CN114920776B - 一种甲醛荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机小分子荧光探针技术领域，公开了一种甲醛荧光探针及其制备方法和应用。其制备方法包括如下步骤：S1、三苯基膦和3‑溴丙胺氢溴酸盐在乙腈中加热回流，抽滤、干燥得到中间体M1；S2、将S1得到的中间体M1和4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐、三乙胺在甲醇中加热回流，减压蒸馏后进行层析得到中间体M2；S3、将S2得到的中间体M2和水合肼在无水乙醇中加热回流，抽滤、干燥后进行层析得到荧光探针。本发明在荧光本体上同时引入了线粒体靶向基团和甲醛的识别基团，形成一种新型的检测甲醛的荧光探针，探针结构新颖，合成方法简单，合成条件温和，对甲醛有较好的识别效果，响应速度快，稳定性好，检测范围宽。
Description
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针技术领域，具体涉及一种甲醛荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
降钙素原甲醛是分子结构最简单的醛，具有很高活性，与DNA和蛋白有较强的结合能力，可作为细胞固定剂和组织防腐剂。甲醛可以在生物体内内源生成，体内正常水平的甲醛参与生理过程，而过量的甲醛则会诱发多种疾病。因此准确测定生物样品中甲醛的含量对更好地认识其功能和作用具有重要意义。因甲醛具有很高的反应活性，准确测定生物样品中甲醛的含量仍存在着一定的挑战。因此，建立灵敏度高、选择性好，能原位、实时监测生物体内甲醛的方法具有重要意义。
荧光探针因具有高灵敏度、高选择性和对试样的非侵入性，能够实现原位、实时检测等优点，已成为追踪生物体中活性小分子的强有力工具，目前开发的检测甲醛的荧光探针已陆续被开发出来，如比率型、双光子等。这些探针虽然能实现对甲醛的检测，但在结构上都不具有线粒体靶向基团，因此有必要开发一种结构上具有线粒体靶向基团的且合成方法简单的检测甲醛的荧光探针。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有存在的上述问题，提供一种甲醛荧光探针及其制备方法和应用，探针结构上既有线粒体靶向基团又有甲醛的识别基团，探针结构新颖，合成方法简单，合成条件温和，对甲醛有较好的识别效果，响应速度快。
为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：
一种甲醛荧光探针，具有如式I所示的化学结构通式：
此外，本发明还提供了上述甲醛荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1、三苯基膦和3-溴丙胺氢溴酸盐在乙腈中加热回流，抽滤、干燥得到中间体M1；
S2、将S1得到的中间体M1和4-溴-1,8-萘二甲酸酐、三乙胺在甲醇中加热回流，减压蒸馏后进行层析得到中间体M2；
S3、将S2得到的中间体M2和水合肼在无水乙醇中加热回流，抽滤、干燥后进行层析得到荧光探针；
具体的合成合成路线如下：
。
优选的，S1中，所述三苯基膦、3-溴丙胺氢溴酸盐和乙腈的质量体积比为1g：0.832g:10mL，加热回流的时间为10-18h。
优选的，S2中，所述中间体M1、4-溴-1,8-萘二甲酸酐、三乙胺和甲醇的质量体积比为0.958g:0.554g:5mL:30mL，加热回流的时间为5-8h。
优选的，S3中，所述中间体M2、水合肼和无水乙醇的质量体积比为2.64g:6mL:30mL，加热回流的时间为3-6h。
优选的，S2和S3中，所述层析中固定相是硅胶，流动相是三氯甲烷和甲醇，S2中三氯甲烷和甲醇的体积比为5:1，S3中三氯甲烷和甲醇的体积比为10～30:1。
本发明还提供了上述甲醛荧光探针在定量检测溶液或细胞中甲醛的应用。
优选的，所述检测的方法包括以下步骤：
(1)将荧光探针分别加入不同标准浓度的甲醛溶液，加入到PBS缓冲溶液进行稀释，使得混合溶液的总体积为2mL，混合溶液充分混匀后孵育10min，得到不同浓度甲醛混合测试溶液，荧光法测量发射波长在548nm的荧光值，通过荧光值与甲醛溶液浓度建立标准曲线；
(2)将待测的甲醛溶液按照步骤(1)的方法制备成待测溶液，测量荧光值，将荧光值带入标准曲线中，计算甲醛溶液的含量。
优选的，所述甲醛溶液的线性范围为0～30μM，检测限为14.9nM。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供的荧光探针，以4-溴-1,8萘二甲酸酐为本体，先将三苯基膦与3-溴丙胺氢溴酸盐反应得到的中间体引入到本体上作为线粒体靶向基团，再将肼基引入到本体上作为甲醛的识别基团，构建了一种新型的检测甲醛的荧光探针，在荧光本体上同时引入了线粒体靶向基团和甲醛的识别基团，探针结构新颖，合成方法简单，合成条件温和，对甲醛有较好的识别效果，响应速度快，稳定性好，检测范围宽，克服了现有探针合成方法复杂、合成条件较为严苛等缺点。
附图说明
图1为本发明荧光探针对不同干扰物质的选择性图；
图2为本发明荧光探针与不同浓度甲醛反应荧光光谱图；
图3为本发明荧光探针与甲醛反应后荧光强度与甲醛浓度线性关系图；
图4为本发明荧光探针与甲醛反应动力学曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的数据，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围，除非另有特别说明，本发明以下各实施例中用到的各种原料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买得到或者通过现有方法制备得到。
实施例1
一种甲醛荧光探针，具有如式I所示的化学结构通式：
此外，本发明还提供了上述甲醛荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1、在50mL圆底烧瓶中，加入1.000g苯基膦和0.832g3-溴丙胺氢溴酸盐，然后再加入10mL乙腈，加热回流12h，冷却至室温，减压抽滤、真空干燥得到中间体M1；产率为64％；
S2、将S1得到的中间体0.958gM1和0.554g4-溴-1,8-萘二甲酸酐、5mL三乙胺以及30mL甲醇加入100mL圆底烧瓶中，加热回流5h，减压蒸馏得到中间体M1粗品；然后进行色谱柱层析，固定相是硅胶，流动相是三氯甲烷和甲醇，三氯甲烷和甲醇的体积比为5:1进行层析，真空干燥得到中间体M2；
S3、将S2得到的中间体2.640gM2和6mL水合肼以及30mL无水乙醇加入100mL圆底烧瓶中，加热回流4h，抽滤、干燥后得到荧光探针粗品，然后进行色谱柱层析，固定相是硅胶，流动相是三氯甲烷和甲醇，三氯甲烷和甲醇的体积比为10:1进行层析，真空干燥得到荧光探针；
具体的合成合成路线如下：
。
实施例2
一种甲醛荧光探针，具有如式I所示的化学结构通式：
此外，本发明还提供了上述甲醛荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1、在50mL圆底烧瓶中，加入1.000g苯基膦和0.832g3-溴丙胺氢溴酸盐，然后再加入10mL乙腈，加热回流10h，冷却至室温，减压抽滤、真空干燥得到中间体M1；产率为62.5％；
S2、将S1得到的中间体0.958gM1和0.554g4-溴-1,8-萘二甲酸酐、5mL三乙胺以及30mL甲醇加入100mL圆底烧瓶中，加热回流8h，减压蒸馏得到中间体M1粗品；然后进行色谱柱层析，固定相是硅胶，流动相是三氯甲烷和甲醇，三氯甲烷和甲醇的体积比为5:1进行层析，真空干燥得到中间体M2；
S3、将S2得到的中间体2.640gM2和6mL水合肼以及30mL无水乙醇加入100mL圆底烧瓶中，加热回流3h，抽滤、干燥后得到荧光探针粗品，然后进行色谱柱层析，固定相是硅胶，流动相是三氯甲烷和甲醇，三氯甲烷和甲醇的体积比为30:1进行层析，真空干燥得到荧光探针。
实验证明，本实施例所获得的荧光探针与实施例1无实质性差别。
实施例3
一种甲醛荧光探针，具有如式I所示的化学结构通式：
此外，本发明还提供了上述甲醛荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1、在50mL圆底烧瓶中，加入1.000g苯基膦和0.832g3-溴丙胺氢溴酸盐，然后再加入10mL乙腈，加热回流18h，冷却至室温，减压抽滤、真空干燥得到中间体M1；产率为65.8％；
S2、将S1得到的中间体0.958gM1和0.554g4-溴-1,8-萘二甲酸酐、5mL三乙胺以及30mL甲醇加入100mL圆底烧瓶中，加热回流6h，减压蒸馏得到中间体M1粗品；然后进行色谱柱层析，固定相是硅胶，流动相是三氯甲烷和甲醇，三氯甲烷和甲醇的体积比为5:1进行层析，真空干燥得到中间体M2；
S3、将S2得到的中间体2.640gM2和6mL水合肼以及30mL无水乙醇加入100mL圆底烧瓶中，加热回流6h，抽滤、干燥后得到荧光探针粗品，然后进行色谱柱层析，固定相是硅胶，流动相是三氯甲烷和甲醇，三氯甲烷和甲醇的体积比为15:1进行层析，真空干燥得到荧光探针。
实验证明，本实施例所获得的荧光探针与实施例1无实质性差别。
将荧光探针(15uM)加入到pH为7.4的PBS缓冲溶液进行稀释100倍，使得混合溶液的总体积为2mL，分别加入常规离子浓度为1.0mM；氨基酸的浓度为1.0mM；活性氧和活性氮浓度为100μM；醛酮浓度为15μM。摇匀并作用40min后进行荧光光谱测试，取其最大发射峰位置λem＝548nm处的荧光强度做条形图如图1所示，其中1-18加入的离子分别为：空白，乙二醛，丙酮酸钠，对二甲氨基苯甲醛，乙醛，对硝基苯甲醛，丙酮，次氯酸钠，过氧化氢，过氧化二叔丁基，氯化钙，氯化镁，硝酸钾，硫酸钠，半胱氨酸，谷胱甘肽，葡萄糖，甲醛。实验结果表明如图1所示，除了甲醛，其他物质对荧光探针的荧光几乎没有干扰，表明其对甲醛的选择性好。
将荧光探针(15uM)加入不同浓度的甲醛(0uM、4uM、8uM、16uM、20uM、30uM、60uM、80uM、100uM)，加入到pH为7.4的PBS缓冲溶液进行稀释100倍，使得混合溶液的总体积为2mL，混合溶液充分混匀后孵育10min，进行荧光光谱测试；结果如图1所示，从图1中可以看出，探针本身荧光很弱，但与甲醛反应后，随着甲醛浓度的增加，荧光强度逐渐增强，最大发射波长在548nm左右。进一步研究荧光强度与加入的甲醛的量之间的关系，发现甲醛浓度从0uM变化到30uM时，548nm处的荧光强度与甲醛浓度成良好的线性关系，如图2所示，线性方程：y＝0.82349x+4.47933(R2＝0.99644)，表明探针可作为甲醛定量测定工具，用于对甲醛定量检测，甲醛溶液的线性范围为0～30μM，检测限为14.9nM。
为了确定探针对甲醛的响应时间，考察了探针(15uM)与甲醛的混合溶液的反应动力学。在激发波长为440nm下，分别测定探针溶液及探针与甲醛的混合溶液的荧光光谱图，结果如图4所示。从图4中可以看出，探针本身荧光信号较弱，且几乎不随时间变化而增长，表明探针可在一定时间内稳定存在。但探针与甲醛作用后，荧光信号迅速增加，在反应6min时荧光信号达到最大值，后趋于稳定。由此可知，探针与甲醛能够发生作用，且反应较为迅速，6min左右即可达到荧光最大值。探针本身荧光很弱是因为探针本身结构中的肼基与荧光发色团之间发生光诱导电子转移(PET)，从而使探针几乎不显示荧光，这就意味着进行荧光光谱测定时，背景信号低，这对于测定和生物应用都是非常有利的。探针的荧光信号几乎不随时间变化，说明探针性质比较稳定，对后期性能测试和应用都比较有利。与甲醛作用后，探针分子中的肼基与甲醛分子中的羰基发生缩合反应生成了腙，导致光诱导电子转移通道被阻断，荧光团荧光恢复，体系发射出荧光。反应动力学结果表明，探针本身相对稳定，且能对甲醛进行快速响应，响应时间6min左右。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (4)
1.一种荧光探针在制备定量检测溶液或细胞中甲醛的试剂中的应用，其特征在于，所述荧光探针的制备方法包括以下步骤：
S1、三苯基膦和3-溴丙胺氢溴酸盐在乙腈中加热回流，抽滤、干燥得到中间体M1；
所述三苯基膦、3-溴丙胺氢溴酸盐和乙腈的质量体积比为1g：0.832g:10mL，加热回流的时间为10-18h；
S2、将S1得到的中间体M1和4-溴-1, 8-萘二甲酸酐、三乙胺在甲醇中加热回流，减压蒸馏后进行层析得到中间体M2；
所述中间体M1、4-溴-1, 8-萘二甲酸酐、三乙胺和甲醇的质量体积比为0.958g:0.554g:5mL:30mL，加热回流的时间为5-8h；
S3、将S2得到的中间体M2和水合肼在无水乙醇中加热回流，抽滤、干燥后进行层析得到荧光探针；
所述中间体M2、水合肼和无水乙醇的质量体积比为2.64g:6mL:30mL，加热回流的时间为3-6h；
具体的合成路线如下：
。
2.根据权利要求1的荧光探针在制备定量检测溶液或细胞中甲醛的试剂中的应用，其特征在于，S2和S3中，所述层析中固定相是硅胶，流动相是三氯甲烷和甲醇，S2中三氯甲烷和甲醇的体积比为5:1，S3中三氯甲烷和甲醇的体积比为10~30:1。
3.根据权利要求1所述的荧光探针在制备定量检测溶液或细胞中甲醛的试剂中的应用，其特征在于，所述检测的方法包括以下步骤：
（1）将荧光探针分别加入不同标准浓度的甲醛溶液，加入到PBS缓冲溶液进行稀释，使得混合溶液的总体积为2mL，混合溶液充分混匀后孵育10min，得到不同浓度甲醛混合测试溶液，荧光法测量发射波长在548nm的荧光值，通过荧光值与甲醛溶液浓度建立标准曲线；
（2）将待测的甲醛溶液按照步骤（1）的方法制备成待测溶液，测量荧光值，将荧光值带入标准曲线中，计算甲醛溶液的含量。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述甲醛溶液的线性范围为0~30µM，检测限为14.9nM。
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