CN112574737A - 一种荧光传感材料及其在microRNA富集和/或检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光传感材料及其在microRNA富集和/或检测中的应用，属于核酸定量检测领域。本发明通过在microRNA适配体两端分别标记荧光分子和附加链ssDNA‑1’构成microRNA多功能适配体，与磁性NMOFs组装形成荧光传感材料；在microRNA存在下，多功能适配体通过ssDNA‑1’与磁性NMOFs表面的相互作用，仍然吸附在磁性NMOFs上，然后收集磁性NMOFs复合材料，并分散于磷酸缓冲液中，通过添加与ssDNA‑1’匹配的核酸链ssDNA‑1释放适配体，并对其进行荧光检测。该方法对microRNA具有较高的富集能力，为microRNA等核酸的提取和检测提供了新的方法。

Description

一种荧光传感材料及其在microRNA富集和/或检测中的应用
技术领域
本发明属于核酸定量检测领域，具体涉及一种荧光传感材料及其在microRNA富集和/或检测中的应用。
背景技术
循环游离核酸（包括循环肿瘤DNA和microRNA）已被证实参与了生命系统的各种生理和病理过程，包括细胞的增殖、凋亡以及肿瘤的发生和耐药等。某些循环肿瘤DNA和microRNA在血浆中是稳定存在的，已被认为是疾病诊断和治疗的潜在生物标志物。例如，miR-21是一种内源性非编码microRNA，与肿瘤的增殖、凋亡和侵袭有关，已被用作肿瘤治疗和诊断的生物标志物；而该类核酸物质在血液系统中的表达水平普遍很低。目前，microRNA的检测方法主要有Northern blotting法、实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）和微阵列分析等；开发简单、灵敏、特异的microRNA和循环DNA定量检测方法仍然是一个挑战。
近年来，人们开发了一系列核酸检测的新方法，如电化学传感器、发光传感器和拉曼传感器，特别是基于纳米材料的发光传感器显示出了显著的优势。其中，纳米金属有机骨架（Nanoscale metal-organic frameworks，NMOFs）是一种由金属中心和有机配体配位而成的多孔材料，其结构和功能可以通过改变金属中心或有机配体的组成来实现。这些金属中心或有机配体广泛应用于气体储存和分离、催化、生物传感器和药物递送等领域，通过引入荧光配体、金属离子或客体部分，NMOFs可以获得发光功能，并进一步用于生物分子传感。特别是NMOFs可与核酸适配体组装，用于microRNA/DNA的荧光传感。
发明内容
本发明的目的是提供一种多功能核酸适配体与磁性NMOFs材料组装成的功能材料，及其对microRNA的富集与荧光检测方法。通过多功能核酸适配体中的附加链，调控适配体在NMOFs表面的吸附/脱附行为，该方法可实现核酸分子的富集与荧光检测。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种荧光传感材料，由microRNA多功能适配体和磁性纳米金属有机骨架材料组成，所述microRNA多功能适配体通过π-π 相互作用和/或静电作用吸附在磁性纳米金属有机骨架材料；
所述microRNA多功能适配体由microRNA适配体、荧光分子和附加链ssDNA-1’构成，荧光分子和附加链ssDNA-1’分别连接在microRNA适配体的两端。
进一步地，所述荧光分子选自FAM、TAMRA或TexasRed。
进一步地，所述荧光传感材料，由microRNA多功能适配体和磁性纳米金属有机骨架材料组成；
所述microRNA多功能适配体由microRNA适配体、荧光分子和附加链ssDNA-1’构成，荧光分子为FAM，附加链ssDNA-1’的序列为5′-3′: TCTCAGAGTCTCAGAG；
所述磁性纳米金属有机骨架材料由Fe3O4纳米粒子和1,3,5-苯三甲酸制成。
在本发明的一个实施例中，上述荧光传感材料通过以下方法制备得到：
步骤1，磁性纳米金属有机骨架材料的制备：将Fe3O4纳米粒子和1,3,5-苯三甲酸分散在水中，然后密封在聚四氟乙烯管中，进行水热反应，制得磁性纳米金属有机骨架材料Fe3O4@MIL-100；
步骤2，将microRNA多功能适配体（两端分别标记荧光分子FAM和附加链ssDNA的microRNA适配体）与Fe3O4@MIL-100在磷酸缓冲液中混合，形成复合物，即荧光传感材料。
上述荧光传感材料在microRNA富集和/或检测中的应用。
进一步地，所述应用的具体方法为：将荧光传感材料加至含有待测microRNA的样品中，混合后，通过磁铁收集吸附有待测microRNA的荧光传感材料，将其分散在磷酸缓冲液中，加入与附加链ssDNA配对的ssDNA，使荧光传感材料释放microRNA-microRNA多功能适配体，即可实现microRNA的富集和/或检测。
本发明通过设计多功能核酸适配体与磁性NMOFs复合材料结合，实现高灵敏度、高选择性的microRNA核酸富集和检测。将microRNA适配体两端分别标记荧光分子和附加链ssDNA-1’（5′-3′: TCTCAGAGTCTCAGAG SEQ ID NO.1），与磁性NMOFs组装。在microRNA存在下，多功能适配体通过ssDNA-1’与磁性NMOFs表面的相互作用，仍然吸附在磁性NMOFs上。然后，收集磁性NMOFs复合材料，并分散于磷酸缓冲液中，通过添加与ssDNA-1’匹配的核酸链ssDNA-1释放适配体，并对其进行荧光检测。结果显示，该方法对microRNA具有较高的富集能力，为microRNA等核酸的提取和检测提供了新的方法。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明的microRNA富集与检测方法简单，且成本低。
（2）本发明的多功能适配体Fl-Ap-a 可标记不同发射波长的荧光分子，同时对多种microRNA进行检测。
（3）本发明的Fl-Ap-a+Fe3O4@MIL-100复合材料可直接加入到microRNA样品中进行富集与检测，有简便、快速、灵敏的特点。
附图说明
图1 为本发明实施例中Fe3O4@MIL-100复合材料富集与检测miR-21的原理。
图2 为实施例1中Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@MIL-100材料的扫描电镜图。其中：a为Fe3O4纳米粒子，b为Fe3O4@MIL-100。
图3为实施例1中FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100用于检测miR-21的荧光光谱图（FI为荧光强度）。
图4为实施例1中FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100对miR-21的检测的线性关系。
图5为实施例1中 FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100对miR-21检测的选择性
图6为实施例2中TexasRed-Ap2-a+Fe3O4@MIL-100用于检测D1的荧光光谱图。
图7为实施例2中TexasRed-Ap2-a+Fe3O4@MIL-100对D1的线性关系。
图8为实施例3中不同附加链ssDNA-1’用于miR-21的检测的线性关系。
具体实施方式
本发明通过设计多功能核酸适配体与磁性NMOFs复合材料结合形成荧光传感材料，实现高灵敏度、高选择性的microRNA核酸富集和检测。
具体地，所述荧光传感材料包括microRNA多功能适配体（在microRNA适配体两端分别标记荧光分子和附加链ssDNA-1’）和磁性NMOFs材料，microRNA多功能核酸适配体通过π-π 相互作用或静电作用与磁性NMOFs材料进行组装。所述的荧光分子为FAM、TAMRA和TexasRed等荧光分子，所述附加链ssDNA-1’为随机的单链DNA链；在本发明中，所述磁性NMOFs材料为包覆MIL-100的Fe3O4复合材料（Fe3O4@MIL-100），以Fe3O4为核，以MIL-100为壳。
在本发明的一个实施例中，选用适配FAM-Ap1-a（5′-3′:FAM-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATCTCAGAGTCTCAGAG）吸附在Fe3O4@MIL-100材料表面，然后将FAM-Ap1-a +Fe3O4@MIL-100用于miR-21检测。所述应用是向待测miR-21样品中先加入FAM-Ap1-a +Fe3O4@MIL-100复合材料，通过磁性富集miR-21；所富集的miR-21可通过加入ssDNA-1释放，并进行荧光检测。具体地：将多功能适配体FAM-Ap1-a通过π-π 相互作用或静电吸附作用，吸附于Fe3O4@MIL-100表面，形成FAM-Ap1-a +Fe3O4@MIL-100复合材料；当与样品中miR-21作用后，FAM-Ap1-a中Ap1部分与miR-21形成双链结构，而其附加链ssDNA-1’部分仍然吸附于Fe3O4@MIL-100复合材料表面。因此，miR-21可通过Fe3O4@MIL-100复合材料的磁性作用被富集；向富集后的材料中加入与ssDNA-1’配对的核酸链ssDNA-1后，FAM-Ap1-a完全形成双链DNA结构，该结构不再吸附于Fe3O4@MIL-100表面，通过检测上清液中双链FAM-Ap1-a的荧光强度，可对miR-21进行定量。检测原理如图1所示。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
miR-21的富集与荧光检测
（一）荧光传感材料的制备：
1. Fe3O4@MIL-100材料的制备
将Fe3O4纳米粒子（0.4 g）和1,3,5-苯三甲酸（H3BTC，0.6 g）分散于9 mL H2O中，在25℃条件下，搅拌5 min；然后密封在聚四氟乙烯管中，在150℃下反应12 h。用磁吸附收集产物，并用80℃的水和60℃的乙醇分别洗涤。
图2（a和b）为Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@MIL-100材料的扫描电镜图，由电镜图可知MIL-100包覆在了Fe3O4纳米粒子表面。
2. miR-21适配体在Fe3O4@MIL-100上的组装
将两端分别标记荧光分子FAM和附加链ssDNA-1’的miR-21适配体（FAM-Ap1-a）（20nM）与Fe3O4@MIL-100（0.5 mg·mL-1）在1 mL磷酸缓冲液中混合，10 min后，通过磁铁收集FAM-Ap1-a与Fe3O4@MIL-100形成的复合物（FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100），并分散于500 μL磷酸缓冲液中。
（二）miR-21的富集与荧光检测
取100 μL FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100的分散液，加入70 mL含miR-21的血浆样品中，10 min后，通过磁铁收集吸附有miR-21的FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100，并将其重新分散于400 μL的磷酸缓冲液中；加入与ssDNA-1’配对的核酸链ssDNA-1（30 nM），通过磁性收集FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100；通过荧光法检测上清液荧光强度。
图3为检测miR-21的荧光光谱图；由图4可知，FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100对miR-21的检测具有较好的线性关系。
（三）检测方法的选择性
将FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100分散于磷酸缓冲液中（0.5 mg·mL-1），然后加入miR-21、miR-21-5p（5′-3′: UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA SEQ ID NO.2）、let-7a (5′-3′:UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU SEQ ID NO.3)、人血清白蛋白（HSA）、谷胱甘肽（GSH）、三磷酸腺苷（ATP）、三磷酸尿苷（UTP）、三磷酸鸟苷 （GTP）和三磷酸胞苷（CTP）等分子。按实施例1中方法，进行富集检测。由图5可知，FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100对miR-21具有专一性。
实施例2
肿瘤相关基因片段D1（5′-3′：AACTCATGTTCAAGACAG SEQ ID NO.4）的检测
（一）荧光传感材料的制备：
1. Fe3O4@MIL-100材料的制备
参照实施例1的方法制备Fe3O4@MIL-100材料。
2. D1适配体在Fe3O4@MIL-100上的组装
将两端分别标记荧光分子TexasRed和附加链ssDNA-1’的D1适配体（TexasRed-Ap2-a）（20 nM）与Fe3O4@MIL-100（0.5 mg·mL-1）在1 mL磷酸缓冲液中混合，10 min后，通过磁铁收集TexasRed-Ap2-a与Fe3O4@MIL-100形成的复合物（TexasRed-Ap2-a+Fe3O4@MIL-100），并分散于500 μL磷酸缓冲液中。
（二）D1的富集与荧光检测
取100 μL TexasRed-Ap2-a+Fe3O4@MIL-100的分散液，加入70 mL含D1的血浆样品中，10 min后，通过磁铁收集吸附有D1的TexasRed-Ap2-a+Fe3O4@MIL-100，并将其重新分散于400 μL的磷酸缓冲液中；加入与ssDNA-1’配对的核酸链ssDNA-1（30 nM），通过磁性收集TexasRed-Ap2-a+Fe3O4@MIL-100；通过荧光法检测上清液荧光强度。
图6为检测D1的荧光光谱图；由图7可知，TexasRed-Ap2-a+Fe3O4@MIL-100对D1的检测具有较好的线性关系。
实施例3
附加链ssDNA-1’的筛选
1. Fe3O4@MIL-100材料的制备
参照实施例1的方法制备Fe3O4@MIL-100材料。
2. 含不同附加链ssDNA-1’的miR-21适配体在Fe3O4@MIL-100上的组装
将miR-21适配体一端标记FAM，另一端标记三种不同附加链ssDNA-1’，如下所示（其中下划线部分为附加链ssDNA-1’）：
FAM-Ap1-a (5′-3′): FAM-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA TCTCAGAGTCTCAGAG （SEQ IDNO.5）；
FAM-Ap1-b (5′-3′): FAM-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA TCTCAGAG （SEQ ID NO.6）；
FAM-Ap1-c (5′-3′): FAM-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA TCTCAGAGTCTCAGAGTCTCAGAG （SEQ ID NO.7）。
将以上三种多功能适配体（FAM-Ap1-a，FAM-Ap1-b和FAM-Ap1-c）（20 nM）分别与Fe3O4@MIL-100（0.5 mg·mL-1）在1 mL磷酸缓冲液中混合，10 min后，通过磁铁收集多功能适配体与Fe3O4@MIL-100形成的复合物，并分别分散于500 μL磷酸缓冲液中。
3. 分别取多功能适配体与Fe3O4@MIL-100复合物的分散液100 μL，加入70 mL含miR-21的血浆样品中，10 min后，通过磁铁收集吸附有miR-21的磁性复合物，并分别重新分散于400 μL的磷酸缓冲液中；分别加入与三种ssDNA-1’配对的核酸链（30 nM），通过磁性收集磁性材料；通过荧光法检测上清液荧光强度，并比较三种方法检测miR-21的线性关系。
由图8可知，FAM-Ap1-a+Fe3O4@MIL-100复合物对miR-21的线性关系斜率更高，具有较好的荧光响应，能够更好地反映miR-21浓度与荧光信号的关系。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种荧光传感材料及其在microRNA富集和/或检测中的应用
<130> 20201203
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctcagagtc tcagag 16
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ucaacaucag ucugauaagc ua 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aactcatgtt caagacag 18
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaacatcag tctgataagc tatctcagag tctcagag 38
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaacatcag tctgataagc tatctcagag 30
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcaacatcag tctgataagc tatctcagag tctcagagtc tcagag 46

Claims (6)

1.一种荧光传感材料，其特征在于：由microRNA多功能适配体和磁性纳米金属有机骨架材料组成，所述microRNA多功能适配体通过π-π 相互作用和/或静电作用吸附在磁性纳米金属有机骨架材料表面；
所述microRNA多功能适配体由microRNA适配体、荧光分子和附加链ssDNA-1’构成，荧光分子和附加链ssDNA-1’分别连接在microRNA适配体的两端。
2.根据权利要求1所述的荧光传感材料，其特征在于：所述荧光分子选自FAM、TAMRA或TexasRed。
3.根据权利要求1所述的荧光传感材料，其特征在于：由microRNA多功能适配体和磁性纳米金属有机骨架材料组成；
所述microRNA多功能适配体由microRNA适配体、荧光分子和附加链ssDNA-1’构成，荧光分子为FAM，附加链ssDNA-1’的序列为5′-3′: TCTCAGAGTCTCAGAG；
所述磁性纳米金属有机骨架材料由Fe3O4纳米粒子和1,3,5-苯三甲酸制成。
4.权利要求1所述的荧光传感材料在microRNA富集和/或检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用的具体方法为：将荧光传感材料加至含有待测microRNA的样品中，混合后，通过磁铁收集吸附有待测microRNA的荧光传感材料，将富集待测microRNA的荧光传感材料分散在磷酸缓冲液中，加入与附加链ssDNA-1’配对的ssDNA，使荧光传感材料释放microRNA-microRNA多功能适配体，即可实现microRNA的富集和/或检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述待测microRNA为miR-21或肿瘤相关基因片段D1。
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CN114113013B (zh) * 2021-11-12 2023-11-03 中国药科大学 一种荧光适配体探针及其在microRNA/ctDNA核酸分子检测中的应用

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