国)有限公司批号：EXP2019-01-04)，取无菌干燥滤纸片，每片滴加10ul，干燥后备用。
2.5溶剂对照样本：应取给定溶剂样本，取无菌干燥滤纸片，每片滴加10ul，干燥后备用；若溶剂为去离子水，则可省略此对照样本。
2.6试验菌的接种：
2.6.1制备无菌培养基平板(无菌平板生产商青岛金典生化器材有限公司规格90×15mm培养皿(环氧乙烷灭菌)。每块培养基平板注入约15ml的培养基，置于室温下，自然干燥凝固。
2.6.2试验菌悬液制备：试验菌液要求第四代或第五代新鲜菌液，即细菌提前24h划斜面，白色念珠菌提前48h划斜面，试验时用挑棒挑取新鲜斜面菌2-3环于9ml灭菌生理盐水中(与0.5麦的比浊管比浊，实际浓度应比比浊管略偏浓，比浊实际浓度应为108cfu/ml)，然后按照试验需要将菌液进行1：100稀释成试验所需菌悬液。
2.6.3取上述浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml的试验菌悬液，用微量移液器吸取50μl试验用菌悬液至事先制备好的平板表面，并用无菌L棒将菌液涂抹均匀后，盖好平板。置室温干燥5min。
2.6.4试验菌液计数：以平板计数法对试验菌悬液进行计数。
2.7抑菌剂样片的贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放2片平行试验样片，1片阴性对照，1片阳性对照样片，1片溶剂对照样片(若有)，共4-5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面，各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面，盖好平板，置37℃培养箱，细菌培养16h～18h，白色念珠菌培养48h，观察结果(第一次试验结束，应根据抑菌圈大小适当调整样片贴放规则)。
3.抑菌环直径的测量：
3.1试验菌悬液计数结果应在所需菌液的要求浓度范围内(5×105cfu/ml～5×106cfu/ml)。
3.2测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行，测量其直径应以抑菌环外沿为界。
4.抑菌作用的判定：
4.1抑菌环直径大于7.00mm者，判为有抑菌作用。
4.2抑菌环直径小于或等于7.00mm者，判为无抑菌作用。
5.实验结果
表1
如表1所示，粉防己提取物对金黄色葡萄球菌(ATCC 6358)的抑菌圈为10.6mm，有抑菌作用；对大肠杆菌(ATCC 8739)13.3mm，有抑菌作用。
实施例3：最小抑菌浓度(MIC)测定试验
1.适用范围：本实施例采用营养肉汤稀释法，本方法适用于对可溶性抗(抑)菌产品其最小抑菌浓度的测定。
2.培养基和试剂
2.1标准菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC 6358)、大肠杆菌(ATCC 8739)菌悬液及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌种。
2.2营养肉汤培养基[按说明书配制,121℃(151b)，15min高压灭菌后使用]
2.3 PBS缓冲液
用HCl调pH至7.2～7.4，再加蒸馏水定容至1000m1。
2.4生理盐水
配制方法：NaCl 8.5g
蒸馏水 加至1000ml
溶解后，加至可调瓶顶配液器中。将可调瓶顶配液器的刻度调节至每次加样量为9ml，再将生理盐水加入到20ml取样瓶中，每瓶9ml，高温高压灭菌。室温保存备用。
2.5卵磷脂-吐温80培养基(细菌培养)[按说明书配制,121℃(151b)，15min高压灭菌后使用。
3.操作步骤
3.1制备试验用菌种的菌悬液，用无菌生理盐水调整菌悬液浓度至108cfu/ml。
3.2含抗菌剂培养基的配制：将抗(抑)菌溶液用蒸馏水配制成不同浓度的受试液，取各稀释度受试液2.5ml加入到含有2.5ml双倍浓度营养肉汤培养基的试管中。
3.3取0.1ml含菌量为108cfu/ml的菌悬液，接种于含抗(抑)菌剂的营养肉汤的试管中，作为试验组样本。
3.4以同样方法接种菌悬液至不含抗(抑)菌剂的单倍营养肉汤试管中，作为阳性对照组样本。
3.5取2支仅含有单倍营养肉汤的试管，作为阴性对照组样本。
3.6将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置于37℃培养箱中培养，至阳性对照组肉汤变混浊，即取各试管中肉汤培养液1ml至平皿中，浇注培养基于37℃培养箱中进行培养，24-48h后观察结果。
3.7试验中应同时对试验用菌悬液进行活菌培养计数，浓度应为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。
4.结果判定
当阳性对照管有细菌生长(混浊)，阴性对照管无细菌生长(透明)，试验用菌悬液的作用浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml时，试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗(抑)菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。
5.实验结果
根据抑菌圈结果粉防己提取液只对金黄色葡萄球菌(ATCC 6358)，大肠杆菌(ATCC8739)有抑菌作用。所以最小抑菌浓度(MIC)只选取以上两个菌株。
表2
注：以上结果是将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置于37℃培养箱中培养，至阳性对照组肉汤变混浊，取各试管中肉汤培养液1ml至平皿中，浇注培养基于37℃培养箱中进行培养，24-48h后观察结果。粉防己提取液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度是0.25g/ml，对大肠杆菌的最小抑菌浓度是0.125g/ml。

Claims (10)

1.粉防己提取物在抑制细菌生长中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，所述粉防己提取物通过溶剂提取法制备。
3.如权利要求2所述的应用，所述溶剂是70％的乙醇。
4.如权利要求1-3中任一项所述的应用，所述细菌选自：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
5.粉防己提取物作为具有抑制细菌生长作用的添加剂在家用产品、消毒用品或个人护理产品中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，所述家用产品、消毒用品或个人护理产品包含浓度至少为0.125g/ml的粉防己提取物。
7.如权利要求5所述的应用，所述家用产品、消毒用品或个人护理产品包含浓度至少为0.25g/ml的粉防己提取物。
8.如权利要求6-7中任一项所述的应用，所述粉防己提取物通过溶剂提取法制备。
9.如权利要求8所述的应用，所述溶剂是70％的乙醇。
10.如权利要求6-7中任一项所述的应用，所述细菌选自：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
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