CN105155324A - 一种嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中的应用，该嗜热毛壳菌纤维素酶采用里氏木霉、或毕赤酵母表达。该嗜热毛壳菌纤维素酶为中性纤维素酶，在制浆造纸工艺中，该嗜热毛壳菌纤维素酶的最佳作降低使用成本。该中性造纸体系pH的正常波动对该嗜热毛壳菌纤维素酶酶活影响较小。该嗜热毛壳菌纤维素酶在打浆前预处理机针浆和机阔浆，可对机针浆和机阔浆纤维进行改性，从而提高纤维间结合力，成纸层间结合强度和抗张强度显著提高，且松厚度和挺度无明显变化。

Description

一种嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中的应用

技术领域

本发明涉及生物酶制剂领域，具体涉及一种嗜热毛壳菌纤维素酶的新用途，尤其涉及一种嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中的应用。

背景技术

随着生物科学技术的发展，生物技术在制浆造纸工业得到了越来越广泛的应用，已成为众人研究的焦点领域。生物技术应用于原料制浆可减少能源消耗，降低纸浆硬度，改善纸浆的性能；生物技术应用于纸浆漂白可提高纸浆可漂性，减少化学漂白助剂用量，降低漂白废水污染负荷。生物技术在制浆造纸工业的应用，很大程度上解决了部分传统制浆造纸过程中出现的一系列工艺技术、污染、能耗等问题，可提高植物纤维原料的产量和质量，改进制浆造纸工艺过程，提高产品质量，减少对环境的污染，节约能耗。

随着近年来造纸工艺技术的快速发展，人们对纸张质量要求也不断提高，造纸技术从传统酸性造纸已逐步向中性造纸变迁，纸机系统pH值由4.5～5.5提高到6.5～7.5；这不仅减少了对环境的污染，降低设备的腐蚀，纸张质量也有很大幅度提升。

在酸性造纸工艺中，最早是采用酸性纤维素酶来预处理化针浆和化阔浆，pH值一般控制在4.5～5.0左右，可降低打浆能耗14％～20％，且强度指标无影响。随着造纸工艺由传统酸性造纸向中性造纸的变迁，酸性纤维素酶在造纸中的应用问题越来越多：

1、中性条件下，酸性纤维素酶失活严重，pH大于7.0时，酶活存活率不足60％。从而导致酶应用效率大大降低，降低了应用效果，为达到应用效果不得不提高酶用量，导致酶制剂使用成本大大提升。

2、酸性纤维素酶在中性条件下，pH值的波动对酶活的影响较大。纸机系统pH值由7.0波动到7.5时，酶活存活率会由60％降低到40～30％，酶活的波动会导致使用效果的大幅度变化，从而使影响纸张质量的稳定。

3、在白板纸、白卡纸的生产中，芯层主要使用机针浆和机阔浆来达到白板纸和白卡纸高挺度、高松厚度、低克重、低成本都要求。但机针浆和机阔浆木素和半纤维素含量较高，纤维结合力较差，往往会出现成纸强度、层间结合强度低，印刷适印性差等问题。怎样平衡松厚度与层间结合之间的矛盾，增加芯层机针浆和机阔浆的用量成为造纸企业急于解决的难题。纤维素酶在化学浆上的应用技术已比较成熟；而磨浆前酶预处理机针浆和机阔浆上的应用还处于探索阶段，打浆能耗节约不明显，且层间结合指标无明显改善。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种嗜热毛壳菌纤维素酶的新用途，即在制浆造纸工艺中的应用，解决了现有技术存在的如下问题：中性条件下，酸性纤维素酶失活严重，pH值的波动对酶活的影响较大，纤维结合力较差从而出现成纸强度、层间结合强度低，印刷适印性差等问题。

本发明涉及的嗜热毛壳菌纤维素酶，是申请人于2013年7月5日申请的专利申请号为201310280267.6，发明名称为“一种嗜热毛壳菌纤维素酶及其制备方法和应用”的发明专利申请。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一种嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶按如下方法制得：

1)嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQIDNO.2所示,合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；

2)嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3)里氏木霉的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，分泌到细胞外的嗜热毛壳菌纤维素酶为SEQIDNO.3所示序列的第22-314位氨基酸序列；步骤3)具体为：首先，用EcoRI降解步骤2)构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUTC-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析；所述木霉纤维素酶诱导培养液的pH值为4.8，用乳糖作为诱导物。

作为本发明优选的技术方案，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为中性纤维素酶，在制浆造纸工艺中，所述嗜热毛壳菌纤维素酶的最佳作用pH范围为6.0～7.0，在中性造纸系统中酶活存活率在90％以上。

作为本发明优选的技术方案，所述嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中预处理机针浆和机阔浆的处理步骤如下：

预先向水力碎浆机槽体内加入1/3容积的碎浆用水，启动水力碎浆机，按用量要求加入所述嗜热毛壳菌纤维素酶，然后将机针浆与机阔浆按10～30:90～70的对应比例(优选比例为15:85)投放浆料进行碎浆，保持所述嗜热毛壳菌纤维素酶与浆料在水力碎浆机里反应时间在40分钟以上。

作为本发明优选的技术方案，所述碎浆的pH值控制在6.5～7.5的范围内；所述碎浆的温度控制在30～50℃；所述嗜热毛壳菌纤维素酶的用量控制在0.1～0.5kg/t绝干浆。

作为本发明优选的技术方案，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为液体酶制剂。

在本发明的另一方面，提供一种嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶按如下方法制得：

1)嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQIDNO.4所示；

2)嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3)毕赤酵母的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；步骤3)具体为：首先，用SpeI限制性内切酶将步骤2)构建的表达质粒切开后，直接转化毕赤酵母菌；随即挑选多个白色毕赤酵母菌落、培养、诱导后，将菌体与培养液分离，培养液通过SDS-PAGE电泳分析。

作为本发明优选的技术方案，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为中性纤维素酶，在制浆造纸工艺中，所述嗜热毛壳菌纤维素酶的最佳作用pH范围为6.0～7.0，在中性造纸系统中酶活存活率在90％以上。

作为本发明优选的技术方案，所述嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中预处理机针浆和机阔浆的处理步骤如下：

预先向水力碎浆机槽体内加入1/3容积的碎浆用水，启动水力碎浆机，按用量要求加入所述嗜热毛壳菌纤维素酶，然后将机针浆与机阔浆按10～30:90～70的对应比例(优选比例为15:85)投放浆料进行碎浆，保持所述嗜热毛壳菌纤维素酶与浆料在水力碎浆机里反应时间在40分钟以上。

作为本发明优选的技术方案，所述碎浆的pH值控制在6.5～7.5的范围内；所述碎浆的温度控制在30～50℃；所述嗜热毛壳菌纤维素酶的用量控制在0.1～0.5kg/t绝干浆。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、造纸用中性纤维素酶最佳作用pH范围6.0～7.0，在中性造纸系统中酶活存活率在90％以上，酶应用效率高，使用成本低。

2、中性造纸体系pH的正常波动对中性纤维素酶酶活影响较小，纸机系统pH值由7.0波动到7.5时，酶活存活率由94％降低到90％，酶使用效果影响不大，纸机运行、成纸物理指标稳定。

3、造纸用中性纤维素酶在打浆前预处理机针浆和机阔浆，可对机针浆和机阔浆纤维进行改性，磨浆能耗明显下降，促进磨浆时纤维的分丝帚化，纤维平均长度提高，细小纤维含量降低，并赋予纤维表面更多的暴露羟基，从而提高纤维间结合力，成纸层间结合强度和抗张强度显著提高，且松厚度和挺度无明显变化。

附图说明

图1是本发明实施例3中的标准曲线(pH＝6.5条件下)示意图。

图2是本发明实施例3中嗜热毛壳菌纤维素酶(造纸用中性纤维素酶)CMC酶活pH曲线图。

图3是本发明实施例3中市场上收集的打浆用酸性纤维素CMC酶活pH曲线图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1采用里氏木霉表达的嗜热毛壳菌纤维素酶的制备(参见专利申请号为201310280267.6的发明专利申请公开文本CN103343111A的说明书的实施例1)。

实施例2采用毕赤酵母表达的嗜热毛壳菌纤维素酶的制备(参见专利申请号为201310280267.6的发明专利申请公开文本CN103343111A的说明书的实施例3)。

实施例3嗜热毛壳菌纤维素酶在造纸工艺中为中性纤维素酶的定性试验(酶活存活率在90％以上，且在中性范围内酶活受pH影响较小)

纤维素酶CMC酶活检验的具体步骤及方法如下：

1、原理

在一定温度和pH条件下纤维素酶水解纤维素产生单糖和寡糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下与DNS试剂发生显色反应，反应液颜色的强度与酶解产生还原糖的量成正比，还原糖生成量与反应液中纤维素酶活力成正比，通过分光比色测定反应液吸光度，可计算纤维素酶活力。

2、仪器和设备

分析天平：感量0.0001g

精密pH计：精确至0.01

磁力加热搅拌器

分光光度计：应符合GB9721有关规定，5mm比色皿

电热恒温水浴锅：30～100℃，±0.5℃

计时器：每小时误差不超过五秒

移液器：100～1000μL

微量进样器：0～50μL

3、试剂和溶液

3.1试剂

3.2缓冲溶液配制

表1

表2

不同pH值下的缓冲液用3M盐酸或者3M的氢氧化钠进行调节pH值。

3.310mg/mlCMC溶液：

精密称取CMC(sigmac-5678)1.0000g缓慢加入到80mL相应的缓冲液中，磁力搅拌至完全溶解(室温下2小时左右)。用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调pH值至相对应值，然后加入相对应的缓冲液定容至100mL。标记为10mg/mlCMC溶液，同时标记pH及配制日期。4℃条件下保存，有效期7天。

3.410mg/mL标准葡萄糖溶液：

精密称取无水葡萄糖1.0000置80mL蒸馏水中搅拌溶解，待完全溶解后定容至100mL。标记为10mg/mL的标准葡萄糖溶液，同时标记配制日期，4℃条件下保存。

3.5DNS试剂的配制

称取3,5-二硝基水杨酸31.50g缓慢加入5000mL蒸馏水中，不断搅拌，水浴至45℃，逐步加入1000mL氢氧化钠溶液(200g/L)，不断搅拌至溶液清澈透明(在加入氢氧化钠溶液过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠910.0g、苯酚25.0g、无水亚硫酸钠25.0g，继续45℃水浴加热，同时补水3000mL，不断搅拌，至上述物质完全溶解后，冷却至室温，并定容到10000mL。用滤布过滤，将滤液储存于棕色瓶中，标识名称和配制日期，避光，室温保存7天后可以使用。有效期6个月。

4、分析步骤：

4.1标准曲线的绘制：

取8支试管按下表加入相关试液后再加入1.5mLDNS试剂,充分摇匀，置沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定容至5.0mL，用0号试管试液作对照，在540nm波长下测其它各试管试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。

表3

4.2待测酶液的制备：

4.2.1液体酶：用缓冲液稀释原酶液，控制待测酶液的浓度在0.16-0.19IU/ml之间。

4.2.2固体酶：精密称取固体原酶粉1.0000g溶于80mL蒸馏水中(稀释倍数≤500倍的直接用缓冲液溶解)；室温下磁力搅拌10min；用100mL容量瓶定容。离心后取上清液用缓冲液稀释，控制待测酶液的浓度在0.16-0.19IU/ml之间。

4.3水平控制：

取已知酶活力的纤维素酶，按样品酶稀释方法进行稀释，控制待测酶液的浓度在0.16-0.19IU/ml之间。

4.4酶活力的测定：

4.4.1取三支试管各加入0.5mLCMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。

4.4.2在第一、二试管中各加入0.5ml待测酶液，并计时，50℃水浴中反应15min。

4.4.3反应完后在三支试管中各加入1.5mL的DNS试剂，并在第三支试管中补加0.5mL的待测酶液。

4.4.4取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。

4.4.5迅速冷却至室温，用水定容到5.0mL。以第三支试管试液为对照在540nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度。

5、酶活力的计算：

酶活力(IU/mL或IU/g)＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n

式中：

180：葡萄糖从微克换算成微摩尔

15：待测液与底物的反应时间

0.5：加入反应的待测酶液量

n：酶样的稀释倍数

6、允许分析结果可以接受标准：

6.1允许总分析误差范围，两次取样并且检测结果相对误差小于10％。

6.2水平控制检测酶活力与标准活力相对误差小于10％。

6.3标准曲线至少由5点组成。

7.标准曲线(pH＝6.5条件下)如图1所示。

8.酶活计算(pH＝6.5)

pH＝6.5条件下测定吸光度值为：0.273，酶的稀释倍数为2500倍。

将吸光度值带入标曲中得到葡萄糖量＝(0.273+0.0357)/0.0014＝220.5ug

纤维素酶酶活＝220.5÷180÷15÷0.5×2500＝408IU/mL

9.不同pH条件下酶活的测定

根据以上实验步骤测定其他PH条件下的吸光度值，并计算相应的酶活。

测定结果如下表4所示：

表4

10.不同pH条件下的相对酶活

定义pH＝6.5条件下酶活为100％。

本发明的嗜热毛壳菌纤维素酶(造纸用中性纤维素酶)CMC酶活pH曲线：

50℃条件下，不同pH值下的相对CMC酶活(最佳pH6.5)见表5和图2所示。

表5

市场上收集的打浆用酸性纤维素酶KDNzymeD50(购自康地恩生物集团)在50℃条件下，不同pH值下的相对CMC酶活(最佳pH5.0)见表6和图3所示。

表6

从表5、表6、图2、图3比较可见，50℃条件下，本发明造纸用中性纤维素酶的CMC酶活最佳pH范围6.0～7.0，pH值为7.5时，CMC酶活存活率达到90％以上，适用于中性造纸系统；且在中性造纸环境下，pH的波动对酶活的存活率影响较小(纸机系统pH值由7.0波动到7.5时，酶活存活率由94％降低到90％)，造纸系统pH值的波动不会对酶应用效果产生影响，纸机运行、成纸物理指标稳定。可见，本发明的嗜热毛壳菌纤维素酶为高pH环境下适用的中性纤维素酶；在中性条件下，纤维素酶酶活存活率在90％以上，且在中性范围内酶活受pH影响较小。

实施例4：

本发明造纸用中性纤维素酶(采用实施例1或实施例2制得的嗜热毛壳菌纤维素酶)在打浆前预处理机针浆和机阔浆，碎浆pH值控制在7.0，调节碎浆温度在30±1℃，酶用量控制在0.1±0.1kg/t绝干浆。预先向水力碎浆机槽体内加入1/3容积的碎浆用水，启动水力碎浆机，按用量要求加入造纸用中性纤维素酶，然后将机针浆与机阔浆按30:70的对应比例投放浆料进行碎浆，保持造纸用中性纤维素酶与浆料在水力碎浆机里反应时间在40分钟以上。经造纸用中性纤维素酶预处理后的机针浆和机阔浆浆料在4880mm社会白卡纸机上进行抄造，抄造出的纸页主要物理指标与未使用造纸用中性纤维素酶预处理的纸页对比数据如下：

表7

实验前后机针浆和机阔浆比例保持不变，实验期间磨浆能耗稳定，成纸指标符合质量要求。由表7可以看出，使用造纸用中性纤维素酶打浆前预处理机针浆和机阔浆，磨浆能耗下降11.3％，裂断长提高9.3％，层间结合提高22.1％，厚度和挺度无明显变化，可见使用造纸用中性纤维素酶预处理机针浆和机阔浆，磨浆能耗显著降低，且在保持原有松厚度和挺度的前提下，大幅度提升层间结合强度和抗张强度。

实施例5：

本发明造纸用中性纤维素酶(采用实施例1或实施例2制得的嗜热毛壳菌纤维素酶)在打浆前预处理机针浆和机阔浆，碎浆pH值控制在7.5，调节碎浆温度在50±1℃，酶用量控制在0.5kg/t绝干浆。预先向水力碎浆机槽体内加入1/3容积的碎浆用水，启动水力碎浆机，按用量要求加入造纸用中性纤维素酶，然后将机针浆与机阔浆按15:85的对应比例投放浆料进行碎浆，保持造纸用中性纤维素酶与浆料在水力碎浆机里反应时间在40分钟以上。经造纸用中性纤维素酶预处理后的机针浆和机阔浆浆料在6200mm烟用白卡纸机上进行抄造，抄造出的纸页主要物理指标与未使用造纸用中性纤维素酶预处理的纸页对比数据如下：

表8

注:酸性纤维素酶为该纸厂原使用的酸性纤维素酶KDNzymeD50(购自康地恩生物集团)。

实验期间磨浆能耗稳定，成纸指标符合质量要求。由表8可以看出，使用造纸用中性纤维素酶打浆前预处理机针浆和机阔浆，机针浆比例下降9％，磨浆能耗下降5.4％，裂断长提高7.4％，层间结合提高18.4％，厚度和挺度无明显变化，可见相对于使用酸性纤维素酶，使用造纸用中性纤维素酶预处理机针浆和机阔浆时，可降低机针浆比例和磨浆能耗，且在保持原有松厚度和挺度的前提下，大幅度提升层间结合强度和抗张强度，从而提升烟用白卡纸的成纸品质和印刷适印性。

实施例6：

造纸用中性纤维素酶在打浆前预处理机针浆和机阔浆，碎浆pH值控制在6.5，调节碎浆温度在40℃，酶用量控制在0.25kg/t绝干浆。预先向水力碎浆机槽体内加入1/3容积的碎浆用水，启动水力碎浆机，按用量要求加入造纸用中性纤维素酶，然后将机针浆与机阔浆按10:90的对应比例投放浆料进行碎浆，保持造纸用中性纤维素酶与浆料在水力碎浆机里反应时间在40分钟以上。经造纸用中性纤维素酶预处理后的机针浆和机阔浆浆料在5800mm食品白卡纸机上进行抄造，抄造出的纸页主要物理指标与使用酸性纤维素酶、未使用酶预处理的纸页对比数据如下：

表9

注:酸性纤维素酶为该纸厂原使用的酸性纤维素酶KDNzymeD50(购自康地恩生物集团)。

实验期间磨浆能耗稳定，成纸指标符合质量要求。由表9可以看出，相对于使用酸性纤维素酶，使用造纸用中性纤维素酶打浆前预处理机针浆和机阔浆，酶用量下降50％，机针浆比例下降10％，磨浆能耗下降5.0％，裂断长提高4.3％，层间结合提高14.7％，厚度和挺度无明显变化，可见使用造纸用中性纤维素酶预处理机针浆和机阔浆的作用效率更高，相对于使用酸性纤维素酶可降低机针浆比例和磨浆能耗，且在保持原有松厚度和挺度的前提下，大幅度提升层间结合强度抗张强度，从而提升食品白卡纸的成纸品质和印刷适印性。

Claims (12)

1.一种嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶按如下方法制得：

1)嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQIDNO.2所示,合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；

2)嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3)里氏木霉的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，分泌到细胞外的嗜热毛壳菌纤维素酶为SEQIDNO.3所示序列的第22-314位氨基酸序列；步骤3)具体为：首先，用EcoRI降解步骤2)构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUTC-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析；所述木霉纤维素酶诱导培养液的pH值为4.8，用乳糖作为诱导物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为中性纤维素酶，在制浆造纸工艺中，所述嗜热毛壳菌纤维素酶的最佳作用pH范围为6.0～7.0，在中性造纸系统中酶活存活率在90％以上。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中预处理机针浆和机阔浆的处理步骤如下：

预先向水力碎浆机槽体内加入1/3容积的碎浆用水，启动水力碎浆机，按用量要求加入所述嗜热毛壳菌纤维素酶，然后将机针浆与机阔浆按10～30:90～70的对应比例投放浆料进行碎浆，保持所述嗜热毛壳菌纤维素酶与浆料在水力碎浆机里反应时间在40分钟以上。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述碎浆的pH值控制在6.5～7.5的范围内；所述碎浆的温度控制在30～50℃；所述嗜热毛壳菌纤维素酶的用量控制在0.1～0.5kg/t绝干浆。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为液体酶制剂。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的机针浆与机阔浆的比例为15:85。

7.一种嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中的应用，所述嗜热毛壳菌纤维素酶按如下方法制得：

1)嗜热毛壳菌纤维素酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌纤维素酶基因的序列如SEQIDNO.4所示；

2)嗜热毛壳菌纤维素酶表达质粒的构建；

3)毕赤酵母的转化与嗜热毛壳菌纤维素酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌纤维素酶的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；步骤3)具体为：首先，用SpeI限制性内切酶将步骤2)构建的表达质粒切开后，直接转化毕赤酵母菌；随即挑选多个白色毕赤酵母菌落、培养、诱导后，将菌体与培养液分离，培养液通过SDS-PAGE电泳分析。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为中性纤维素酶，在制浆造纸工艺中，所述嗜热毛壳菌纤维素酶的最佳作用pH范围为6.0～7.0，在中性造纸系统中酶活存活率在90％以上。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶在制浆造纸工艺中预处理机针浆和机阔浆的处理步骤如下：

预先向水力碎浆机槽体内加入1/3容积的碎浆用水，启动水力碎浆机，按用量要求加入所述嗜热毛壳菌纤维素酶，然后将机针浆与机阔浆按10～30:90～70的对应比例投放浆料进行碎浆，保持所述嗜热毛壳菌纤维素酶与浆料在水力碎浆机里反应时间在40分钟以上。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述碎浆的pH值控制在6.5～7.5的范围内；所述碎浆的温度控制在30～50℃；所述嗜热毛壳菌纤维素酶的用量控制在0.1～0.5kg/t绝干浆。

11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述嗜热毛壳菌纤维素酶为液体酶制剂。

12.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的机针浆与机阔浆的比例为15:85。