CN107810417A - 分析物识别分子的表面固定化 - Google Patents

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Abstract

一种将分析物识别分子(1)固定在用化学基团Y1官能化的表面(2')上的方法，所述化学基团Y1适于与偶联分子(7)的化学基团X2反应以形成包含化学基团Y2的反应产物，所述化学基团Y2适于与该分析物识别分子(1)反应，所述方法包括以下步骤：a.提供该官能化的表面(2')，b.使该官能化的表面(2')与同时包含以下物质的溶液(6)接触：i.该偶联分子(7)和ii.该分析物识别分子(1)。

Description

分析物识别分子的表面固定化
技术领域
领域本发明涉及传感器领域，特别涉及用于检测样品中的分析物的生物传感器。具体而言，本发明涉及一种将分析物识别分子固定在传感器表面上的方法。
背景技术
在集成和小型化的生物传感器装置(也被称为实验室芯片装置)中，生物传感器是微流体平台的一部分，可以快速自动地流式检测分析物。为了确保最佳灵敏度，需要传感器区域上的分析物识别分子或受体的位点选择性偶联。
已经尝试了不同的表面化学，主要是有机硅烷的自组装单层，以确保分析物识别分子与各种生物传感器装置的共价结合。为此，已经使用了具有对分析物识别分子(例如抗体)具有反应性的官能团的硅烷，例如环氧-硅烷。但是，这些反应性官能团容易水解，并且其储存(特别是在含有H2O的气氛下的)稳定性受到限制。另一种更优选和广泛使用的方法是将较少的反应性基团与连接基团组合使用。J.Ryken等(传感器和致动器B 200(sensorsand actuators B 200)(2014)167-172)已经描述了这种方法的示例，并且包括在第一步中使用交联剂以活化硅烷，使得其可以在第二步中能与分析物识别分子反应。这是使用两步方案完成的，其中首先使用交联剂活化生物传感器底物，接着在第二反应中使分析物识别分子缀合。
为了以成本有效的方式在整个晶片尺度上固定分析物识别分子，在生物传感器换能器的区域上产生微滴阵列的非接触微阵列印刷技术(“点样”)最适合。为了能够点样，用于点样分析物识别分子的底物和溶液都应该足够稳定。另外，两步法涉及到点对点(spot-on-spot)沉积，其中中间洗涤步骤在实践中不容易实施，尤其是无法以高通量的方式实施。因此，本领域需要在表面上固定分析物识别分子的方法，其克服或改善现有技术的一个或多个上述缺点。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于将分析物识别分子固定在表面上的良好方法，溶液和多部分试剂盒。
本发明的实施方式的优点是分析物识别分子在官能化表面上的固定可以在单个步骤中进行，从而易于制造。
本发明的实施方式的优点在于，在分析物识别分子被固定在表面上之前不引入比-SH或-NH2更具反应性的反应性基团，从而确保分析物识别分子在其固定在官能化表面之前的时间中的稳定性。
本发明的实施方式的优点是偶联分子直到紧临分析物识别分子与表面接触之前才与表面或分析物识别分子接触。这促进了表面和分析物识别分子的适时的稳定性。
本发明实施方式的优点是本发明的单步方法提供了对固定过程和分析物检测能力的保存(通常通过保持分析物识别生物分子的生物活性)的良好控制。
本发明的实施方式的优点在于它代表了现有技术的两步法的优异单步替代方案，具有相当的控制和分析物检测能力。
本发明实施方式的优点是，在固定分析物识别分子之前，官能化表面可以长时间稳定。
本发明的实施方式的优点在于分析物识别分子在表面上的固定是非常稳定的，特别是共价的情况。
本发明的实施方式的优点是分析物识别分子的均匀致密的小液滴阵列可以通过非接触式微阵列印刷而容易地在一个步骤中被点样。两步法具有连续点样步骤之间可能的不良重叠的缺陷，并且对于精确的点对点打印，需要良好的对准。另外，两步法需要中间洗涤步骤。
上述目的是通过本发明所述的一种方法和器件实现的。
在第一方面，本发明涉及一种将分析物识别分子固定在用化学基团Y1官能化的表面上的方法，所述化学基团Y1适于与偶联分子的化学基团X2反应以形成包含化学基团Y2的反应产物，所述化学基团Y2适于与该分析物识别分子反应，所述方法包括以下步骤：
a.提供该官能化表面，
b.使该官能化的表面与同时包含以下物质的溶液接触：
i.该偶联分子，和
ii.该分析物识别分子。
在第二方面，本发明涉及同时包含下述物质的溶液：
i.具有化学基团X2的偶联分子，所述化学基团X2适于与表面的化学基团Y1反应以形成包含化学基团Y2的反应产物，所述化学基团Y2适于与分析物识别分子反应，和
ii.该分析物识别分子。
在第三方面，本发明涉及一种多部分试剂盒，其包含：
a.第一溶液，其包含具有化学基团X2的偶联分子，所述化学基团X2适于与表面的化学基团Y1反应以形成包含化学基团Y2的反应产物，所述化学基团Y2适于与分析物识别分子反应，和
b.第二溶液，其包含所述分析物识别分子，
其中当所述第一和第二溶液混合时，形成包含下述物质的溶液：
●浓度至少等于1μM且至多等于1mM的该偶联分子，
●浓度至少等于1*10-12mol/L，优选至少等于1*10-8mol/L，的该分析物识别分子。
本发明特定和优选的方面在所附独立和从属权利要求中阐述。可以将从属权利要求中的特征与独立权利要求中的特征以及其它从属权利要求中的特征进行适当组合，而并不仅限于权利要求书中明确所述的情况。
虽然本领域中一直存在对方法和装置的改进、改变和发展，但本发明的概念被认为代表了充分新和新颖的改进，包括改变现有实践，导致提供了该性质的更有效、更稳定和更可靠的方法和装置。
本发明的教导允许对用于将分析物识别分子固定在表面上的改进的方法和设备的设计。
本发明的上述和其他特性、特征和优点会在下文具体实施方式中结合附图变得显而易见，其通过实例说明本发明的原理。本说明书仅为了举例，而不是限制本发明的范围。下文引用的参考图是指附图。
附图的简要说明
图1是根据本发明的一个实施方式的用于固定分析物识别分子的方法的示意图。
图2是在本发明的实施方式中分析物识别分子固定化之后获得的SPR信号作为偶联分子浓度的函数的图。
图3是在本发明的实施方式中分析物的识别之后获得的SPR信号作为偶联分子浓度的函数的图。
图4是在本发明的实施方式中分析物的识别之后获得的SPR信号作为分析物浓度的函数的图。
图5是比较在不同表面与胎牛血清接触后获得的SPR信号的图，所述表面之一根据本发明的一个实施方式制备。
图6是比较在本发明的实施方式中使用封闭剂与不使用它们的示意图。
图7是根据本发明的实施方式，由荧光分析物发射的荧光作为用于覆盖官能化表面的封闭剂的性质的函数的图。
图8是荧光分析物发射的荧光作为分析物识别分子固定后使用的封闭剂的性质的函数的图。
说明性实施方式的描述
将就具体实施方式并参照某些附图对本发明进行描述，但本发明并不受此限制，仅由权利要求书限定。描述的附图仅是说明性的且是非限制性的。在附图中，一些元素的尺寸可能被夸大且未按比例尺绘画以用于说明目的。所述尺寸和相对尺寸不与本发明实践的实际减小相对应。
此外，在说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用来区别类似的元件，而不一定是用来描述时间、空间、等级顺序或任何其它方式的顺序。应理解，如此使用的术语在合适情况下可互换使用，本发明所述的实施方式能够按照本文所述或说明的顺序以外的其它顺序进行操作。
此外，在说明书和权利要求书中，术语顶部、底部、之上、之下等用于描述目的，而不一定用于描述相对位置。应理解，如此使用的术语在合适情况下可互换使用，本发明所述的实施方式能够按照本文所述或说明的取向以外的其它取向进行操作。
应注意，权利要求中使用的术语“包含”不应解释为被限制为其后列出的部分，其不排除其它元件或步骤。因此，其应被理解为指出所述特征、集成、步骤或组分的存在，但这并不排除一种或多种其它特征、集成、步骤或组分或其组合的存在或添加。因此，表述“包含部件A和B的装置”的范围不应被限制为所述装置仅由组件A和B构成。其表示对于本发明，所述装置的相关组件仅为A和B。
应注意，权利要求中使用的术语“偶联(或耦合)”不应解释为被限制仅限于直接连接。可以使用术语“偶联(或耦合)”和“连接”以及它们的衍生词。应该理解，这些术语不作为彼此的同义词。因此，表述“偶联(或耦合)到装置B的装置A”的范围不应当限于其中装置A的输出直接连接到装置B的输入的装置或系统。这意味着在装置A的输出和B的输入之间存在路径，其可以是包括其他装置或器件的路径。“偶联(或耦合)”可以意味着两个或更多个元件直接物理接触或者电接触，或者两个或者更多个元件彼此不直接接触，而是仍然彼此协作或相互作用。
说明书中提及的“一个实施方式”或“一种实施方式”是指连同实施方式描述的具体特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，在说明书中各处出现的短语“在一个实施方式中”或“在一种实施方式中”不一定全部指同一个实施方式，但可能全部都指同一个实施方式。此外，具体特征、结构或特性可以任何合适方式在一个或多个实施方式中组合，这对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
类似地，应理解，在本发明的示例性实施方式的描述中，本发明的不同特征有时组合成一个单一实施方式、特征或其描述，这是为了简化公开内容并帮助理解本发明的一个或多个不同方面。然而，本公开内容中的方法不应被理解为反映一项发明，请求保护的本发明需要比各权利要求中明确引用的具有更多的特征。并且，如同所附权利要求所反映的那样，发明方面包括的特征可能会少于前述公开的一个单一实施方式的全部特征。因此，具体说明之后的权利要求将被明确地纳入该具体说明，并且各权利要求本身基于本发明独立的实施方式。
此外，当本文所述的一些实施方式包括一些但不包括其它实施方式中所包括的其它特征时，不同实施方式的特征的组合应意在包括在本发明范围内，并且形成不同的实施方式，这应被本领域技术人员所理解。例如，在之后的权利要求中，所请求保护的任何实施方式可以任何组合形式使用。
本文的描述中阐述了众多的具体细节。然而应理解，本发明的实施方式可不用这些具体细节进行实施。在其它情况中，为了不混淆对该说明书的理解，没有详细描述众所周知的方法、步骤和技术。
提供以下术语仅帮助理解本发明。
如本文所用且除非另外提供，术语“分析物”是指可以通过与分析物识别分子结合而在测定中检测到的要素(通常为化学化合物)。该结合是选择性的并且优选是特异性。因此，分析物可以是例如但不限于对于其存在天然产生的抗体或可以针对其制备抗体的任何物质。分析物可以是但不限于互补核酸链(DNA，PNA，RNA)，半抗原，碳水化合物，脂质，细胞，蛋白质和激素，抗生素，抗体，抗原，酶，药物或滥用药物。
现在通过对本发明若干实施方式的详细描述来描述本发明。很明显，可根据本领域技术人员的知识构建本发明的其它实施方式，而不背离本发明的技术教示，本发明仅受所附权利要求书条款的限制。
在第一方面，本发明涉及一种将分析物识别分子固定在表面上的方法。
这种固定可以通过任何类型的化学键合来实现，例如共价键合，静电键合，氢键键合或其组合。优选地，固定可以通过共价键合来实现。
分析物识别分子是与分析物相互作用并且优选结合分析物的分子，具有选择性并且优选具有特异性。
在实施方式中，分析物识别分子可以是第一生物分子，如蛋白质。分析物识别分子优选是蛋白质。例如，蛋白质可以是抗体或酶。在抗体的情况下，分析物可以是对该抗体特异性的抗原。在酶的情况下，分析物可以是对该酶具有特异性的底物。
在实施方式中，分析物识别分子可以是生物识别分子，即分析物可以是生物分子。
在实施方式中，分析物识别分子可以包含至少一个-NH2，-SH，-COOH，-OH，醛或酮或磷酸酯或焦磷酸酯基团，并且所述偶联分子可以分别适合于与-NH2，-COOH，-OH，醛或酮，或磷酸酯或焦磷酸酯基团反应。优选地，分析物识别分子可以包含至少一个-NH2或-SH。
在所述分析物识别分子具有-NH2基团的实施方式中，Y2可选自邻酰基异脲，N-羟基琥珀酰亚胺酯，异硫氰酸酯，异氰酸酯，酰基叠氮化物，磺酰氯，醛，环氧乙烷，羧基，碳酸酯，芳基化剂，亚氨酸酯，酸酐，氟苯基酯和羟甲基膦衍生物。
在分析物识别分子具有-SH基团的实施方式中，Y2可选自活化卤素(例如卤代乙酰基，苄基卤化物和烷基卤化物)，马来酰亚胺，氮丙啶，丙烯酰基，乙烯基砜，芳基化剂和二硫化物(例如吡啶基二硫化物)。
在分析物识别分子具有-COOH基团的实施方式中，Y2可以选自重氮烷和重氮乙酰。
在分析物识别分子具有醛基或酮基的实施方式中，Y2可以选自酰肼和-NH2。
在分析物识别分子具有磷酸酯或焦磷酸酯基团的实施方式中，Y2可以是羰基二咪唑(例如用于与-NH2反应)。
在活化的卤素中，相对反应性为I>Br>CI>F，F几乎不反应。
芳基化剂是反应性芳族化合物，其在环上含有反应性可替代基团，可以进行亲核芳族取代。该反应性可替代基团通常是卤素或磺酸酯基团。环上吸电子基团(例如硝基)的存在增加了反应性可替代基团的反应性。芳基化剂中反应性可替代基团的相对反应速率为F>Cl，Br>磺酸盐。
优选地，Y2是N-羟基琥珀酰亚胺酯。
Y2基团经优选选择为使其对分析物识别分子的反应性低于X2对Y1的反应性。这限制了与每个分析物识别分子反应的偶联分子的数量，从而保持了分析物识别分子对分析物的亲和性。
包含分析物识别分子和偶联分子的溶液可以进一步包含稳定剂。
可以添加到分析物识别分子以延长稳定性的化合物的示例是例如冷冻保护剂如甘油或乙二醇，以防止在-20℃形成破坏蛋白质结构的冰晶；蛋白酶抑制剂例如苯甲基磺酰氟、苄基脒，Petstatin A，亮抑蛋白酶肽，抑肽酶，抗痛素(Antipain)，EDTA和EGTA，以防止蛋白质的蛋白水解裂解；抗微生物剂如NaN3或硫柳汞，以抑制微生物生长；金属螯合剂如EDTA，以避免金属诱导的-SH基团的氧化；还原剂如二硫苏糖醇(DTT)和2-巯基乙醇(2-ME)，以使蛋白质保持在还原态；多元醇和糖例如甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，甘露醇(mannisdomannitol)，葡糖基甘油，葡萄糖，果糖，蔗糖，海藻糖，异氟甙，以稳定水合壳并防止聚集；聚合物例如葡聚糖，左旋聚糖和聚乙二醇以防止蛋白质聚集；氨基酸和衍生物如甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，牛磺酸，甜菜碱，章鱼碱，谷氨酸，肌氨酸，γ-氨基丁酸，三甲胺N-氧化物；低浓度的大阴离子盐，如柠檬酸盐，硫酸盐，乙酸盐，磷酸盐和季胺。
稳定剂可能是市售可得的溶液(例如，Surmodics公司，Gwent集团)，其包括上面列出的组分或其他制剂。
包含分析物的样品通常是包含分析物的流体。在实施方式中，流体是气体或液体。优选它是液体。优选它是水性溶液。优选它是生物液体如血液，血清或尿液。
该表面通常是基材的表面。
在实施方式中，基材可以是选自金属，金属氧化物，金属氮化物，金属氧氮化物，准金属，准金属氧化物，准金属氮化物，准金属氧氮化物和准金属碳化物的无机基材。
无机基材优选自Si、SiO2、Si3N4、SiC、SiOxNy、Al2O3、AlN、TiO2、TiN、TiC、TiCN、Ta2O3、TaN、TaC、TaCN、ZrO2、HfO2、HfSiO、HfSiON、ZrSiO、ZrSiON、HfN、Au、Pt、Pd、Ru和Cu，其中x为0-2。其中y是0-1.33。
当化学基团Y1被硅烷引入并且当这些基材在其表面上没有活性氧物质时，这些表面优选被羟基化以允许与硅烷反应。
在实施方式中，基材可以涂覆有机聚合物层或者可以是有机基材如聚合物基材。例如，聚合物基材或聚合物层可以由具有Y1侧链和/或端基的聚合物制成。
在实施方式中，表面可以是微流体系统的一部分。
在实施方式中，表面可以是微流体通道的底部或顶部。第一方面的方法对于将分析物识别分子固定在微流体装置中的微流体通道中是特别有用的。微流体装置包括小尺寸的微流体通道，并且有利的是在形成通道的侧壁之前(或之后)将分析物识别分子固定在非常特定的位置处。第一方面的方法的接触步骤由单个步骤组成，这简化了这种固定。
在实施方式中，表面可以被成型为使得其形成微流体通道，微孔，储液器或其至少一部分。
简而言之，根据本发明的方法可以集成在用于形成微流体生物传感器的方法中，所述方法包括以下步骤：将换能器耦合到表面；使通道(例如微通道)图案化，所述通道底部包括所述表面；通过根据第一方面的任何实施方式的方法将分析物识别分子固定到所述表面上，并且在所述通道的顶部提供覆盖物。进一步完善装置的步骤是粘合，分割和封装该装置。
微流体设计为本领域技术人员所熟知，因此不再详细讨论。
在实施方式中，表面可以与换能器耦合，以在分析物与固定的分析物识别分子相互作用(例如结合)时产生可读信号输出。表面与固定在其上的分析物识别分子以及换能器的组合存在形成允许检测分析物的传感器的主要要素。
表面用适于与偶联分子(7)的化学基团X2反应的化学基团Y1官能化。
在实施方式中，具有化学基团Y1的表面的官能化可以在晶片的整个表面上进行。
在实施方式中，用化学基团Y1官能化的表面可包含被由包含化学基团Y1的至少一种第一分子物质形成的层覆盖的表面。
在实施方式中，该层可以是自组装层。
在实施方式中，该层可以是单层，优选自组装单层。当然也可以是多层，但是由于该方法需要的是在表面上存在化学基团Y1，所以单层是足够的并且优选的，以便不占用太多的空间。这在其中在通道中流动流体的空间不应减少太多的微流体中特别有用。
在实施方式中，层(多层或单层)可以具有多至10μm的厚度，但是优选具有至多10nm的厚度。这在微流体应用中是有利的，其中层不应该使流体可流动的空间减少太多。优选地，对于诸如光学传感器等的某些传感器，该层可以具有0.5至5nm的厚度。
可以使用各种方法来提供层。单层最好通过在包含化学基团Y1的第一分子物质的溶液中浸涂进行自组装来提供。例如可以通过旋涂这种溶液来提供较厚的层。该溶液通常是在溶剂中的1-10％溶液。典型的溶剂的例子是甲苯，THF，环己烷和苯。
在实施方式中，用Y1官能团官能化表面可以通过气相沉积进行。在该沉积方法中，第一分子物质的蒸气可以通过加热和/或低压产生，然后沉积在表面上。这种气相涂层优于溶液涂层，因为其能被更好地控制且更有效。但是，如果第一种分子物质不能被挥发，当然可以使用基于溶液的方法。
另外，官能团Y1也可以通过电接枝技术引入，例如，导电表面上的重氮盐的还原，炔烃在Si-H上的接枝，但其它反应也是可能的(参见例如，Bilanger和Pinson,Chem.Soc.Rev.40,3995-4048(2011)。
在实施方式中，该方法的步骤a可以包括以下步骤：
a1.提供裸露的表面，
a2.使裸露的表面与包含至少一种第一分子物质的第一组合物接触，所述至少一种第一分子物质包含化学基团Y1以及适合于连接至少一种第一分子物质到该裸露表面的化学基团X1。
在实施方式中，所述至少一种第一分子物质可以具有通式X1-R-Y1，其中R是间隔物，例如直链或支化的、饱和或不饱和的有机基团。优选地，R是直链不饱和有机基团。
在实施方式中，R可包含亚苯基或者烯基。例如当表面属于电化学传感器时，这是有利的。
在实施方式中，R可以由3至400个原子，优选3至320个原子，更优选3至250个原子，还更优选3至80个原子，最优选30至80个原子组成。优选地，这些原子选自碳，氢和氧。
在实施方式中，X1-R-Y1可具有结构式X1-(R1)q-(O[CH2]tCH2)m-O-(CH2)o-Y1或X1-(R1)q-(O[CH2]tCH2)m-(CH2)o-Y1、优选X1-(R1)q-(O[CH2]tCH2)m-O-(CH2)o-Y1。
o是0-30的整数，优选0-3，最优选o是0。
m是0至15000的整数，优选1至1250，更优选2至1000，3至500，3至100，3至50，3至30，3至20，3至15，3至10，3至8的整数。或者，m是0至30，1至20，1至15，1至10，1至8或1至6的整数。在实施方式中，m可以是0。在一些实施方式中，m和o都是0。
q是0或1。
t是1或2，优选1。
优选选择R1使得形成稳定的有序单层。
R1优选促进自组装单层的形成，并且可以是有机链，例如亚烃基(hydrocarbylene)基团。有机基团可以包括n个碳原子，n是高于(或等于)1、3、6、8或10、优选1至30、更优选3至30的整数。R1还可以代表被-CO-(酮)，-CONH，-CONHCO-，-CSNH-，-CS-等中断的烃基。例如亚烃基可以任选地在该亚烃基的主链中包含一个或多个羧基。亚烃基也可以被一个或多个杂原子中断。杂原子可以选自-N-，-O-和-S-。特别地，杂原子可以是O。例如，R1可以在亚烃基的主链中包含一个或多个杂原子。有机基团也可以是支化的。R1可以包括第一部分和第二部分，所述第一部分是亚烃基，所述第二部分是被杂原子如氧隔开的亚烃基。
在一个有利的实施方式中，R1可以是或者包含烷基链-(CH2)n-，n是1至30，优选3至30，例如3至25，优选3至20，例如5至20，或8至16或10至16，的整数。
在优选的实施方式中，R1可以是具有1至30个碳原子(优选具有3至30个碳原子)的饱和或烯属(ethylenically)不饱和亚烃基，其选自烷基，烯基，环烷基，环烷基-烷基，环烯基，环烯基烷基和环烷基烯基，所述基团任选地在主链中包含选自氮、氧和硫的一个或多个杂原子，并且所述基团任选地包含一个或多个氧代取代基。
在实施方式中，X1–R-Y1可以是X1-(CH2)n–(OCH2CH2)m-O-(CH2)o-Y1或X1-(CH2)n–(OCH2CH2)m-(CH2)o-Y1，并且优选X1-(CH2)n–(OCH2CH2)m-O-(CH2)o-Y1，其中m，n和o是从0到30的范围内独立选择的整数，其中m和n中的至少一个大于0。
在实施方式中，n可以从8到13。
在实施方式中，m可以从6到9。这样的m值通常给出了由第一分子物质形成的层的空间占有率与第一分子物质的溶解度之间的最佳折衷。
在实施方式中，o可以等于0。
在实施方式中，步骤b可以包括使裸露表面与至少一种第一分子物质的蒸气接触。
在实施方式中，所述至少一种第一分子物质可以包含具有不同长度的至少两种第一分子物质。这是有利的，因为它改善了涂层的防污性能。
在该最后实施方式中，至少两种第一分子物质可以具有相同的n但不同的m。
在实施方式中，X1可以选自X1a，X1b和X1c，其中
●X1选自-SiZx(CH3)y，其中Z选自Cl，OCH3和OCH2CH5且y＝0、1或2且x＝3-y，-COOH，-PO(OH)2，-NH2，和其中*表示具有Si原子的连接点，
●X1b是-SH或-SeH，并且
●X1c选自-CH＝CH2和-C≡CH，
其中如果X1是X1a，则裸露表面包含OH基(对X1a具有反应性)，
其中如果X1是X1b，则裸露表面是金属表面，
其中如果X1是X1c，则基团Y1不是-N3并且裸露表面包含Si-H基团。
优选选择Y1使得它比X2更容易与分析物识别分子(例如该分子的-NH2和/或-SH基团)反应。优选地，Y1不直接与分析物识别分子反应。因此Y1不优选醛。
在实施方式中，Y1可以选自-N3，炔烃和-COOH，其中：
●如果Y1是-N3，则X2是应变或未应变的炔，并且如果所述炔未应变，则步骤b在适于使未应变的炔与–N3反应的催化剂的存在下进行，
●如果Y1是应变或未应变的炔，则X2是-N3，并且如果所述炔未应变，则步骤b在适于使未应变的炔与–N3反应的催化剂的存在下进行，
●如果Y1是-COOH，则X2是碳化二亚胺或重氮基团＝N2。
-N3基团具有非常稳定的优点，并因此提供非常稳定的表面。
不太优选-COOH。
合适的催化剂是铜基催化剂。Cu(I)和Cu(II)催化剂都适合。Cu(I)催化剂是优选的。一般而言，Cu(I)或Cu(II)催化剂的量将为含有炔和叠氮化合物的重量的0.01％至5％。Cu(I)催化剂可以通过添加Cu(II)物质和还原剂如抗坏血酸盐来提供。
在实施方式中，Y1与X2之间的结合反应速率可以高于Y2与分析物识别分子之间的结合反应速率。
在一个实施方式中，Y1可以是-COOH，X2可以是碳二亚胺，并且Y2可以是邻-酰基异脲。当X2为碳二亚胺时，偶联分子通常仅包含基团X2，基团Y2仅在X2与Y1反应之后形成。结果，该偶联分子能够连接分析物识别分子，但是它不存在于最终的反应产物中。因此它不会在官能化表面和分析物识别分子之间引入间隔物。这在下面的反应方案中进行了解释：
其中R1-COOH代表官能化的表面，并且其中R2-NH2表示分析物识别分子。在官能化表面和碳化二亚胺的反应产物与R2-NH2反应之前，可以使该反应产物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，由此形成可以随后与R2-NH2反应的NHS-酯。
Y1和X2基团的这种选择的优点在于反应产物的Y2(邻酰基异脲)和分析物识别分子的-NH2的反应不能在Y1和X2的反应之前发生。
例如，Y1可以是-COOH，偶联分子可以是1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺或其盐。
在实施方式中，Y1可以是-N3并且X2可以是环炔烃的炔基。这是有利的，因为环炔中的炔基通常是应变的，这使得它比非应变的环炔更具反应性。结果，该应变的炔可以与-N3基团反应而不需要催化剂。环炔的示例如下式所示：
其中：各R1独立地选自氢，卤素，羟基，烷氧基，硝酸酯，亚硝酸酯，硫酸酯和C1-C10有机基团；各R2独立地选自氢，卤素，羟基，烷氧基，硝酸酯，亚硝酸酯，硫酸酯和C1-C10有机基团；其中X可以是通过接头与Y2基团连接的碳或氮基团。具体的例子是在实施例中使用的DBCO-PEG4-NHS(德国Jena(耶拿)生物科学公司)。
Y1和X2基团的这种选择的优点在于Y1和X2的反应通常会比Y2与-分析物识别分子的–SH或-NH2的反应快。
在实施方式中，以这样的方式选择X2和Y2，使得X2与Y1反应比与Y2的反应更容易。这可以避免偶联分子的聚合。
在一个优选的实施方式中，Y1是-N3，X2是应变的炔，并且Y2是N-羟基琥珀酰亚胺酯。该实施方式具有如下优点：稳定的-N3官能化表面和高于Y2与识别分析物分子的-NH2之间的反应速率的X2和Y1之间的反应速率。
在实施方式中，溶液可具有4至9的pH。最佳的pH值取决于所使用的交联剂的类型。对于实施例中使用的交联剂，pH优选为5～9，更优选为5～7。
在实施方式中，所述溶液具有0.01至0.5M的离子强度。
在实施方式中，所述溶液可以进一步包含缓冲化合物。例如，缓冲化合物可以是乙酸钠/乙酸缓冲液。
在实施方式中，缓冲化合物可以不含伯氨基或仲氨基。
在实施方式中，该溶液可以是水性的。一个优选的实施方式是pH 4-9、离子强度为0.01-0.5M、并包含缓冲化合物的水性溶液。
在实施方式中，该溶液可以包含均匀剂。均匀剂的例子是甜菜碱，多元醇(例如甘油)，糖(例如海藻糖)和表面活性剂(例如吐温-20)。
在实施方式中，溶液可以包含浓度至少等于1μM的偶联分子。
在实施方式中，所述溶液可以包含浓度为至多1mM，优选至多100μM，更优选至多10μM的偶联分子。
在实施方式中，分析物识别分子可以以至少等于1×10-12，优选至少等于1×10- 8mol/l的浓度存在于溶液中。
在实施方式中，溶液可以包含分析物识别分子，偶联分子可以通过在步骤b之前至多3小时，优选至多1小时，最优选至多30分钟混合分析物识别分子和偶联分子来制备。
在实施方式中，偶联分子可以具有通式X2-R2-Y2，其中R2是含有1-30个碳原子的支化或不支化的、饱和或不饱和的有机基团，其任选地包含选自-N-、-O-和-S-的一个或多个杂原子，并且任选地包含一个或多个氧代取代基。
在实施方式中，R2可以定义为在任何实施方式中定义的R。
在实施方式中，偶联分子可以具有通式X2–(CH2)n–(OCH2CH2)m-O-(CH2)o–Y2，其中n是0-30、优选0-10的整数，m是0-15000、优选0-10的整数，o是0-30、优选0-10的整数，其中n+m+o至少等于1。
在实施方式中，m可以是1至10，优选2至6。使m在该范围内可能有助于溶解偶联分子。
在实施方式中，步骤b可以包括在溶液的液滴(优选具有1pL至2000pL的液滴尺寸)的官能化表面上的沉积。例如，步骤b可以包括非接触式微阵列印刷步骤。利用某些先进的点样工具，可以使用AFM样尖端通过直接书写工艺来沉积小体积的溶液(10-15–10-18L)。
目前通过液滴沉积溶液是在包含在微流体装置中的表面上引入分析物识别分子的最优选方式。当通过液滴进行沉积时，本发明是特别有利的。实际上，使用两步骤液滴介导的沉积是特别困难的，其中第二滴必须精确地沉积在第一滴沉积的地方，并且在第一滴和第二滴之间需要清洗步骤。在本发明中，由于步骤b是以单一步骤执行的，所以不需要第二滴。
或者，步骤b可以包括使溶液流过表面的步骤。如果表面包含在流体装置的通道的底部或顶部中，则步骤b可以包括使溶液在通道中流动。
在实施方式中，可以在用Y1化学基团官能化表面之后(或期间)或者优选在分析物识别分子固定之后(或期间)引入封闭剂。封闭剂的存在是有利的，因为它防止分析物的损失和分析物与表面的非特异性结合。
该封闭剂在携带分析物识别分子的表面与分析物接触之前被引入。或者，也可以在同一步骤中将其与分析物一起引入。这允许覆盖其上不具有分析物识别分子的表面的任何部分，由此减少分析物与远离分析物识别分子的表面之间的非选择性或非特异性相互作用的程度。合适的封闭剂的示例是牛血清提取物，例如试验稀释剂(Assay Diluent)(含有牛血清的磷酸盐缓冲盐溶液)，牛血清白蛋白(BSA)，以及包含X2基团和聚乙二醇基团的化合物(例如DBCO-PEG4-OH或DBCO-PEG5kDa)。优选地，它们应该至少存在6个乙二醇单元。
在第二方面，本发明涉及同时包含下述物质的溶液：
i.具有化学基团X2的偶联分子，所述化学基团X2适于与表面的化学基团Y1反应以形成包含化学基团Y2的反应产物，所述化学基团Y2适于与分析物识别分子反应，和
ii.该分析物识别分子。
在实施方式中，偶联分子和分析物识别分子可独立地如第一方面的任何实施方式中所定义。
在第三方面，本发明涉及一种多部分试剂盒，其包含：
a.第一溶液，其包含具有化学基团X2的偶联分子，所述化学基团X2适于与表面的化学基团Y1反应以形成包含化学基团Y2的反应产物，所述化学基团Y2适于与分析物识别分子反应，和
b.第二溶液，其包含所述分析物识别分子，
其中当所述第一和第二溶液混合时，形成包含下述的溶液(6)：
●浓度至少等于1μM且至多等于1mM的该偶联分子(7)，
●浓度至少等于1*10-12mol/L，优选至少等于1*10-8mol/L，的该分析物识别分子(1)。
在实施方式中，偶联分子，分析物识别分子和其中两种组分混合的溶液可独立地如第一方面的任何实施方式中所定义。
在一些实施方式中，所述多部分试剂盒还可以包括用于检测样品流体中的分析物的传感器，所述传感器包括：
i.表面，其用化学基团Y1官能化并且适于通过使化学基团Y1与偶联分子反应以形成适于与分析物识别分子反应的反应产物而固定该分析物识别分子，和
ii.换能器，其与该官能化表面耦合并且适于在分析物与固定的分析物识别分子相互作用时产生可读信号输出。
在实施方式中，表面可以如第一方面的任何实施方式中所定义。
在实施方式中，传感器可以是生物传感器。
在实施方式中，传感器可以是微流体装置，并且表面可以包含在微流体通道的底部。
在实施方式中，换能器可以耦合至信号和数据处理器，以将可读信号输出转换成可以传送给操作人员并由其解释的信息。
本发明的另一方面涉及包含固定在其表面上的分析物识别分子的装置，其中通过如第一方面中定义的方法获得分析物识别分子在表面上的固定。
在又一方面，本发明涉及用于检测样品流体中的分析物的传感器，所述传感器包括：
i.如前述方面中所定义的装置，和
ii.与该表面耦合并且适于在分析物与固定的分析物识别分子相互作用时产生可读信号输出的换能器。
根据优选实施方式，传感器适合于确定样品中分析物的存在。传感器可以被安排成使其充当生物传感器芯片(表面等离子体共振SPR芯片，表面声波SAW芯片...)。.
在实施方式中，表面可以是换能器的表面。传感器可以是(但不限于)下述的一部分：表面等离子体共振传感器，表面声波传感器，石英晶体微天平，电流传感器，光学传感器，电容传感器，交叉指型电极或ChemFET传感器。换能器的示例是等离子体共振设置。这是在本发明的例子中使用的换能器。换能器的另一示例是表面上固定有分析物识别分子的交叉指型电极。
又一方面，本发明涉及用于检测样品中分析物的存在的方法，其包括使样品与如本发明的任何实施方式中所定义的表面接触。
在又一方面，本发明涉及如本发明的任何实施方式所定义的装置或传感器用于检测样品中分析物的存在的用途。
图1显示依据本发明一些实施方式的方法的方案。在图1的左侧，描绘了其上存在化学基团Y1的表面(2')。化学基团Y1属于第一分子物质(3)。第一分子物质(3)在表面(2')上形成自组装单层(4)。然后，用Y1化学基团官能化的表面(2')与同时包含偶联分子(7)和分析物识别分子(1)(这里是抗体(1))的溶液(6)接触。该接触步骤的结果在图1的右侧示出，其中官能化表面(2')显示已经与偶联分子(7)反应，一些偶联分子(7)还与抗体(1)反应。
在以下实施方式中，在Biacore3000系统(GE健康公司，英国)上进行表面等离子体共振(SPR)灵敏度测量。SPR反射率吸收峰(dip)位置自动转换为任意响应单位(RU)。
实施例1：偶联分子(7)的最佳浓度的概念验证和评价。
如J.Fyken等(传感器和致动器(sensors and actuators)B 200(2014)167-172)所述制备并清洁SiO2覆盖的Au基材。清洗之后，将覆盖SiO2的Au基材转移至气相沉积工具。将该基片与100ul硅烷在25毫巴下一起加热至140℃。这使得硅烷在1小时内蒸发并与表面反应，由此提供包含官能化表面(2')的基材。然后将这些基材分离成第一基材(Sc)和基材组(Sx)。使用第一基材(Sc)进行比较例。该基材组(Sx)用来进行本发明的实施方式。
如下处理第一基材(Sc)的官能化表面(2')。捕获抗体(1)的固定在Biacore3000工具中在20℃的温度下进行。在对接第一基材(Sc)后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)运行缓冲液(150mM NaCl，50mM磷酸钾，pH7.4)进行启动步骤。在固定之前，用EtOH/H2O(1/1)中的50μlDBCO-PEG4-NHS(7)(Jena生物公司，德国)以5μl/分钟的流速注射来活化基质(Sc)的官能化表面。DBCO-PEG4-NHS(7)具有以下化学式：
在随后的步骤中，以相同的流速注射150μl抗PSA抗体(1)溶液(Fujirebio诊断公司，美国宾夕法尼亚州)(在15mM乙酸盐缓冲液中250μg/ml，pH 5.5)。使用两个短脉冲的甘氨酸/HCl(5μl，10mM，pH 2.2)从表面(2')去除非共价结合的抗体。图2(Y轴上的黑点)显示官能化表面(2')和表面(2')(抗PSA固定化后)的SPR信号的测量差异。上述比较例两步骤方案中获得的这个信号将作为参考点。
如下处理该组(Sc)中各基材的官能化表面(2')。与比较例的情况一样，捕获抗体(1)的固定在Biacore3000工具中在20℃的温度下进行。对于各基材(Sx)，在对接后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)运行缓冲液(150mM NaCl，50mM磷酸钾，pH7.4)进行启动步骤。在固定之前，使各基材(Sx)的官能化表面(2')与5μl/分钟的流速的抗PSA抗体溶液的200μl注射剂接触(250μg/ml，在15mM乙酸盐缓冲液，pH 5.5)，对于各基材(Sx)，向其中加入不同浓度的DBCO-PEG 4-NHS(7)。DBCO-PEG4-NHS(7)中的浓度从小于1μM至接近1mM。这些实验已经用新鲜混合物DBCO-PEG4-NHS(7)/抗PSA抗体进行一次，并用30分钟的旧混合物进行一次。对于两种类型的混合物在每种浓度的官能化表面(2')和表面(2')(抗PSA固定之后)之间的SPR信号的测量差异示于图2(新鲜混合物的实心圆和30分钟旧混合物的空心圆)。从图2中可以看出，新鲜混合物的SPR信号比30分钟旧混合物的信号略好。这表明如果使用新鲜的混合物，则可以固定在基材上的抗PSA的量稍高。然而，即使对于30分钟的旧混合物，SPR信号也仍然足够好。因此混合物的稳定性对于晶圆级点样来说足够好。使用寿命更长的混合物进一步研究降解，发现使用1.5小时旧混合物时没有显著的降低。因此，可以安全地假设，即使对于较旧的(例如两三个小时的混合物)，SPR信号仍然足够好。此外，可以观察到，使用浓度低于1μM的DBCO-PEG4-NHS(7)产生比参考点更差的SPR信号，而高于1μM的浓度始终得到至少相似的SPR信号，并且通常比参考点更好的SPR信号。这表明，如果DBCO-PEG4-NHS(7)的浓度太低，抗PSA的表面固定化将会相对较低。从这些实验也可以得出结论，对于大多数所测试的大于1mM的浓度，即使对于30分钟的旧混合物，SPR信号也比参考点更好。这表明，在本发明的情况下，能够固定在基材上的抗PSA的量与现有技术(当首先引入DBCO-PEG4-NHS(7)并且仅在之后引入抗PSA时)至少相当并且通常更高(当DBCO-PEG4-NHS(7)和抗PSA作为混合物引入时)。
现在参考图3。图3在Y轴上显示了抗PSA识别PSA之前和之后测得的SPR信号的差异。对比例两步骤方案测量到大约550a.u.的值。这个值将作为参考点。在本发明的一步方案中(涉及通过使用混合物DBCO-PEG4-NHS(7)/抗PSA来固定抗PSA)，对于浓度高于1μM但低于10μM的DBCO-PEG4-NHS(7)来说，SPR信号至少与参考点一样好。在10μM以上，SPR信号低于参考点，但仍足够高以允许良好的PSA检测。10μM以上的PSA识别的这种明显下降可能是由于多重DBCO-PEG4-NHS分子(7)对抗PSA进行的一定程度的修饰对采用PSA的识别不利。同样地，当比较新鲜混合物与30分钟的旧混合物时，观察到的SPR信号的劣化表明新鲜的混合物通常更好，但是30分钟的旧混合物不会差太多，并且一个或几个小时的混合物仍然可以使用。从图2和图3已经可以得出结论，本发明的抗PSA固定化的一步法是现有技术的两步法的可行的替代方案。这是重要的，因为一步法比现有技术有优势，只需要一步使官能化表面(2')与单一溶液的接触。因此，仅一个点沉积是足够的，而现有技术需要两个点沉积步骤，一个在另一个之上，这在实践中在高通量环境中不容易实施。
图4显示了通过使用现有技术的两步抗PSA固定方案(空心圆)或本发明的一步抗PSA固定方案(实心圆)进行的实验，作为待分析的溶液中的PSA浓度的函数。可以看出，对于现有技术的两步方案和本发明的一步方案，SPR信号几乎是相同的。
图5显示了已经进行的实验结果，用以评估胎牛血清的非特异性结合程度与基材表面官能化类型的关系。对于非官能化的SiO2表面(2)，在约2300a.u处观察到非常大的SPR信号，这是由于胎牛血清的非特异性结合所致。对于带有-N3基团的官能化表面(2')，由于胎牛血清的非特异性结合，SPR信号较低，但仍然较高，处于800a.u附近。对于其上固定抗PSA的表面(2')，无论是通过现有技术的两步法还是本发明的一步法，由于胎牛血清的非特异性结合，SPR信号相对较低并且程度相似(大约450a.u.)。这些结果表明，固定的分析物识别分子的非特异性结合问题在现有技术和本发明中具有相似程度。
图6示意性地示出了减少由于非特异性结合引起的问题的策略。一旦分析物识别分子(1)已经通过偶联分子(7)与官能化表面(2')结合，封闭不含分析物识别分子的表面的部分是有利的。这样可以避免远离分析物识别分子的分析物的非特异性结合。为了实现这一点，可以在分析物识别分子的官能化表面(2')上进行固定之后将封闭分子沉积在官能化表面(2')上。在图6的左侧，显示了其上固定有分析物识别分子的官能化表面(2')。图6的右侧示出了固定有分析物识别分子并且已经与分析物接触的官能化表面(2')的情况，有封闭(底部)或无封闭(顶部)。如图6顶部所示，分析物与表面发生非特异性结合。如图6底部所示，如果已经使用了封闭剂，则仅发生由分析物识别分子的特异性结合。
图7的图显示荧光分析物发射的荧光作为用于覆盖官能化表面(2')的封闭剂的性质的函数。可以看出，任何封闭剂都比没有封闭剂好得多，并且用DBCO-PEG 5kDa分子(德国Jena生物科学公司)实现了最好的结果(较低的背景荧光和因此较低的信噪比)，其中DBCO部分与DBCO-PEG4-NHS分子(7)中的情况相同，并且其中PEG 5kDa是分子量为约5000Da的聚乙二醇。第二好的封闭剂是5％的BSA溶液。
图8的图显示荧光分析物(荧光Atto-647IgG)发射的荧光作为分析物识别分子(1)(抗IgG)固定后使用的封闭剂的性质的函数。为了进行该实验，首先使官能化表面(2')与混合物分析物识别分子(1)/DBCO-PEG4-NHS分子(7)(除了一种情况下均为9μM)接触，然后与封闭剂接触最后与分析物接触。可容易地观察到，荧光均处于相似的水平，与所用封闭剂无关，除了当混合物中偶联分子(7)的浓度为1μM时以外。在该情况下，荧光较差。这表明在固定期间低偶联分子(7)浓度导致分析物特异性结合减少的事实。
在进一步的实验中，使用本发明的方法将荧光抗体点样在官能化表面上。SiO2表面用包含-N3基团的自组装单层官能化。在pH5的乙酸盐缓冲液中包含DBCO-PEG4-NHS分子(9μM)的新鲜制备的溶液中的不同浓度的荧光IgG(用Atto-647荧光标记进行官能化)滴加在该官能化表面上。然后用PBS缓冲液洗涤其上固定有荧光IgG的所得表面。测试的不同荧光IgG浓度为3μg/ml，6μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml和100μg/ml。使用两种类型的溶液。一种类型不包含均匀剂，另一种类型包含作为均匀剂的0.2M的甜菜碱。测量荧光强度作为液滴上位置的函数。对于两种类型的溶液而言，液滴内均匀性较好，尤其是在高(50μg/ml或更高)的抗体浓度下。当存在甜菜碱时，特别是在较低的抗体浓度下，液滴内均匀性得到改善。
在进一步的实验中，使用本发明的方法将抗IgG捕获抗体点样在官能化表面上。SiO2表面用包含-N3基团的自组装单层官能化。在pH5的乙酸盐缓冲液中包含DBCO-PEG4-NHS分子(9μM)的新鲜制备的溶液中的不同浓度的抗IgG捕获抗体滴加在该官能化表面上。然后进行采用BSA的封闭步骤。最后，荧光IgG(用Atto-647荧光标记官能化)与其上固定有荧光IgG的表面接触。测试的不同抗IgG浓度为6μg/ml,12μg/ml,25μg/ml,50μg/ml和100μg/ml。使用两种类型的溶液。一种类型不包含均匀剂，另一种类型包含作为均匀剂的0.2M的甜菜碱。测量荧光强度作为液滴上位置的函数。液滴内的均匀性较好，尤其是在高(50μg/ml或更高)的抗IgG浓度下。捕获的IgG的存在可以通过相应的荧光信号来检测。
应理解，虽然针对本发明的装置已讨论了优选的实施方式、具体的构造和配置以及材料，但可以各种形式和细节做出各种改变或改进而不偏离本发明的范围。例如，上文给出的任何公式仅代表可使用的过程。可在本发明的范围内所述的方法中添加或删除步骤。

Claims (17)

1.一种将分析物识别分子(1)固定在用化学基团Y1官能化的表面(2')上的方法，所述化学基团Y1适于与偶联分子(7)的化学基团X2反应以形成包含化学基团Y2的反应产物，所述化学基团Y2适于与该分析物识别分子(1)反应，所述方法包括以下步骤：
a.提供该官能化的表面(2')，
b.使该官能化的表面(2')与同时包含以下物质的溶液(6)接触：
i.该偶联分子(7)和
ii.该分析物识别分子(1)。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物识别分子(1)包含选自–NH2，-SH，-COOH，-OH，醛，酮，磷酸酯和焦磷酸酯基团中的至少一个基团，并且其中所述偶联分子(7)适于与所述至少一个基团反应。
3.如权利要求2所述的方法，
-其中所述分析物识别分子(1)具有-NH2基团并且Y2选自邻酰基异脲，N-羟基琥珀酰亚胺酯，异硫氰酸酯，异氰酸酯，酰基叠氮化物，磺酰氯，醛，环氧乙烷，羧基，碳酸酯，芳基化剂，亚氨酸酯，酸酐，氟苯基酯和羟甲基膦衍生物，或
-其中所述分析物识别分子(1)具有-SH基团并且Y2选自活化卤素，马来酰亚胺，氮丙啶，丙烯酰基，乙烯基砜，芳基化剂和二硫化物，或
-其中所述分析物识别分子(1)具有-COOH基团并且Y2选自重氮烷和重氮乙酰，或
-其中所述分析物识别分子(1)具有醛基或酮基并且Y2选自酰肼和-NH2，或
-其中所述分析物识别分子(1)具有磷酸酯或焦磷酸酯基团并且Y2是羰基二咪唑。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述分析物识别分子(1)具有-NH2基团并且Y2是N-羟基琥珀酰亚胺酯。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中Y1选自-N3，炔和-COOH，其中
●如果Y1是-N3，则X2是应变或未应变的炔，并且如果所述炔未应变，则步骤b在适于使未应变的炔与–N3反应的催化剂的存在下进行，
●如果Y1是应变或未应变的炔，则X2是-N3，并且如果所述炔未应变，则步骤b在适于使未应变的炔与–N3反应的催化剂的存在下进行，
●如果Y1是-COOH，则X2是碳化二亚胺或重氮基团＝N2。
6.如权利要求5所述的方法，其中Y1是-N3并且X2是环炔烃的炔基。
7.根据从属于权利要求4的权利要求6所述的方法，其中偶联分子(7)具有以下通式：
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶液(6)包含浓度至少等于1μM的所述偶联分子(7)。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶液(6)包含浓度为至多1mM，优选至多100μM，更优选至多10μM的所述偶联分子(7)。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析物识别分子(1)以至少等于1*10-12mol/l的浓度存在于所述溶液(6)中。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过在步骤b之前将所述分析物识别分子(1)和所述偶联分子(7)混合至多2小时，优选至多30分钟，来制备包含所述分析物识别分子(1)和所述偶联分子(7)的溶液(6)。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述偶联分子(7)具有通式X2-R2-Y2，其中R2是支化的或非支化的、饱和的或不饱和的有机基团，包含1至30个碳原子，任选地包含选自-N-，-O-和-S-的一个或多个杂原子，并且任选地包含一个或多个氧代取代基。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b包括在所述溶液(6)的液滴的官能化表面(2')上进行沉积。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述官能化表面(2')与换能器耦合，以在分析物(10)与固定的分析物识别分子(1)相互作用时产生可读信号输出。
15.一种溶液(6)，其同时包含：
i.具有化学基团X2的偶联分子(7)，所述化学基团X2适于与表面(2')的化学基团Y1反应以形成包含化学基团Y2的反应产物，所述化学基团Y2适于与分析物识别分子(1)反应，和
ii.所述分析物识别分子(1)。
16.一种多部分试剂盒，包含：
a.第一溶液(6’)，其包含具有化学基团X2的偶联分子(7)，所述化学基团X2适于与表面(2')的化学基团Y1反应以形成包含化学基团Y2的反应产物，所述化学基团Y2适于与分析物识别分子(1)反应，和
b.第二溶液(6”)，其包含所述分析物识别分子(1)，
其中当所述第一和第二溶液混合时，形成包含下述物质的溶液(6)：
●浓度至少等于1μM且至多等于1mM的该偶联分子(7)，
●浓度至少等于1*10-12mol/L的该分析物识别分子(1)。
17.如权利要求15所述的多部分试剂盒，其还包含用于检测样品流体中的分析物(10)的传感器，该传感器包含：
i.表面(2')，其用化学基团Y1官能化并且适于通过使该化学基团Y1与偶联分子(7)反应以形成适于与分析物识别分子(1)反应的反应产物而固定该分析物识别分子(1)，和
ii.换能器，其与该官能化表面(2')偶联并且适于在分析物(10)与固定的分析物识别分子(1)相互作用时产生可读信号输出。
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