CN107677649B - 免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法 - Google Patents

免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，将铜铟硫作为荧光探针，将同步荧光法作为检测手段，有效的利用铜铟硫量子点的检测劣势作为突破点，实现将铜铟硫量子点作为荧光探针对谷胱甘肽的特异性检测。其中应用的铜铟硫量子点为免标记、无修饰的，使得合成步骤得到大幅度的简化。检测体系可以显著提高检测的灵敏度和选择性。该方法峰型完整且对称，准确度高，灵敏度高。

Description

免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，主要涉及一种免标记铜铟硫光学探针结合同步荧光法进行光学检测及其对生物硫醇谷胱甘肽定量检测的应用。
背景技术
目前，三元半导体材料铜铟硫已广泛应用于制作太阳能电池薄膜材料，据实验证明，当它的粒径为2-4nm左右时会有近红外的荧光性质。新型铜铟硫量子点与传统量子点相比，具有不含汞、镉等有毒金属元素，光稳定性好，发光波长位于近红外区域(660nm左右)，更适用于生物检测等优点。然而，近年来人们将铜铟硫广泛应用于太阳能电池薄膜材料，目前将其作为荧光探针应用于检测方面的为之甚少。其主要原因是由于铜铟硫作为荧光探针使用传统荧光法进行定量检测时，表现出相对不完整、对称性较差的荧光峰型，从而导致了较低的准确度和灵敏度。为改善这些问题，随研究的不断深入，有人发现同步荧光法能很好地弥补传统荧光法的某些不足。对比于传统荧光检测方法(即固定激发波长扫描发射波长或固定发射波长扫描激发波长)，同步荧光光谱法是一种三维的荧光技术，具体是指同时扫描激发波长和发射波长，从而显示激发波长的荧光强度变化。因而具有荧光谱图的峰型对称性更好，斯托克斯位移更大，锋更窄且对称，光谱分辨率更高，灵敏度更高，选择性更强等优势。目前，此技术已成为环境监测中多环芳烃定性和定量分析的有效手段。
谷胱甘肽广泛存在于动植物的每一个细胞中，并在维持机体免疫系统正常运转的过程中扮演重要角色。例如人们常吃的圣女果、樱桃等水果中就含有丰富的谷胱甘肽。目前，由于谷胱甘肽在抗氧化方面有显著作用，所以部分化妆品厂商在美容产品中添加谷胱甘肽来起到美白和防衰老的作用。除此之外，谷胱甘肽极易与重金属离子和扑热息痛等药物结合生成无毒的物质排出体外，从而起到整合解毒的作用。随着人们物质生活的发展，城市慢性病的发病率也悄然升高，越来越多的人开始患有脂肪肝类的慢性病，而谷胱甘肽可以抑制乙醇侵害肝脏所产生的脂肪肝。最为重要的是，近年来，西方科学家发现谷胱甘肽还具有抑制艾滋病毒的功能。因此对于谷胱甘肽的检测在人体健康方面是具有重要意义的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，适用于铜铟硫量子点的光学检测方法和应用该法通过OFF-ON机理对谷胱甘肽进行定量检测的检测方法。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，按照下述步骤进行：将铜铟硫量子点母液、PBS缓冲溶液和铜离子水溶液进行混合均匀形成检测系统，以使检测系统荧光强度处于减弱或者关闭状态，向检测系统中加入待测谷胱甘肽溶液，以使被猝灭的荧光强度得到恢复，并以同步荧光法的检测模式进行检测，向检测体系中分别加入浓度为1-500微摩的谷胱甘肽后，由于发生了荧光恢复效应，铜铟硫量子点表现出来的荧光强度逐渐增强，当谷胱甘肽的加入浓度在(1-500微摩)范围内时，铜铟硫量子点的荧光强度呈线性增强Y＝0.05723X+32.663，线性范围为1-500微摩，最低检出限为109纳摩，R2为0.94395。
在进行检测时，将铜铟硫量子点母液、PBS缓冲溶液和氯化铜溶液进行混合均匀后，荧光强度有明显的降低，在100—150秒后达平衡状态，针对加入铜离子后的荧光强度的检测时间为100—150秒。
在进行检测时，向检测系统中加入待测谷胱甘肽溶液后，荧光强度有明显增长，在100—150秒后达平衡状态，针对加入谷胱甘肽后的荧光强度的检测时间为100—150秒。
在进行检测时，进行同步荧光检测时，位移差为60—100nm。
在进行检测时，铜铟硫量子点母液、PBS缓冲溶液、铜离子水溶液和谷胱甘肽水溶液的体积比为(1—10)体积份：5体积份：1体积份：1体积份，并整体定容至100体积份；优选铜铟硫量子点母液的用量50-400μL，PBS缓冲溶液为200μL，铜离子水溶液为40μL，谷胱甘肽水溶液为40μL，并定容至4mL，每份体积份为40μL。
在进行检测时，PBS缓冲溶液的pH值为7—7.4。
在进行检测时，铜铟硫量子点母液为0.019g铜铟硫量子点粉末，均匀分散于10mL的高纯水中。
在本发明技术方案中，铜铟硫荧光探针为铜铟硫量子点，粒径为2—4nm，紫外吸收在605—610nm处有吸收峰(即集中在606nm处有吸收峰)，正好对应于其荧光激发位置，说明成功合成具有荧光性质的铜铟硫量子点，且其发光位置在近红外区域，即表明其可作为近红外荧光探针使用。
本发明中将同步荧光法作为检测手段，有效的利用铜铟硫量子点的检测劣势作为突破点，实现将铜铟硫量子点作为荧光探针对谷胱甘肽的特异性检测。其中应用的铜铟硫量子点为免标记、无修饰的，使得合成步骤得到大幅度的简化。检测模式为“OFF-ON”体系，这种体系可以显著提高检测的灵敏度和选择性。在使用时可将加入铜离子进行荧光淬灭的过程，作为针对铜离子的检测过程，向检测体系中分别加入浓度为5-10000微摩的Cu2+后，由于发生了猝灭效应，铜铟硫量子点表现出来的荧光强度逐渐降低，当Cu2+的加入浓度在(5-10000微摩)范围内时，铜铟硫量子点的荧光强度呈线性猝灭Y＝0.0263X+32.663，线性范围为5-10000微摩，最低检出限为550纳摩，R2为0.974。即铜铟硫量子点作为铜铟硫荧光探针，同时作为铜离子探针和谷胱甘肽探针，在检测中的应用。
与现有技术相比，本发明将同步荧光法应用于铜铟硫量子点的检测体系，使得其与传统的荧光检测方法相比，很好地解决了铜铟硫量子点荧光谱图峰型不完整且对称性较为不好，准确度、灵敏度较低和选择性较差等问题，在谱图的完整性和检测的灵敏度方面有显著的改善。本发明所提供的“OFF-ON”检测机理简单，不需要对铜铟硫量子点进行功能化的表面修饰即可实现对谷胱甘肽的特异性检测，此举能大幅度的简化合成步骤，且作为荧光猝灭剂的Cu2+和荧光恢复剂的谷胱甘肽均为环保易得的低毒性材料。本发明采用同步荧光法作为检测手段具有峰型完整且对称，检测时间短，操作简单，结果直观，灵敏度较高，准确度较高等优点，适合作为可靠的检测手段进行广泛推广，在各种实际样品的检测中都有很好的应用前景。本发明利用铜铟硫量子点作为荧光探针对谷胱甘肽进行定量检测，具有材料无毒，操作简便，在近红外区域检测对生物体伤害较小等优点。其检测结果表现为较宽的检测范围(1-500微摩)和较低的检出限(109纳摩)，适用于检测绝大多数的实际样品，因而具有显著的实际意义。
Figure BDA0001067227310000041
附图说明
图1是本发明中使用的铜铟硫量子点的XRD图。
图2是本发明中使用的铜铟硫量子点的TEM照片，右上方照片为量子点的局部放大图。
图3是本发明中使用的铜铟硫量子点的紫外吸收图。
图4是向检测体系中加入荧光猝灭剂Cu2+后铜铟硫量子点的荧光强度随时间的变化图。
图5是向检测体系中加入荧光恢复剂谷胱甘肽后铜铟硫量子点荧光强度随时间的变化图。
图6是在本发明中铜铟硫量子点加入荧光猝灭剂Cu2+后的荧光猝灭图。
图7是在本发明中铜铟硫量子点加入荧光猝灭剂Cu2+后荧光猝灭的线性范围图。
图8是在本发明中铜铟硫量子点加入荧光恢复剂谷胱甘肽后的荧光恢复图。
图9是在本发明中铜铟硫量子点加入荧光恢复剂谷胱甘肽后荧光恢复的线性范围图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。本发明所述的高纯水购买于杭州娃哈哈集团有限公司，还原型谷胱甘肽购买于北京鼎国生物技术有限责任公司，其他无机试剂均购买于天津市科威有限公司。
英文表示 中文名称
CuCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 二水合氯化铜
In(NO<sub>3</sub>)<sub>3</sub>·5H<sub>2</sub>O 五水合硝酸铟
NaOH 氢氧化钠
PBS 磷酸盐缓冲溶液
实施例1：铜铟硫量子点的合成
分别称取0.0256g CuCl2·2H2O和0.0573g In(NO3)3·5H2O溶解于10.5mL的高纯水中，待充分溶解完毕后，用移液枪移取157μL 3-巯基丙酸逐滴加入体系中。此时溶液由无色澄清透明状态转变为有淡黄色沉淀生成。再用2mol/L的NaOH溶液调节pH＝11.3。在调节pH的过程中，能明显发现沉淀逐渐消失直至恢复为无色澄清的溶液状态。待磁子搅拌10分钟后，加入0.0228g硫脲的硫脲继续搅拌直至其完全溶解。将该合成溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，并置于150℃的烘箱里加热21小时后使其自然冷却至室温，即可得到淡黄色澄清溶液，则表明铜铟硫量子点已成功合成。
在12000转的转速下离心10分钟以去除过量的反应物和杂质沉淀。再加入7倍量的乙醇离心，使铜铟硫从溶液中沉淀出来，反复三次。将纯化的铜铟硫真空干燥24小时后便得到铜铟硫量子点粉末，黑暗保存。每次用于检测之前，加入高纯水回溶即可。
上述量子点的制备可参考文献CuInS2quantum dots as a near-infraredfluorescent probe for detecting thrombin in human serum，Xue Gao,Xingcen Liu,Zihan Lin,Siyu Liu and Xingguang Su，Analyst,2012,137,5620。使用XRD和TEM进行表征，如附图1和2所示，从成分角度和晶格角度证明了通过水热合成法成功合成了铜铟硫量子点，铜铟硫粒子尺寸在2-4nm的范围内，即表明具有荧光性质的铜铟硫量子点被成功合成。使用日本岛津公司紫外分光光度计UV-2600进行测试，如附图3所示，铜铟硫的紫外吸收在605—610nm处有吸收峰(即集中在606nm处有吸收峰)，正好对应于其荧光激发位置，说明成功合成具有荧光性质的铜铟硫量子点，且其发光位置在近红外区域，即表明其可作为近红外荧光探针使用。
实施例2：溶液的配置
(1)铜铟硫量子点母液的配制：准确称取0.0190g纯化后的铜铟硫量子点粉末，溶解于10mL的高纯水中，摇匀备用；
(2)0.2mol/L，25℃，pH＝7.4的PBS缓冲溶液的配置：
①0.2mol/L Na2HPO4溶液：称取0.716g Na2HPO4·12H2O溶于10mL高纯水中；②0.2mol/L NaH2PO4溶液：称取0.312g NaH2PO4·2H2O溶于10mL高纯水中；③取1.9mLNaH2PO4溶液和8.1mL Na2HPO4溶液，定容到20mL，保存于冰箱中待用；
(3)不同浓度氯化铜溶液的配置：
准确称取0.8541g氯化铜溶于5mL高纯水中，配制成浓度为1M的CuCl2溶液；分别取25μL、50μL、75μL、100μL、125μL、150μL等(1M)的CuCl2溶液，用高纯水定容到5mL，得到0.1mM、0.5mM、1mM、10mM、100mM、1M等的氯化铜梯度浓度溶液。
(4)不同浓度谷胱甘肽溶液的配置：
准确称取0.0015g谷胱甘肽溶于5mL高纯水中，配制成浓度为1M的谷胱甘肽溶液；分别取25μL、50μL、75μL、100μL、125μL、150μL(1M)等的谷胱甘肽溶液，用高纯水定容到5mL，得到0.1mM、0.5mM、1mM、10mM、100mM、200mM等的谷胱甘肽梯度浓度溶液。
实施例3：采用同步荧光法为检测手段，使用铜铟硫量子点对谷胱甘肽进行特异性检测确定检测时间(使用荧光光度计为美国安捷伦)
(1)向离心管中依次加入180μL铜铟硫量子点母液，200μL(0.02mol/L)PBS溶液混合均匀后，再向其中加入40μL一系列梯度浓度(0.1mM-1M)铜离子溶液(氯化铜水溶液)作为荧光猝灭剂，加高纯水定容至4mL。摇匀静置不同时间后，将荧光分光光度计调成同步荧光法的检测模式，设置位移差为60nm进行检测。
(2)向离心管中依次加入180μL铜铟硫量子点母液，200μL(0.02mol/L)PBS溶液混合均匀后，再向其中加入40μL(1mM)铜离子溶液作为荧光猝灭剂，摇匀静置2min，待其荧光猝灭达到平衡状态后，加入40μL一系列梯度浓度(0.1-100mM)谷胱甘肽溶液作为荧光恢复剂，加高纯水定容至4mL。摇匀静置不同时间后，将荧光分光光度计调成同步荧光法的检测模式，设置位移差为60nm进行检测。
上述测试结果如附图4—5所示，加入Cu2+后，荧光强度有明显的降低，在100—150秒后达平衡状态，故在检测过程中，选定2分钟为加入铜离子后检测荧光强度的最优检测时间。加入谷胱甘肽后，荧光强度有明显的增长，且在100—150秒后达平衡状态，故在检测过程中，选定2分钟为加入谷胱甘肽后检测荧光强度的最优检测时间。
实施例4：采用同步荧光法为检测手段，使用铜铟硫量子点对谷胱甘肽进行特异性检测确定检测效果
(1)向离心管中依次加入180μL铜铟硫量子点母液，200μL(0.02mol/L)PBS溶液混合均匀后，再向其中加入40μL一系列梯度浓度(0.1mM-1M)铜离子溶液(氯化铜水溶液)作为荧光猝灭剂，加高纯水定容至4mL。摇匀静置2min后，将荧光分光光度计调成同步荧光法的检测模式，设置位移差为60nm进行检测。
(2)向离心管中依次加入180μL铜铟硫量子点母液，200μL(0.02mol/L)PBS溶液混合均匀后，再向其中加入40μL(1mM)铜离子溶液作为荧光猝灭剂，摇匀静置2min，待其荧光猝灭达到平衡状态后，加入40μL一系列梯度浓度(0.1-100mM)谷胱甘肽溶液作为荧光恢复剂，加高纯水定容至4mL。摇匀静置2min后，将荧光分光光度计调成同步荧光法的检测模式，设置位移差为60nm进行检测。
在加入铜离子之后，荧光强度减弱，铜离子作为荧光淬灭剂，使检测系统的荧光处于减弱或者关闭状态，如附图6和7所示，向检测体系中分别加入浓度为5-10000微摩的Cu2+后，由于发生了猝灭效应，铜铟硫量子点表现出来的荧光强度逐渐降低，当Cu2+的加入浓度在(5-10000微摩)范围内时，铜铟硫量子点的荧光强度呈线性猝灭Y＝0.0263X+32.663，线性范围为5-10000微摩，最低检出限为550纳摩，R2为0.974。
在加入谷胱甘肽之后，荧光强度得以恢复，检测系统的荧光处于打开状态，如附图8和9所示，向检测体系中分别加入浓度为1-500微摩的谷胱甘肽后，由于发生了荧光恢复效应，铜铟硫量子点表现出来的荧光强度逐渐增强，当谷胱甘肽的加入浓度在(1-500微摩)范围内时，铜铟硫量子点的荧光强度呈线性增强Y＝0.05723X+32.663，线性范围为1-500微摩，最低检出限为109纳摩，R2为0.94395。
调整铜铟硫量子点母液的用量40-400μL，位移差为60—100nm，采用同步荧光法为检测手段，使用铜铟硫量子点对谷胱甘肽进行特异性检测均表现出基本一致的性质，检测结果基本保持一致，说明采用同步荧光法为检测手段，使用铜铟硫量子点对谷胱甘肽进行特异性检测的广泛适应性。
本专利受到国家自然科学基金面上项目21375095、全国优秀博士学位论文作者专项资助资金FANEDD-201023、天津师范大学博士基金(编号52XB1510)、天津市应用基础研究计划重点项目12JCZDJC21700和天津市“131”创新型人才培养工程第一层次项目ZX110185的资助。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，按照下述步骤进行：将铜铟硫量子点母液、PBS缓冲溶液和铜离子水溶液进行混合均匀形成检测系统，以使检测系统荧光强度处于减弱或者关闭状态，向检测系统中加入待测谷胱甘肽溶液，以使被猝灭的荧光强度得到恢复，并以同步荧光法的检测模式进行检测，由于发生了荧光恢复效应，铜铟硫量子点表现出来的荧光强度逐渐增强，当谷胱甘肽的加入浓度在1-500微摩范围内时，铜铟硫量子点的荧光强度呈线性增强Y＝0.05723X+32.663，线性范围为1-500微摩，最低检出限为109纳摩，R2为0.94395。
2.根据权利要求1所述的免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，在进行检测时，将铜铟硫量子点母液、PBS缓冲溶液和氯化铜溶液进行混合均匀后，荧光强度有明显的降低，在100—150秒后达平衡状态，针对加入铜离子后的荧光强度的检测时间为100—150秒。
3.根据权利要求1所述的免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，在进行检测时，向检测系统中加入待测谷胱甘肽溶液后，荧光强度有明显增长，在100—150秒后达平衡状态，针对加入谷胱甘肽后的荧光强度的检测时间为100—150秒。
4.根据权利要求1所述的免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，在进行检测时，进行同步荧光检测时，位移差为60—100nm。
5.根据权利要求1所述的免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，在进行检测时，铜铟硫量子点母液、PBS缓冲溶液、铜离子水溶液和谷胱甘肽水溶液的体积比为1—10体积份：5体积份：1体积份：1体积份，并整体定容至100体积份，每份体积份为40μL。
6.根据权利要求1所述的免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，铜铟硫量子点母液的用量50-400μL，PBS缓冲溶液为200μL，铜离子水溶液为40μL，谷胱甘肽水溶液为40μL，并定容至4mL。
7.根据权利要求1所述的免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，在进行检测时，PBS缓冲溶液的pH值为7—7.4。
8.根据权利要求1所述的免标记铜铟硫荧光探针同步荧光法定量检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，铜铟硫量子点母液为0.019g铜铟硫量子点粉末，均匀分散于10mL的高纯水中。
9.铜铟硫量子点作为铜铟硫荧光探针同时作为铜离子探针和谷胱甘肽探针在检测中的应用，其特征在于，当Cu2+的加入浓度在5-10000微摩范围内时，铜铟硫量子点的荧光强度呈线性猝灭Y＝0.0263X+32.663，线性范围为5-10000微摩，最低检出限为550纳摩，R2为0.974；当谷胱甘肽的加入浓度在1-500微摩范围内时，铜铟硫量子点的荧光强度呈线性增强Y＝0.05723X+32.663，线性范围为1-500微摩，最低检出限为109纳摩，R2为0.94395。
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