DK153798B - Apparat til brug ved paavisning af sygdomsvaekkere i blod - Google Patents

Description

1 ; DK 153798B

Septiske komplikationer står i dag i første række som dødsårsag for patienter, som på grund af en anden alvorlig sygdom ligger på intensivafdelinger. Årsagerne er den svækkede modstandsdygtighed over for infektioner på grund af grundsygdommen og udbredelsen af 5 sygdomsvækkere fra andre patienter, hvilken man ikke kan forhindre fuldstændigt.

Idag ..giver over 60 antibiotika fra 13 forskellige præparatgrupper muligheden for direkte at bekæmpe en påvist kim. En tidlig diagnose 10 og dermed en forbedret terapimulighed kan i væsentlig grad forbedre overlevelseschancen hos patienter med bakterielle eller fftykotiske systemangreb.

t

Diagnosen af et sepsis fremgår af det kliniske billede (feber, kulde-15 gysninger, leukocytose, forskydning mod venstre i differentialblod-billedet, forbrugskoagulopathie og andre,eventuelt septisk chok og andre ikke obligate tegn) og af den kulturelle kimpåvisning i patienternes blod. Ved positiv kimpåvisning giver antibiogrammet ligeledes vigtige holdepunkter for den mest virkningsfulde antibiotiske 20 eller antimykotiske terapi. De foreliggende almindelige bakteriologiske påvisningsmetoder udgør i det væsentlige kun tekniske varianter af den ved århundredeskiftet udviklede blodkulturteknik. Ved indføringen af liquoidvenulen og blodkulturflasken med forud færdigt næringssubstrat blev der opnået en relativ optimering af den klassiske 25 fremgangsmåde. Til kliniske forhold er dette udbytte imidlertid endnu ikke tilfredsstillende, heller ikke med denne fremgangsmåde.

De hidtidige forbedringer af blodkulturfremgangsmåderne begrænser sig til udviklingen af mere følsomme bakteriologiske påvisningsmetoder. Dette gælder såvel for den radiometriske måling af mærket 30 CC>2 som for membranfiltermetoden og videreudviklinger heraf.

Chancen for med den sædvanlige blodudtagelsesteknik til kulturformål at identificere sygdomsvækkeren er med kun 30% af alle klinisk sikre tilfælde alarmerende ringe. Denne lave træfsikkerhed kunne efter ^ den foreliggende viden have to årsager:

DK 153798 B

2 1. En septisk spredt smittekilde afgiver ikke sygdomsvækkerne kontinuerligt, men stødvis i blodbanen. Det ideelle tidspunkt til opnåelse af sygdomsvækkeren fra blodbanen" ligger allerede før begyndelsen af de kliniske symptomer som feber og kuldegysninger.

5 2. En stor del af patienterne er allerede forud behandlet med antibiotika. Disse antibiotika kommer uvægerligt sammen med sygdoms-vækkerne i kulturmediet og undertrykker kimvæksten. Blodkulturen Pliver på falsk måde negativ.

10

Dette betyder, at man i 70% af tilfældene af klinisk sikker sepsis kæmper mod en ukendt sygdomsvækker for det meste også uden at vide, om det drejer sig om en bakteriel sepsis eller om en svampesepsis. yalget af det rigtige antibiotikum eller antimykotikum bliver dermed"ti1 lykketræf.

I årevis har man forsøgt at drage slutninger af denne diagnostiske lykke. Der blev udviklet nye metoder, som hurtigere og mere sikkert 20 end de klassiske metoder skulle give påvisningen af sygdamsvækkere i blod.

Men også disse nye fremgangsmåder har beholdt tre forskellige ulemper. Blodprøven skal stadigvæk udtages nøjagtigt på tidspunktet for indførselen af mikroorganismer i cirkulationen i det ideelle tilfælde, altså før patienten reagerer med en temperaturstigning. Des-25 uden lykkes det altid kun at undersøge en lille prøve af det store blodreservoir. Ved antibiotisk forbehandlede patienter bliver endelig antibiotikarester bragt med ind i kulturen og bevirker dér en hæmning af kimvæksten.

30 Formålet med opfindelsen er derfor at tilvejebringe et apparat til brug ved påvisning af sygdomsvækkere såsom bakterier, svampe og vira i blod, således at man undgår de nævnte ulemper og får mulighed for at bestemme sygdomsvækkere, der på et ukendt tidspunkt trænger ind i patientens kredsløb, at isolere til diagnostiske formål, even-35 tuelt at befri for vedhæftende antibiotikarester og at bestemme med så ringe arbejdsomkostninger som muligt.

3 DK 153798 B

Dette opnås ifølge opfindelsen ved hjælp af et apparat til brug ved påvisning af sygdomsvækkere såsom bakterier, svampe og vira i blod i nærværelse af et koagulationshæmmende middel, hvorefter bakterierne, svampene og viraene påvises ved bakteriologiske, my-5 kologiske, viralogiske eller elektronmikroskopiske metoder, hvilket apparat er ejendommeligt ved, at det består af en i begge ender åben søjle (1), som kan placeres i et ekstrakorporalt blodomløb, og eventuelt er forsynet med et transfusionsset (6) med filter (7), og som indeholder et hæmokompatibélt adsorbe-10 rende stof (5), som selektivt binder sygdomsvækkeren, hvori det adsorberende stof (5) sammenholdes i begge ender af søjlen med et filter (2) og et ombøjet dæksel (3), hvilke dæksler har stutse til påsætning af blodtilførende og blodfraledende slanger (4).

15

Det til grund for opfindelsen liggende hæmoperfusionsprincip har igennem længere tid været anvendt til behandlingen af kraftige intoksikationer f.eks. sovemiddelforgiftninger. Det drejer sig her ved denne fremgangsmåde om udskilning af farmaka fra blodet 20 ved adsorption på carbon, altså en ren terapeutisk behandling.

Det ' .'var overraskende., at der nu kan stilles et apparat til rådighed, som muliggør påvisningen af infektøse partikler, dvs. mikroorganismer som bakterier og svampe samt vira, 25 uden at der sker signifikante ændringer af de naturlige blodbestand-dele som f.eks. erythrocytter,' léukocytter og“thfomb.ocytter.

Som adsorberende stoffer egner sig bioforligelige, dvs. frem for alt blodforligelige, altså hæmokompatible polymerer som selektivt 30 binder vækkerne, hvorhos disse anvendes som adsorberende stof per se, men også kan anvendes på en porøs bærer, dvs. alle polymerer., der kommer på tale, kan foruden som filmdanner også tjene som "lejemateriale”, såfremt de er tilstrækkeligt porøse eller kan gøres tilstrækkeligt porøse.

35

4 DK 153798B

Som polyrrerer kan f.eks. anvendes polyacrylater eller polymethacrylater som f.eks. polyhydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA). Som yderligere polymerer skal nævnes adsorberharpikser som AmberlitiP’xAD II, cellu= g loseacetat, kollodium og nylon. Som bærere for filmdannere kan f.eks. anvendes porøse materialer som glas, keramiske materialer f.eks. ler, metaloxider som aluminiumoxid, titanoxid, zirkoniumoxid, siliciumoxid eller aktivt carbon.

S)

Acrylhydrogenbelagt, vegetabilsk trækul ("Haemocole" ^ , Smith & Nephew, England) har vist sig egnet. Belægningsmiddelmængden udgør 0,5-10%., fortrinsvis 2% af det adsorberende stofs samlede vægt. Belægningsmetoden er velkendt for fagfolk og kræver ingen nærmere forklaring.

15

Der kan desuden som adsorberende stof anvendes med pådampet carbon belagt porøst materiale som f.eks. glas. Desuden egner sig også porøst glas, der er blevet bioforligeligt ved kobling med heparin og/eller albumin, der virker antithrombogent. Til dannelsen af 2g heparin kan f.eks. nævnes sammenknytningen ved hjælp af et vandopløseligt carbodiimid. Som glas egner sig det såkaldte "Controlled bor glass" (fremstilles af Corning Glass and Electronucleonics).

De adsorberende stoffer i apparatet ifølge opfindelsen kan også fore-25 ligge i form af små partikler eller kom, plader eller folier, son anbring-ges i hæmoperfusionskammeret og let udtages og bekvemt kan anbringes i næringssubstratet eller næringsopløsningen.

Bestemmelsen af sygdomsvækkeren sker fortrinsvis i adsorberet tilstand. Heri ligger en væsentlig fordel, da det adsorberende 30 stof med dertil bundet sygdomsvækker direkte kan anbringes i næringsmediet. Det kan underkastes de i og for sig kendte mikrobiologiske, virologiske eller elektronmikroskopiske påvisningsmetoder .

35 Hertil bliver det med sygdomsvækkerne berigede adsorberende stof i tilfældet med bakterier og svampe dyrket på følgende måde:

5 DK 153 79 8 B

Med en i et egnet næringsmedium steril pincet indtrykkes så skånsomt som muligt 20-30 adsorbens-partikler i næringssubstratets overflade. Samtidigt kan flydende næringsmedier belægges med nogle partikler. Udviklingen skete ved 37°C. Den yderligere identifika-5 tion skete med de sædvanlige rutinemæssige metoder fra bakteriologien og mykologien. I tilfældet med vira skete der en dyrkning på ægkulturer.

Det er desuden muligt at vaske det adsorberende stof med puffer, 10 at afvande med alkohol, behandle med pufret glutaraldehyd og undersøge rasterelektronmikroskopisk.

Dækslerne (3) i apparatet ifølge opfindelsen kan hensigtsmæssigt være således, at de kan skrues på søjlen. I hvert fald 15 kan de let og uden fare for forurening tages af til hurtig og bekvem udtømning af indholdet, hvilket er meget væsentligt.

Ved anvendelse af apparatet ifølge opfindelsen foretrækkes det, at blodafløbet er forsynet med et transfusionssæt (6) med filter (7). Som materiale til bestanddelene egner sig inakti- 90 ve, let forarbejdelige plastarter som teflon.

Det til rent diagnostiske formål bestemte apparat har hensigtmæssigt små dimensioner. Søjlen har fortrinsvis en diameter på 1-3 cm og en højde på 2-10 cm. Ved det ringe volumen af appa- 25 ratet fremkommer der ved anvendelse af det ingen af de teoretisk mulige bivirkninger som blodtryksfald, thrombocytopenie, tab af immunglobuliner, adsorption af indgivne medikamenter eller hæmolyse.

30

Alt i alt er apparatet ifølge opfindelsen af ringe volumen derfor klinisk acceptabelt, hvilket betyder et væsentligt teknisk fremskridt. Det er hurtigt og bekvemt at håndtere, er belastet med forholdsvis ringe fremstillingsomkostninger og således anvendeligt som éngangsartikel.

35

DK 153798B

6

Fig. 1 viser apparatet ifølge opfindelsen. Alle dele er fortrinsvis fremstillet af teflon og kan dermed steriliseres i autoklav ved 130°C. Apparatet fyldes fortrinsvis med acrylhy-drogelindkapslet vegetabilsk carbon og steriliseres efter gen-5 nemskylning med fysiologisk kogsaltopløsning ved 130°C i autoklav.

Dyreforsøg

Til sammenligning af effektiviteten af den konventionelle blodkultur med en kultur af perfusionscarbon anvendtes først dyreforsøg. Forsøgsdyrerne var 250-300 g tunge Wistarrotter.

En eksperimentel sepsis blev simuleret ved intravenøs injektion af definerede kimtal af Candida albicans. Indgangen for 15 hæmoperfusionen var PVC-slanger i iliacalkar. De blev anbragt i ethernarkose. De yderligere undersøgelser skete på voksne dyr i restriktionsburet.

Med en strømningshastighed på 1-2 ml/min. blev rotteblodet via 2t) en rullepumpe fra arterien via carbonkapselen transporteret tilbage i venen. I apparatet befandt sig 3 g acrylhydrogelbe-lagt vegetabilsk carbon ("Haemocole"®, Fa. Smith & Nephew, England), og systemets restblodfyldningsvolumen udgjorde 3 ml.

Til forsøgets begyndelse blev systemet fyldt med frisk blod 25 fra et donordyr. Til perfusionens begyndelse blev der antikoa-guleret med 100 IE heparin, og den senere nødvendige hepari-nisering rettede sig efter Lee-White-koagulationstiden.

60 min. efter intravenøs injektion af 1 ml af Candida-suspen-30 sionen blev der først udtaget en arteriel blodkultur, og i tilslutning dertil påbegyndtes perfusionen med en varighed på en time. Herved kan hæmoperfusionens virkning vises, idet man kvantitativt og kvalitativt bestemmer dels de sygdomsvækkere i blodet, som i løbet af en time har fordelt sig tilstrækkeligt 35 heri før perfusionen, dels de til carbon adsorberede sygdoms- 7

DK 153798B

vækkere efter perfusionen. Efter hæmoperfusionens afslutning blev det aktive carbon vasket under sterile betingelser med Ringer-opløsning. En del af carbonpartiklerne gik til kulturforsøget, den anden del efter fiksering med glutaraldehyd-5 Sørensen-puffer til rasterelektronmikroskopisk undersøgelse.

Kulturel diagnostik.

Den bakteriologiske forarbejdning af perfusionscarbon fra dyreforsøg 10 skete således, at perfusionscarbonet straks efter dyreforsøgets afslutning blev udtaget under sterile betingelser og oparbejdet bakteriologisk.

Hed en steril pipette blev der pr. plade fordelt ca. 20 car-15 bonpartikler på det faste næringsmedium, som blev trykket let ind i overfladen. Som næringssubstrat blev der til originalkulturerne anvendt flydende Saboraud-maltose-agar og til berigelserne eller opkoncentreringerne Saboraud-næringsmedium.

Som kontrol til bestemmelse af eventuelle forureninger blev 2ø der samtidigt medført blodagarplader og Mac Conkey-næringssub-strater. Støbeplader blev udfærdiget ved overhældning af ca.

20 over petriskålene fordelte carbonpartikler »ed flydende-gjort agarmedium.

25 På 2., 4. og 8. dag blev der fra de flydende berigelser (thioglycolat, druesukkerbouillon) podet materiale over på de samme næringssubstrater i fast form, som blev anvendt til originalkulturerne.

Præparationsteknik for rasterelektronmikroskopiske undersøgel- 30 ser.

Carbonpartiklerne blev efter udtagelse fra apparatet fikseret i 24 timer i 2-3%'s giutaraldehyd, pufret til pH-værdi 7,2.

Det fikserede materiale blev derpå vasket gentagne gange med forskellige pufferopløsninger og afvandet med en række portioner af alkohol i voksende koncentration. Fra den rene alkohol 35

DK 153798B

8 blev præparaterne i mindst fire trin overført i Frigen 11 (alkohol + Frigen: 2/1,1/1,1/2, rent Frigen) og konserveret i en trykbeholder efter den kritiske-punkt-metode.

5 Efter påføring af carbonpartiklerne på rasterelektronmikroskopets prøvetallerken blev der anbragt et elektrisk ledende lag ved hjælp af et vakuummetalfordampningsanlæg. Undersøgelsen skete med Steroscan Mark II fra firma Cambridge Ltd., England.

10 Med den diagnostiske hæmoperfuion, opnået ved anvendelse af apparatet ifølge opfindelsen, bliver der i modsætning til den forud diskuterede teknik tilstræbt en optimering af undersøgelsesmaterialet. En patient bliver herved i et længere tidsrum indskudt i kredsløbet, således at sygdomsvækkeren efter 15 indføringen må opfanges af apparatets adsorberende stof.

De med den diagnostiske hæmoperfusion gennemførte forsøg på rotten tyder på en større følsomhed af perfusionsmetoden i sammenligning med 1iquoidvenulen. Korrigerende forsøg med 20 grampositive og gramnegative kim taler for, at dette også gælder for bakterier. Den overlegne påvisningsfølsomhed dokumenteres ved en infektionsdosis på 105-107 kim pr. dyr og var positive ved hæmoperfusionskulturer, men overvejende negative ved 1iquoidvenuler. Ved 1iquoidvenulerne indtrådte i to ti 1 — 25 fælde en vækst på et forholdsvis senere tidspunkt. I et tilfælde forbliver kulturen opnået af adsorberende stof fra apparatet og 1iquoidvenulen negativ.

Det skal bemærkes, at kimene ved hæmoperfusionsmetoden i reg-30 len blev dyrket direkte, idet der adsorberes tilstrækkeligt mange sygdomsvækkere til perfusionscarbonet til, at det er unødvendigt at gå via omvejen over en flydende berigelse. Den bakteriologiske oparbejdning af carbonpartiklen til dyrkningen er simpel og kan gennemføres rutinemæssigt på ethvert bakte-35 riologisk laboratorium.

DK 153798B

9

Stabiliteten af bindingen af kim til carbonoverfladen åbner muligheden for en adskillelse af kim og vedhæftende antibiotikarester ved en simpel vaskebehandling.

5 Anvendelse af apparatet til mennesker

Et apparat af teflon fyldes med 2% acrylhydrogelbelagt, aktivt carbon (Smith % Nephew, England), steriliseres i autoklav og forbindes i et ekstrakorporalt kredsløb med patienten. Appara-10 tets tilslutning til patienten sker i reglen ved unilateral punktering af Arteria femoralis og Vena femoralis ifølge Sel-dinger-teknikken. Blodet gennemstrømmer apparatet fra oven og nedad. Det er ikke nødvendigt at indkoble en blodpumpe i systemet. Som yderligere sikring mod luft- eller partikelemboli-15 er tjener det kommercielle transfusionssæt i det venøse tilbageløb. For at forhindre en thrombosering i det ekstrakorporale kredsløb injiceres der før perfusionsbegyndelsen 5.000 IE heparin intravenøst. Skal der perfunderes længere end 60 min., kræves yderligere heparinindgivelse under kontrol af Lee-White-20 koagulationstid. Efter ønsket lang kontakttid med patientens strømmende blod afbrydes det ekstrakorporale kredsløb igen.

Det aktive carbon kan så ved vask med en steril elektrolytopløsning befries for vedhæftende antibiotikarester, før de sammen med de ligeledes vedhæftende sygdomsvækkere overføres i et 25 næringsmedium. I dette medium lykkes det så som beskrevet ovenfor at identificere kimene og at teste deres følsomhed over for forskellige antibiotika og antimykotika. Fra denne testning fås vigtige data til bestemmelse af, hvilket præparat der formodentlig kan holde patienten i live.

30

Til den tekniske gennemførelse af den diagnostiske hæmoperfusion findes der alt efter patientens kliniske tilstand to alternativer. Patienter med sepsis udvikler meget hyppigt som følgesygdom et akut nyresvigt. Når patienten på grund af nyresvigt jo alligevel 35 skal behandles med hæmodialysen, er det tilstrækkeligt at indskyde apparatet i dialyseslangesystemet og ganske vist i den arterielle side, men dog først efter blodpumpen. Alt efter cirkulationen er der dermed automatisk garanteret en kontakt af carbon med 100-200 ml blod pr. minut.

10

DK 153798 B

Hos nyresunde patienter med sepsis egner sig en anden fremgangsmåde. Carbonsøjlen befries først for luftblærer ved perfusion med en heparin-kogsaltopløsning (1000 IE til 1000 ml). Næste skridt er punkteringen af en arterie og en vene hos patienten med plastka-5 nyler, hvis minimumlumen skal udgøre 1,4 mm. Man går derpå frem efter Seldinger-teknikken. Så bliver den arterielle punkteringskanyle forbundet med apparatets øvre ende, og den venøse kanyle via et transfusionssæt med den nederste ende. Efter åbning af klemmerne injiceres endnu en gang 5000 IE heparin i systemet for 10 at undgå en koagulation. Systemets perfusion sker nu trykpassivt, dvs. uden indkobling af en pumpe,ved forskellen mellem det arterielle og venøse tryk. Den optimale varighed af den diagnostiske hæmoper-fusion ligger på ca. 60 minutter. Den gennemsnitlige cirkulation ved den her skildrede trykpassive perfusion ligger ved 30 ml pr.

15 minut.

Således kan der sammenfattet defineres følgende fordele ved hæmo-perfusionsmetoden i forhold til de sædvanlige metoder.

20 Hæmoperfusionen udmærker sig i forhold til den sædvanlige blodkulturteknik ved en større påvisningsfølsomhed. Desuden har den den fordel, at kulturresultaterne og dermed antibiogrammerne af resistenstestningen foreligger tidligere. Ved en skylning efter hæmo-perfusionen kan det forhindres, at antibiotikarester kommer ind i 25 kulturen.

En fordel består dog i muligheden af en længere varende nær værelse i menneskets kredsløb. Derved forhøjes sandsynligheden for ikke at forpasse tidspunktet for en kimindførsel.

30

Ved sædvanlige blodkulturer er det uheldigt, at de i reglen skal gentages flere gange. Apparattilgangene, som er nødvendige ved hæmoperfusionen, er ofte allerede til stede på grund af andre indikationer (dialyse, hjertekirurgi, arteriel trykovervågning osv.). 35 I disse situationer er det tilstrækkeligt at forbinde .apparatet med de foreliggende tilslutninger. Specielt under en dialysebehandling er en indsætning af apparatet i det arterielle system uden problemer.

Claims (5)

1. Apparat til brug ved påvisning af sygdomsvækkere såsom 20 bakterier, svampe og vira i blod i nærværelse af et koagulationshæmmende middel, hvorefter bakterierne, svampene og viraene påvises ved bakteriologiske, mykologiske, viralogiske eller elektronmikroskopiske metoder, k en d e t e g - n e t tfed, at det består af en i begge ender åben søjle (1), 25 som kan placeres i et ekstrakorporalt blodomløb, og eventuelt er forsynet med et transfusionssæt (6) med filter (7), og som indeholder et hæmokompatibelt, adsorberende stof (5), som selektivt binder sygdomsvækkeren, hvori det adsorberende stof (5) sammenholdes i begge ender af søjlen med et filter (2) og 30 et ombøjet dæksel (3), hvilke dæksler har stutse til påsætning af blodtilførende og blodfraledende slanger (4).

2. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det adsorberende stof foreligger i form af korn, plader eller fo- 35 lier.

3. Apparat ifølge et af kravene 1 og 2, kendetegnet ved, at dækslet (3) kan skrues på søjlen. DK 153798 B

4. Apparat ifølget et af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det består af inaktiv plast som teflon.

5. Apparat ifølge et af kravene 1-4, kendetegnet 5 ved, at søjlen har en diameter på 1-3 cm og en højde på 2-10 cm. 10 15 20 25 30 35