CN107652309A - 一种用于裸眼检测的荧光素‑罗丹明b铜离子紫外分子探针及其合成和使用方法 - Google Patents

Abstract

一种用于裸眼检测的荧光素‑罗丹明B铜离子紫外分子探针及其合成和使用方法，它涉及Cu²⁺探针及其合成和应用。它要解决现有的Cu²⁺分子探针需要使用价格昂贵的高精密度荧光光谱仪检测的、易受外界环境干扰的技术问题。本发明分子探针的结构式为：制法：采用荧光素单醛和罗丹明B肼反应后，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂通过柱色谱分离得到；使用方法：将探针溶解在MeOH与HEPES缓冲溶液的混合液中，检测加入待测样品，若溶液颜色由浅粉色变成深粉色，则含有Cu²⁺；或者，检测加入样品前后的紫外光谱吸光度值，若在波长为502和553nm处的吸光度值提高，则可判定样品溶液中含有Cu²⁺。检测方法简单、快速、直观。

Description

一种用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针及 其合成和使用方法

技术领域

本发明涉及Cu²⁺检测的分子探针的合成及应用。

背景技术

Cu²⁺广泛分布于生物组织中的必要微量元素，Cu²⁺的不足或过量会导致一系列的神经性病变，例如门克斯综合症、阿尔茨海默氏症、威尔逊氏症和帕金森症等。同时Cu²⁺在工业环境中也是常见的污染物之一。根据世界卫生组织(WHO)报道，Cu²⁺在引用水中的标准含量应低于20μmol/L。故在生理环境及自然环境中准确，定量的检测Cu²⁺的含量具有十分重要的意义，目前检测Cu²⁺的诸多方法中，光谱分析法因高选择性和灵敏度高的特点备受学者们关注。光谱分析法主要是利用荧光化学探针与特定的金属离子之间发生相互作用时的荧光光谱的变化实现金属离子的检测。

1、在2015年年翟荣佳等人合成了一种亚胺键链接的罗丹明B-咔唑衍生物在《化学研究与应用》第27期1277-1282页的文章《一种罗丹明类Cu²⁺荧光探针化合物的合成及性能研究》，并发现该化合物在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和水(体积比1∶9)的体系中对Cu²⁺具有较好的选择识别性,但是pH值对其干扰性较强。该Cu²⁺探针只能通过荧光光谱检测Cu²⁺，需要价格昂贵的，精密度高的仪器来完成，对设备要求较高；Cu²⁺探针对检测环境要求较高，易受外界环境的干扰，使探针的使用范围受到限制。

发明内容

本发明要解决现有的Cu²⁺探针需要使用价格昂贵的高精密度荧光光谱仪检测的、易受外界环境干扰的Cu²⁺分子探针的技术问题，而提供一种用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针及其合成和使用方法。

本发明的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的结构式为：

上述用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的合成方法是采用罗丹明B肼和荧光素单醛反应得到，反应式如下：

合成方法具体合成步骤为：

一、按照荧光素单醛与罗丹明B肼的摩尔比为1:(1～5)，分别将荧光素单醛与罗丹明B肼加入到醇类溶剂中，加热至沸腾回流，反应6～10h，反应结束后，冷却，浓缩，得到反应混合物；

二、取200～300目硅胶填充的柱层析色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合液为淋洗剂，将混合物通过柱层析色谱梯度淋洗，进行分离，得到用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针。

上述的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的使用方法，按以下步骤进行：

一、将用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针溶解于甲醇(MeOH)与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液的混合液中，得到裸眼紫外分子探针溶液，颜色浅粉色；其中HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.4，混合液中甲醇与HEPES缓冲溶液的体积比为9：1，裸眼紫外分子探针溶液中紫外分子探针的浓度为10～50μmol/L；

二、取裸眼紫外分子探针溶液，向其中加入待测样品，混合4～6min，得到样品溶液；若样品溶液的颜色与裸眼紫外分子探针溶液的浅粉色相比，变成了深粉色，可判定待测样品中含有Cu²⁺；或者，用紫外分光光度计测试裸眼紫外分子探针溶液在波长为502和553nm处的吸光度值分别A₁和A₂；再测试样品溶液在波长为502和553nm处的吸光度值分别为B₁和B₂；如果同时达到B₁≥2A₁，B₂≥12A₂，则可判定样品溶液中含有Cu²⁺。

本发明用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针可实现在水环境体系中对Cu²⁺的裸眼和紫外选择性检测，不受水溶液中其他金属离子的干扰，具有较强的抗干扰能力。该裸眼和紫外分子探针在pH值为3～11范围内均可识别Cu²⁺，裸眼颜色均可由浅粉色变成深粉色；紫外光谱表现为两个紫外吸收波长的吸光度增强。裸眼检测具有直观性，响应迅速，可实现简便的Cu²⁺定性检测；紫外光谱检测方法简单，紫外吸光度的变化明显，实现了采用普遍的、价格低廉的紫外分光光度计定性和定量检测Cu²⁺。

该紫外分子探针的合成所需原料简单易得，成本低；步骤简单；反应条件温和，收率高，产率高达80％～90％。

本发明的裸眼和紫外分子探针可应用在水体系中Cu²⁺污染的前期检测中，具有极高的应用价值。

附图说明

图1是实施例1中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针在MeOH/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中在日光照射下裸眼观察分子探针与不同金属离子作用后的裸眼颜色变化。

图2是实施例1中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针在MeOH/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中的紫外光谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图3是实施例1中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针在MeOH/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中加入50μmol/L浓度的金属阳离子(Al³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、K⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Cd²⁺和Cu²⁺)后紫外光谱变化情况，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图4是实施例1中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针在MeOH/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中加入其他干扰离子(Al³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、K⁺、Cr³⁺、Co²⁺和Cd²⁺)存在紫外光谱变化情况，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图5是实施例1中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针在MeOH/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中加入不同浓度的Cu²⁺后的紫外光谱变化情况，横坐标为波长，纵坐标为吸光度；

图6是实施例1中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针在MeOH/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中553nm与502nm处的吸光度比值与Cu²⁺浓度变化的关系，横坐标为Cu²⁺浓度，纵坐标为553nm与502nm处吸光度。

图7是实施例1中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针在MeOH/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中，553nm处紫外光吸光度随着Cu²⁺浓度增加的紫外光谱变化情况，纵坐标为吸光度，横坐标为Cu²⁺浓度。

图8是实施例1中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针在MeOH/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中，为EDTA与Cu²⁺的反滴定紫外光谱变化情况，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图9是实施例1中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针在MeOH/HEPES缓冲溶液(v/v＝9/1，pH＝7.4)体系中，探针与Cu²⁺识别的可逆性变化情况，横坐标为循环次数，纵坐标为554nm处吸光度。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的结构式为：

具体实施方式二：具体实施方式一所述的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的合成方法如下：

二、按照荧光素单醛与罗丹明B肼的摩尔比为1:(1～5)，分别将荧光素单醛与罗丹明B肼加入到醇类溶剂中，加热至沸腾回流，反应6～10h，反应结束后，冷却，浓缩，得到反应混合物；

二、取200～300目硅胶填充的柱层析色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合液为淋洗剂，将混合物通过柱层析色谱梯度淋洗，进行分离，得到用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一中的醇类溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇；其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤二中二氯甲烷与甲醇的混合液中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:(90～99)；其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：具体实施方式一所述的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的使用方法，按以下步骤进行：

一、将用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针溶解于甲醇(MeOH)与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液的混合液中，得到裸眼紫外分子探针溶液，颜色浅粉色；其中HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.4，混合液中甲醇与HEPES缓冲溶液的体积比为9：1，裸眼紫外分子探针溶液中紫外分子探针的浓度为10～50μmol/L；

二、取裸眼紫外分子探针溶液，向其中加入待测样品，混合4～6min，得到样品溶液；若样品溶液的颜色与裸眼紫外分子探针溶液的浅粉色相比，变成了深粉色，可判定待测样品中含有Cu²⁺；或者，用紫外分光光度计测试裸眼紫外分子探针溶液在波长为502和553nm处的吸光度值分别A₁和A₂；再测试样品溶液在波长为502和553nm处的吸光度值分别为B₁和B₂；如果同时达到B₁≥2A₁，B₂≥12A₂，则可判定样品溶液中含有Cu²⁺。

用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：本实施例的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的合成方法如下：

一、将362mg(1mmol)荧光素单醛与461mg(1mmol)罗丹明B肼加入到20mL乙醇中，加热至沸腾并保持回流反应6h，反应结束后，冷却，浓缩，得到粗产品。

二、将粗产品通过以200–300目硅胶填充的柱层析色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合液为淋洗剂进行梯度淋洗,V_(DCM)∶V_(MeOH)分别为1∶99,1∶98,1∶97，柱层析分离得到用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针。经计算，产率为93％。

本实施例制备的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的熔点、在氘取代的DMSO溶剂中的¹H和¹³C NMR谱、红外光谱、及元素分析数据如下：

熔点326～329℃；¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)δ:9.93(s,2H),8.54(s,1H),7.99(d,1H,J＝6.6Hz),7.91(d,1H,J＝7.2Hz),7.56～7.46(m,3H),7.42～7.38(m,3H),7.07～6.95(m,3H),6.54～6.48(m,4H),6.47～6.31(m,3H),6.07(d,1H,J＝9.6Hz),3.31(q,8H,J＝7.2Hz),1.08(t,12H,J＝7.2Hz)；¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz),δ:190.41,186.50,158.35,155.72,154.71,152.40,151.93,151.74,149.41,143.20,139.41,133.56,132.63,131.21,129.32,129.21,128.70,128.02,128.09,127.18,126.08,125.69,115.61,114.42,114.31,110.64,109.56,107.79,106.45,105.71,97.70,84.82,76.2,47.1,47.17,12.90；IR(KBr)ν:3424,1677,1635,1579,1517,1444cm^–1；元素分析(％，C₄₉H₄₂N₄O₇计算值):w(C)＝73.79(73.67),w(H)＝5.25(5.30),w(N)＝6.93(7.01)。

从以上数据可以得到本实施例制备的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的结构式如下：

将本实施例制备的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针进行裸眼检测Cu²⁺，方法如下：

将用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针溶解于MeOH/HEPES缓冲(v/v＝9/1，pH＝7.4)溶液中，探针浓度为10μmol/L，充分混合，呈浅粉色；加入待测样品5min后，日光下裸眼观察颜色变化，其中待测样品为仅存在单一Cu²⁺或单一其他金属离子的溶液，作用后的日光下照片如图1所示，由图1可知，加入仅存在Cu²⁺的溶液后，样品管中溶液的颜色从浅粉色变成深粉色，而仅存在其他单一金属离子的溶液的样品管中溶液的颜色依然是浅粉色，无变化；待测样品中同时含有Cu²⁺和不同金属离子的溶液时，样品管的颜色从浅粉色变成深粉色，说明其他离子的存在不干扰该分子探针对Cu²⁺的检测。

将本实施例制备的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针进行紫外光谱检测，方法如下：

将用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针溶解在MeOH/HEPES缓冲(v/v＝9/1，pH＝7.4)溶液中，探针浓度为10μmol/L，充分混合，5min后采用紫外分光光度计检测其紫外吸收光谱，得到的紫外吸收光谱图如图2所示。由图2可知，本实施例制备的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的紫外吸收峰分别在502和553nm。

测试本实施例制备的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针与不同金属离子作用后的紫外发射光谱，具体方法如下：

将用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针加入到MeOH/HEPES缓冲(v/v＝9/1，pH＝7.4)溶液中，其中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的浓度为10μmol/L，然后再加入浓度为50μmol/L的金属离子，混合均匀，5min后测定其紫外可见光谱，其中金属离子分别为Al³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、K⁺、Cr^{3 +}、Co²⁺和Cd²⁺，得到的紫外可见光谱图如图3所示。由图3可知，加入不同的金属离子后，在502nm处的吸光度有轻微的增强，但增强幅度很小；553nm处的吸收峰强度基本保持不变。当加入Cu²⁺时，502和553nm处的两个紫外吸收波长的吸收强度均有增强，分别增强为原来的2倍和12倍。

将本实施例制备的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针进行抗金属离子干扰测试，方法如下：

将用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针加入到MeOH/HEPES缓冲(v/v＝9/1，pH＝7.4)溶液中，其中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的浓度为10μmol/L，再加入浓度为50μmol/L的常见的金属离子(Al³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、K⁺、Cr³⁺、Co²⁺和Cd²⁺)，混合均匀后，再分别向上述溶液中加入50μmol/L的Cu²⁺，再次混合，2h后分别测定其紫外可见光谱，如图4所示。由图4可知，常见的金属离子与Cu²⁺共存时，本实施例所制备的分子探针表现出的紫外可见光谱的两个吸收峰强度与Cu²⁺单独存在时几乎没有变化，即502和553nm处的两个紫外吸收峰强度增强幅度与Cu²⁺单独存在时类似。这说明本实施例制备的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针对Cu²⁺的检测具有选择性，不受其他常见金属离子的干扰。

检测本实施例制备的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针对不同浓度Cu²⁺的检测，具体方法如下：

将用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针到MeOH/HEPES缓冲溶液(其中MeOH与HEPES缓冲溶液的体积比为v/v＝9/1，HEPES缓冲溶液的pH＝7.4)中，其中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的浓度为10μmol/L，再次加入不同浓度的Cu²⁺在紫外分光光度计中测定吸光度值。

用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针随Cu²⁺浓度变化的紫外滴定光谱如图5所示，随着Cu²⁺浓度的增加，紫外分子探针在502和553nm处有两个吸收峰的吸光度同时增强，但两个吸收峰强度的增加速度不同。Cu²⁺浓度C低于0.6×10^-6mol/L(0.6当量)时，553nm处的吸光度增加速度明显高于502nm处吸光度的增长速度；Cu²⁺浓度增加到0.6×10^-6mol/L(0.6当量)时，两个吸收峰的吸光强度相当(如图6所示)；此后继续增加Cu²⁺离子浓度，553nm处吸光度迅速增加，而502nm处的吸光度增强缓慢；当Cu²⁺浓度增加到3.0×10^{- 6}mol/L(3.0当量)时，502和553nm的两个吸收峰强度都达到最大值，553nm处的吸光强度约为502nm处吸光度的1.5倍。继续增加Cu²⁺浓度，两个吸收峰的强度不再发生明显变化。以上数据说明，紫外分子探针对紫外光谱可以随着Cu²⁺浓度变化呈现规律性变化。

在上述结果的基础上，在Cu²⁺浓度0～2.6×10^-6mol/L范围内，用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针在553nm处的紫外吸光度与Cu²⁺浓度变化的线性关系，结果见图7。根据检测限的计算公式(C_DL＝3S_b/m)，由空白平行实验，经过拟合得到线性回归方程y＝0.0789x+0.0225，标准偏差R²＝0.9942，并通过计算得到络合常数K_a＝1.08×10⁶mol/L，用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的检测限达到0.23μmol/L，低于WHO所规定的饮用水中Cu²⁺的最大含量(20μmol/L)。说明紫外分子探针对Cu²⁺的紫外识别具有良好的线性关系，并优于检测饮用水中Cu²⁺浓度的标准。

检测本实施例制备的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针与Cu²⁺络合对EDTA的可逆检测，具体方法如下：

将用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针加入到MeOH/HEPES缓冲(v/v＝9/1，pH＝7.4)溶液中，其中用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的浓度为10μmol/L，再加入0.5μmol/L的Cu²⁺(10当量),溶液颜色由浅粉色变成深粉色；再向上述体系中加入5μL浓度为0.1mol/L的EDTA溶液(10当量)，体系颜色恢复到浅粉色。这个结果说明用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针对Cu²⁺的裸眼识别具有可逆性。溶液颜色变化与Cu²⁺和EDTA的连续识别的紫外光谱结果是一致的。图8为EDTA对探针化合物与Cu²⁺的反滴定曲线。随着EDTA的加入，EDTA迅速夺取了溶液中Cu²⁺，紫外分子探针化合物的紫外吸收强度逐渐下降，EDTA浓度达到10当量时，吸光度恢复到分子探针的吸光度，不再下降。这是由于EDTA与Cu²⁺的络合常数Ka＝3.16×10¹⁰mol/L远大于紫外分子探针与Cu²⁺的络合常数K_a＝1.08×10⁶mol/L，Cu²⁺与EDTA的络合能力强于Cu²⁺与紫外分子探针的络合能力。

用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针对Cu²⁺和EDTA连续识别的可逆性结果见图9。探针对Cu²⁺和EDTA的连续识别四次以后，波长553nm处的吸光度几乎保持不变。探针与Cu²⁺具有良好的结合和释放能力，识别具有可逆性。

实施例2：本实施例的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的合成方法如下：

一、将362mg(1mmol)荧光素单醛与912mg(2mmol)罗丹明B肼加入到20mL甲醇中，加热至沸腾并保持回流反应8h，反应结束后，冷却，浓缩，得到混合物。

二、将混合物通过柱层析色谱梯度淋洗进行分离，其中色谱柱中填充200～300目的硅胶，淋洗剂为二氯甲烷与甲醇的体积比的1:8的混合液，得到用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针。经计算，产率为95％。

实施例3：本实施例的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的合成方法如下：

一、将362mg(1mmol)荧光素单醛与684mg(1.5mmol)罗丹明B肼加入到20mL异丙醇中，加热至沸腾并保持回流反应9h，反应结束后，冷却，浓缩，得到混合物。

二、将混合物通过柱层析色谱梯度淋洗进行分离，其中色谱柱中填充200～300目的硅胶，淋洗剂为二氯甲烷与甲醇的体积比的1:9的混合液，得到用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针。经计算，产率为90％。

实施例4：本实施例的用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的合成方法如下：

一、将362mg(1mmol)荧光素单醛与1368mg(3mmol)罗丹明B肼加入到20mL丁醇中，加热至沸腾并保持回流反应7h，反应结束后，冷却，浓缩，得到混合物。

二、将混合物通过柱层析色谱梯度淋洗进行分离，其中色谱柱中填充200～300目的硅胶，淋洗剂为二氯甲烷与甲醇的体积比的1:8的混合液，得到用于用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针。经计算，产率为92％。

Claims (5)

1.一种用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针，其特征在于该分子探针的结构式为：

2.合成权利要求1所述的一种用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、按照荧光素单醛与罗丹明B肼的摩尔比为1:(1～5)，分别将荧光素单醛与罗丹明B肼加入到醇类溶剂中，加热至沸腾回流，反应6～10h，反应结束后，冷却，浓缩，得到反应混合物；

二、取200～300目硅胶填充的柱层析色谱柱，以二氯甲烷与甲醇的混合液为淋洗剂，将混合物通过柱层析色谱梯度淋洗，进行分离，得到用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针。

3.根据权利要求2所述的一种用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的合成方法，其特征在于步骤一中的醇类溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇。

4.根据权利要求2或3所述的一种用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的合成方法，其特征在于步骤二中二氯甲烷与甲醇的混合液中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:(90～99)。

5.使用权利要求1所述的一种用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、将用于裸眼检测的荧光素-罗丹明B铜离子紫外分子探针溶解于甲醇与4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液的混合液中，得到裸眼紫外分子探针溶液，颜色浅粉色；其中HEPES缓冲溶液混合液的pH＝7.4，混合液中甲醇与HEPES缓冲溶液的体积比为9：1，裸眼紫外分子探针溶液中紫外分子探针的浓度为10～50μmol/L；

二、取裸眼紫外分子探针溶液，向其中加入待测样品，混合4～6min，得到样品溶液；若样品溶液的颜色与裸眼紫外分子探针溶液的浅粉色相比，变成了深粉色，可判定待测样品中含有Cu²⁺；或者，用紫外分光光度计测试裸眼紫外分子探针溶液在波长为502和553nm处的吸光度值分别A₁和A₂；再测试样品溶液在波长为502和553nm处的吸光度值分别为B₁和B₂；如果同时达到B₁≥2A₁，B₂≥12A₂，则可判定样品溶液中含有Cu²⁺。