CN106323964B - 一种通过饲料实际制粒评价植酸酶的耐温抗逆性能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种低酶活饲料中饲用植酸酶活性的测定方法，并涉及一种通过饲料实际制粒评价植酸酶的耐温抗逆性能的方法，属于生物化学检测技术领域。所述低酶活饲料中饲用植酸酶活性的测定方法，通过限定试剂、细化试样溶液的过滤方法、调整稀释浓度、调整反应步骤，限定吸光度显示范围‑0.301‑4.000A等协同作用，使样品检出范围达到0.1‑50U/g。所述通过饲料实际制粒评价植酸酶耐温抗逆性能的方法，通过未添加植酸酶的粉状饲料制粒后再添加植酸酶，然后同一配方粉料先添加植酸酶后制粒，分别测定酶活，最后比较两种植酸酶添加方式酶活含量的差异，很好的消除了制粒前后酶活检出率差异，能够准确反映实际制粒的植酸酶存留率。

Description

一种通过饲料实际制粒评价植酸酶的耐温抗逆性能的方法

技术领域

本发明涉及一种低酶活饲料中饲用植酸酶活性的测定方法，并涉及一种通过饲料实际制粒评价植酸酶的耐温抗逆性能的方法，属于生物化学检测技术领域。

背景技术

植酸酶已经广泛应用于单胃动物的饲料生产中，大大降低了饲料成本和排泄磷对环境造成的污染，具有显著的经济效益、社会效益和生态效益。植酸酶也已经开始应用于水产动物饲料中，应用前景看好。然而，在中国的饲料工业中，70％以上的饲料是颗粒饲料，而植酸酶作为一种蛋白质，对热非常敏感。特别是在饲料制粒过程中，受到高温、高湿以及某些金属离子等条件的影响，非常容易失活。

随着现代生物技术和酶工程技术的不断进步，植酸酶生产工艺也取得了很大发展，各种耐高温植酸酶产品应运而生，但由于缺乏准确有效的耐高温性能评价方法，用户常常陷入不能合理并有效评价植酸酶产品的耐温性能的困境。

饲料的实际制粒过程各个加工阶段简介如下：

1、混合：将各个原料按照饲料配方称量后用混合机混合均匀，混合形成的粉状饲料称为粉料，即调质前粉料。

2、调质：混合后的粉料进入调质器调质。调质是指粉料在调制器内和一定温度的水蒸气充分混合后，形成含有18％左右水分的湿粉料的过程。该湿粉料即调制后湿粉料。

3、制粒：经过调质后的湿粉料进入制粒环模，被挤压成粒的过程。

4、冷却和筛分：出环模的颗粒，经过分级筛筛分为成品颗粒和非成品两部分，同时经受鼓风机鼓出的空气冷却到接近常温的饲料颗粒。非成品部分再回到制粒环模中再制粒。接近常温的成品颗粒就可以进入包装工序包装出厂。可以包装出厂的饲料颗粒即颗粒饲料。

通过饲料实际制粒评价植酸酶的耐温抗逆性能的方法，涉及两大部分技术，一是含植酸酶样品(包括含植酸酶的饲料)的植酸酶含量的测定方法，二是饲料实际制粒过程中外源植酸酶在饲料中酶活存留率的测定方法，分别介绍如下。

一、现有含植酸酶样品(包括含植酸酶的饲料)的植酸酶含量的测定方法

其名称为GB/T 18634—2009饲用植酸酶活性的测定(分光光度法)，现就和本发明相关部分简要说明，并指出其存在的不足，为方便与国标对比，以下编号为与国标对应的编号：

1范围

该方法使用范围是用作饲料添加剂用的植酸酶产品，以及添加有植酸酶的配合饲料。样品最低检出量为130U/kg。而实际上，配合饲料中目前一般添加植酸酶(5000U/g)100-1000g/吨，即使忽略饲料加工过程中的损失，经计算也可以知道配合饲料中植酸酶含量是0.5-5U/g，远远低于该方法最低检出量，故现有测定方法并不适用于实际配合饲料植酸酶的检测。

5、试剂和材料

国标检测方法中其中一种关键的液体试剂是乙酸缓冲液(1),c(CH₃COONa·3H₂O)＝0.25mol/L：称取20.52g无水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.5±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。室温下存放2个月有效。

由于配合饲料中含有大量容易使植酸酶失活的物质，其在液体状态中更容易使植酸酶失活。乙酸缓冲液(1)主要是用来稀释提取后酶液的，其不含有可以更好的保护植酸酶活性的物质，导致其不能很好的保护低植酸酶活样品酶液中的植酸酶活性，存在明显的不足。

6仪器和设备

国标方法对关键设备分光光度计要求是；有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。

现有测定方法的不足是未对所用分光光度计的吸光度测定范围做出规定，导致其对光的敏感度不确定，不能保证对低吸光度值测定出准确值。

8.1标准曲线

准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(1)溶解，并定容至刻度，浓度为50.0mmol/L。按表1的比例用乙酸缓冲液(2)稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷的量为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y＝a+bx)。

表1标准稀释比例

其不足是现有检测方法是基于130U/g的最低检出量设计的标准曲线，并不能用于0.5-5U/g植酸酶含量样品的测定，需要调整。同时，根据前述液体缓冲液理由，用乙酸缓冲液(2)替代乙酸缓冲液(1)，保证液体缓冲体系的一致性。

乙酸缓冲液(1),c(CH₃COONa·3H₂O)＝0.25mol/L：称取20.52g无水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.5±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。室温下存放2个月有效。

乙酸缓冲液(2)，c(CH₃COONa·3H₂O)＝0.25mol/L：称取20.52g无水乙酸钠，0.5g曲拉通X-100(Triton X-100)，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.5±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。室温下存放2个月有效。

8.2.2加酶饲料样品中酶的提取

称取添加植酸酶的饲料样两份，精确至0.0001g，置于200mL刻度锥形瓶中，加入乙酸缓冲液(2)100.0mL。在超声波溶解器上超声溶解15min，再放入回旋式振荡器中振荡30min。

所有提取后的试样必要时在离心机上以4 000r/min离心10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(2)稀释，使试样溶液的浓度保持在0.4U/ml左右，待反应。

现有测定方法中的缺陷是由于即使经过4000转/分钟离心10分钟，配合饲料中有仍然有许多微粒悬浮于上清乙酸缓冲液(2)，同时饲料中含有的植物油等漂浮于离心上清液表层，需要改进该方法。

8.3反应

取10mL试管按下面的反应顺序进行操作，标准空白加入0.2mL乙酸缓冲液(2)。在反应过程中，从加入底物溶液开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要一致，在37±0.1℃恒温水浴中水解30min。

底物溶液，c(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂，)＝7.5mmol/L：称取0.69g植酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂相对分子量为923.8，纯度为95％)，精确至0.1mg，置于100ml烧杯中，用约80ml乙酸缓冲液(1)溶解，用冰乙酸调节pH至5.5±0.01，转移至100mL容量瓶中，并用乙酸缓冲液(1)定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。

反应步骤及试剂、溶液用量见表2。

表2反应步骤及试剂、溶液用量

首先现有测定方法大量使用乙酸缓冲液(1)稀释待测定酶液，不能进一步保护植酸酶酶活不受配合饲料中某些物质影响而失活，需要调整。同时，该反应步骤是在稀释待测反应液的酶活浓度达到0.4U/mL左右时的测定方法，但由于配合饲料本身酶活一般只有0.5U/g，称样10g用100mL乙酸缓冲液(2)提取后，待测稀释液浓度只有0.05U/g，故需要调整该反应步骤，以便适应低酶活饲料的测定。

二、饲料实际制粒过程中外源植酸酶在饲料中酶活存留率的测定方法：

饲料中的植酸酶有两种来源，一种是内源植酸酶，指配方中一些植物性原料中本身含有的植酸酶；一种是外源植酸酶，指饲料中添加的植酸酶饲料添加剂。

测定某加工阶段外源植酸酶的存留率的计算公式：外源植酸酶存留率＝加工后外源植酸酶含量/加工前外源植酸酶含量×100％。

1.测定未添加待测植酸酶的调质前粉状配合饲料所含内源植酸酶酶活含量。

2.测定添加了待测植酸酶的调质前粉状配合饲料的植酸酶酶活含量。

3.测定制粒后颗粒配合饲料酶活含量

4.计算待测植酸酶的酶活存留率

待测植酸酶的制粒存留率＝颗粒配合饲料的酶活含量/(添加待测植酸酶的调质前粉状配合饲料植酸酶酶活含量―未添加待测植酸酶的调质前粉状配合饲料所含内源植酸酶酶活含量)×100％

5.按照待测植酸酶的存留率的差别来评价其耐温性能。

公开号CN 101175861A的进入中国的PCT申请《测定植酸酶活性的方法》提供了检测样品中植酸酶活性的方法，其包括将植酸酶底物与所述样品联合，并测量所述植酸酶底物的有机代谢水平。该方法侧重于测定微生物营养培养基中植酸酶活性和粗植酸酶制品中植酸酶活性，但其未考虑消除粗植酸酶制品(如配合饲料)中影响检测植酸酶活性的其他物质的措施，同时没有涉及检测结果的准确度。同时未涉及本发明消除因制粒过程而出现的对植酸酶测定的影响因素。

申请公布号CN 102033064 A的中国发明申请《一种检测饲料中植酸酶活性的方法》本发明涉及一种检测饲料中植酸酶活性的方法，属于饲料的化学成分分析技术领域。该方法通过一种新的提取液、稀释液以及检测流程，将饲料中的植酸酶完全浸提出来，同时消除了饲料中本身存在的无机磷对测定的干扰，检测结果的变异系数小，具有检测周期短、灵敏度高、重复性和准确性好的优点。该发明声称：现有技术测定方法测定结果的相对偏差比较大，变异系数大。由上述检测结果可知，本发明的检测方法消除了饲料中本身存在的无机磷对测定的干扰，变异系数小(小于0.2％)，有比较好的重复性和准确性。但该方法未考虑一般固体配合和饲料的添加植酸酶的酶活低达0.5U/g，经稀释后最终测定时液体的吸光度很低，对分光光度计灵敏度有很高的要求，该发明对此并未做限定。同时，该发明完全没有涉及在饲料制粒过程中检测植酸酶存留率遇到的问题，例如未考虑和制定应对制粒前后酶活检测因饲料成分变化检测结果变化大的情况，而本发明则考虑了在饲料制粒前后因配合饲料成分变化而导致的检测植酸酶活性准确度差异。

授权公告号CN 201864731 U的实用新型《微孔板检测饲用植酸酶活性试剂盒》公开了一种微孔板检测饲用植酸酶活性试剂盒，包括盒体，盒体上设置有盒盖其中，在盒体底部设置有放置微孔板的微孔板凹槽、放置标准溶液瓶的标准溶液瓶凹槽与放置试剂瓶的试剂瓶凹槽；所述微孔板凹槽为一个；所述标准溶液瓶凹槽为五个；所述试剂瓶凹槽为四个；所述试剂瓶包括底物瓶、乙酸缓冲液瓶、显色剂瓶和终止液瓶。本实用新型以微孔板为反应载体，结构简便、使用方便，可大大提高工作效率，实现大量样品的同时测定。该方法是提出微孔板技术检测方法，其未提出改进因配合饲料酶活低而导致的不能准确检测问题，更没有涉及因饲料制粒引起的酶活检测差异而需采取措施。

申请公布号CN 102980854 A的中国发明《一种植酸酶的检测方法》该发明属于生物检测领域，涉及一种用于检测样品中植酸酶的方法。主要是利用羧基-氨基化学偶联法偶联分散型纳米微球和植酸分了，在溶剂相中形成植酸酶与植酸结合的表面快速反应体系，产物正磷酸直接进入溶剂相，而未反应的肌醇衍生物仍滞留于固相微球。通过低温和高速离心去除微球，在酸性条件下在溶剂相中加入显色剂生成蓝色复合物，在波长700nm比色测定。该方法在实现植酸酶活力快速测定的同时，使未反应的肌醇衍生物仍滞留于固相微球，避免了常规方法中未完全反应的植酸分子与显色剂反应所造成的背景值干扰，使得痕量测定成为可能。适用于特定环境样品如土壤、水体和根际残留物中的痕量植酸酶样品测定。该方法并未进一步研究是否适用于饲料生产的复杂过程，未提出如因配合饲料中其他成分对植酸酶酶活检测影响的应对措施，无法保证酶活检测准确性。同时更没有涉及饲料制粒前后酶活存留率测定影响因素和应对措施。

申请公布号CN 104007110 A的中国发明《一种饲料中微量植酸酶活性的检测方法》本发明公开了一种检测饲料中微量植酸酶活性的方法。本方法在现有方法的基础上，通过增加称样量和反应体系中的酶液量，能显著提高饲料中植酸酶的检测灵敏度，使线性检测限降低到0.lU/g。当饲料中植酸酶酶活为0.18U/g时，利用本发明所述方法检测的酶活回收率高达98.92，变异系数数仅为0.5％(n＝6)，两次实验的误差小，从而说明本发明提供的方法其准确性和精确度均超过国标GB/T18634-2009《饲用植酸酶活性的测定-分光光度法》的要求，取得意料不到的技术效果。因检测低酶活饲料中植酸酶对分光光度计的要求很高，但该方法没有如本发明提出该措施。同时，该方法完全不涉及饲料制粒前后因成分变化而导致的检测结果的较大差异。

三、现有测定方法存在的问题

首先来说，目前我国饲用植酸酶活性检测标准是“GB/T18634－2009”，该方法可以用来检测配合饲料中的植酸酶活性，该方法的最低检出量是0.13U/g。每吨猪鸡配合饲料中一般添加规格5000U/g的植酸酶100g，配合饲料的理论外源植酸酶酶活含量是0.5U/g，该范围的建议称样量是5-10g。按照最高称样量10g，用100mL乙酸缓冲液(2)提取后，稀释液酶活只有0.05U/mL，远低于该方法所要求的稀释液浓度保持在0.4U/mL左右的要求，检测结果将很不准确。只有当称样量10g用12mL乙酸缓冲液(2)提取后，同时酶活在提取过程中没有任何损失，酶活浓度才有可能达到0.4U/mL。但是如此少的乙酸缓冲液不能将待测试样所含酶活提取完全，检测结果也不准确。

低酶活情况下，完全提取对稀释倍数的限制，导致稀释液酶活浓度远远达不到0.4U/mL的要求，导致了该方法并不能准确测定植酸酶活性。显然该方法并不能准确的测定低酶活的饲料中的植酸酶酶活水平。

其次，饲料制粒过程中，不只是高温因素影响存留率，调质湿度、饲料原料中一些金属离子等多种因素也对酶活存留率有非常重要的影响，所以评价耐温性能更严格的说应该是评价植酸酶的抗逆性能。

研究发现，由于配合饲料中某些因素的影响，添加在配合饲料中的外源植酸酶并不能完全检出，目前的植酸酶检测方法只能检出部分添加的外源植酸酶。近期，本发明研究发现，制粒前后同种植酸酶的检出率差别很大，制粒后植酸酶检出率明显提高。因此目前的实际制粒植酸酶存留率评价方法有明显的缺陷，其不能准确反映植酸酶的耐温性能。本发明同时也发现，检测同一次制粒试验中调质前粉料酶活、调质后粉料酶活、制粒后颗粒饲料酶活时，当采用相同稀释倍数时，比较待测样空白吸光值，调质后粉料空白吸光值、制粒后颗粒饲料吸光值有时明显高于调质前粉料空白吸光值。制粒后空白吸光值降低，而植酸酶检出率提高的现象说明，饲料配方原料中有某些成分对植酸酶检测有严重干扰，制粒前后这些成分的性质或含量发生了显著变化，其对植酸酶检出率影响降低，同时也降低了空白吸光值。

以前由于未能发现制粒前后对酶活的检测干扰存在显著差异，所以未能准确评价耐温性能，评价效果及可重复性都很差。其他模拟制粒的湿热法、干热法、缓冲液水浴法等方法，由于需要通过实际制粒的耐温效果来准确验证，实际制粒中耐温性测定的不准确直接影响了这些方法的准确性和真实性。

例如，在某中大猪配合饲料中添加4981U/g的某种耐高温植酸酶360g制粒，在调质前粉料、调质后湿粉料、制成的颗粒饲料中分别抽取8组样品，检测其植酸酶活性，结果如下：

表3同种饲料配方添加植酸酶制粒前后酶活检测结果(U/g，以绝干物质计)

一般来说，由于受制粒高温高湿及饲料中某些影响因子的影响，调质后粉料和制粒后颗粒饲料的植酸酶酶活含量都要有所下降。但从表3结果看，即使假设调质和制粒过程中酶活没有任何下降，调质后湿粉料和制粒后颗粒料的平均酶活仍然分别是调质前粉料的1.59倍和1.18倍，这说明调质后湿粉料和制粒后成品颗粒料的酶活检出率明显高于调质前粉料酶活检出率；原因可能是制粒过程的某些物理化学变化破坏了原来降低植酸酶检出率的某些物质，导致酶活检出率明显提高。

同时也可以看出，植酸酶添加酶活含量是1.793U/g，调质前粉料酶活检出值0.524，酶活检出率只有29％，可能是调质前粉料中所含有的某些物质严重影响了植酸酶检出率。

再看制粒对待测样空白吸光值的影响。

例如，通过实际制粒比较6种耐高温植酸酶耐温性能。试验在某中大猪配合饲料中添加5000U/g的待测耐高温植酸酶360g制粒，在调质前粉料、调质后粉料、制成颗粒饲料后分别抽取4组样品，检测其植酸酶活性，比较该试验中待测样空白值。酶活检测操作是首先称取5g样品，用100ml缓冲液(2)稀释提取，其他按照本发明“低酶活饲料中饲用植酸酶活性的测定方法”操作，用绝干物质校正的空白吸光值结果如下：

表4制粒前后待测样空白吸光值比较(相同称样绝干重、相同稀释倍数下)

从空白吸光值比较看出，制粒后所有空白吸光值都降低了。空白对照、产品A、产品B、产品C、产品D、产品E、产品F制粒后空白吸光值分别仅占制粒前的59.62％、79.12％、76.63％、86.51％、95.18％、86.67％，添加不同植酸酶的空白吸光值差别很大。制粒可能改变了饲料中所添加的无机磷等物质的性质，降低了无机磷等物质在缓冲液(2)中的溶解度，导致空白值降低。

由上述结果可以看出，现有技术未考虑制粒前后植酸酶检出率的明显差异，通过实际制粒植酸酶存留率(％)＝制粒后颗粒料酶活/调质前粉料酶活×100％来判断植酸酶耐温性是不准确的。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明进行广泛深入的研究，通过未添加植酸酶的粉状饲料制粒(称为空白制粒，下同)后再添加植酸酶，然后同一粉料先添加植酸酶后制粒，最后比较两种植酸酶添加方式酶活含量的差异，就可以很好的消除制粒前后酶活检出率差异，准确反映实际制粒的植酸酶存留率(％)。另外，本发明在研究中发现：配方原料所含的内源植酸酶由于耐温性差，在制粒后都全部失去酶活，因此本发明也省去了检测内源植酸酶这一步骤。

以上事实说明，本发明通过调整配合饲料中植酸酶活性测定方法和改善实际制粒酶活存留率的测定，可以准确合理的评定各种植酸酶的耐温性、抗逆性。

本发明的目的是提供一种通过饲料实际制粒评价植酸酶的耐温抗逆性能的方法。

如果没有特别说明，下述水分平均值、水分含量平均值，单位均为：质量百分比％。

一种通过饲料实际制粒评价植酸酶耐温抗逆性能的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1)空白制粒后补加植酸酶样的制备和酶活测定，其中，在按照饲料配方(不添加植酸酶)要求制粒和取样之后，混合植酸酶制得待测样品，测定待测样品的酶活和水分含量，算出酶活平均值A(U/g)和水分平均值B(％)，然后计算绝干样品酶活平均含量C，计算公式为：C＝A/(1-B)；

步骤2)成品颗粒饲料样的制备和酶活测定，其中，按照饲料配方(添加植酸酶)要求进行制粒和取样以得到待测样品，测定待测样品的酶活和水分含量，算出酶活平均值D(U/g)和水分含量平均值E(％)，然后计算绝干样品酶活含量F，计算公式为：F＝D/(1-E)；

植酸酶存留率(％)计算：植酸酶存留率(％)＝绝干样品酶活含量F/绝干样品酶活含量C×100％。

本发明中，优选地，酶活测定可以按照本发明提供的“低酶活饲料中饲用植酸酶活性的测定方法”。本发明中，水分测定可以按照GB/T 6435-2006饲料中水分和其他挥发性物质的测定。可以算出多份待测样品酶活的和(U/g)，然后除以待测样品份数，即酶活平均值A或酶活平均值D。可以算出多份待测样品水分含量的和(％)，然后除以待测样品份数，即水分平均值B或水分含量平均值E。

本发明中，优选地，步骤1)和/或步骤2)中，采用低酶活饲料中饲用植酸酶活性的测定方法来测定酶活。

一种通过饲料实际制粒评价植酸酶的耐温抗逆性能的方法，包括两大部分：

第一部分，低酶活饲料中饲用植酸酶活性的测定方法

1.范围

本方法提供了以分光光度法测定低酶活饲料中饲用植酸酶活性的方法，适用于添加有较低酶活的植酸酶的配合饲料、浓缩饲料。样品检出范围为0.1-50U/g。

2.规范性引用文件

GB/T 14699.1饲料采样

3.植酸酶活性单位的定义

下列术语和定义适用于本方法：

3.1植酸酶活性Phytase activity

在温度37℃、pH值5.5的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

4.原理

植酸酶在一定温度和pH条件下，将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，能与钒钼酸铵生成黄色的复合物，可于波长415nm下进行比色测定。

5.试剂和材料

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当程度的水。清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。

5.1磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：基准物。

5.2乙酸缓冲液，c(CH₃COONa·3H₂O)＝0.25mol/L：称取20.52g无水乙酸钠，0.5g曲拉通X-100(Triton X-100)，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.5±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。室温下存放2个月有效。

5.3底物溶液，c(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂，)＝7.5mmol/L：称取0.69g肌醇六磷酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂分子量为923.8，纯度为95％)，精确至0.1mg，置于100ml烧杯中，用约80ml乙酸缓冲液(5.2)溶解，用冰乙酸调节pH至5.5±0.01，转移至100mL容量瓶中，并用乙酸缓冲液(5.2)定容至刻度，现用现配。

5.4硝酸溶液：1份浓硝酸+2份水。

5.5钼酸铵溶液，100g/L：称取10g钼酸铵[(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O]于50mL烧杯中加热溶解，必要时可微加热，再转移至100ml容量瓶中，加入1.0mL氨水(25％)用水定容至刻度，所述氨水浓度为质量百分比。

5.6偏钒酸铵溶液，2.35g/L：称取0.235g偏钒酸铵(NH₄VO₃)于50mL烧杯中，加入2mL硝酸溶液(5.4)及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再转移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度。避光条件下保存一周内有效。

5.7酶解反应终止及显色液：移取2份硝酸溶液(5.4)，1份钼酸铵溶液(5.6)，1份偏钒酸铵溶液(5.7)混合后使用，现用现配。

6.仪器和设备

实验室常用仪器设备及以下设备。

6.1分析天平：感量0.1mg。

6.2恒温水浴：37±0.1℃。

6.3分光光度计；有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度，且吸光度显示范围达到-0.301-4.000A

6.4磁力搅拌器。

6.5涡流式混合器。

6.6酸度计：pH值精确至0.01。

6.7离心机：转速为4000r/min以上。

6.8超声波溶解器。

6.9回旋式振荡器。

6.10一次性针头滤器(水系，规格25mm×0.45μm和规格13mm×0.22μm)

6.11注射器：规格10mL

7试样制备

按GB/T 14699.1的规定进行采样，选取有代表性样品，用四分法将试样缩分至200g，低酶活的配合饲料和浓缩饲料需用粉碎机粉碎通过0.45mm标准筛，装入密封容器，防止试样成分变化。

8测定步骤

8.1标准曲线

准确称取0.3402g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于500mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(5.2)溶解，并定容至500mL，浓度为5.0μmol/mL。按下面表5的比例用乙酸缓冲液(5.2)稀释成不同浓度基准待反应液，与待测试样一起反应测定。以吸光值为横坐标，反应体系中的无机磷浓度量(μmol/mL)为纵坐标，列出直线回归方程(y＝ax+b)。

表5标准稀释比例

8.2试样溶液的制备：

按照表7建议称取添加植酸酶的饲料试样两份，精确至0.0001g，置于200mL刻度锥形瓶中，加入乙酸缓冲液(5.2)100.0mL。在超声波溶解器上超声溶解15min，再放入回旋式振荡器中振荡30min。

所有样品在离心机上以4000r/min离心10min，用注射器(6.11)抽取上层漂浮物和底部沉淀物之间的清液，先用一次性针头滤器(水系，规格25mm×0.45μm)(6.10)过滤，然后用一次性针头滤器(水系，规格13mm×0.22μm)(6.10)过滤。分取不同体积的过滤后清液，根据估计样品酶活浓度，用乙酸缓冲液(5.2)稀释，使试样溶液的酶活浓度保持在0.04U/mL左右，为待反应液。

建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。

8.3反应

取10mL试管按下面的反应顺序进行操作，标准空白加入2mL乙酸缓冲液(5.2)。在反应过程中，从加入底物溶液(5.3)开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，在恒温水浴(6.2)中37℃水解30min。

反应步骤及试剂、溶液用量见表6。其中样品空白反应测定顺序中，需要第7步和第4步互换，目的是先加入终止液使酶失活，然后加入底物，来测定空白吸光度。

表6反应步骤及试剂、溶液用量

8.4样品测定

反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机(6.7)上以4000rpm离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计(6.3)415nm波长处测定试样空白(A0)和试样溶液(A)的吸光值，A-A0为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。

9结果计算和表示

9.1结果计算

试样中植酸酶活性以X表示，单位为酶活性单位每克(U/g)或酶活性单位每毫升(U/mL)，按式(1)计算

式中：

X——试样中植酸酶的活性，单位为酶活性单位每克(U/g)

y──根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的无机磷的量，单位为微摩尔(μmol)；

t──酶解反应时间，单位为分钟(min)。

n──试样的稀释倍数；

m──试样的量，单位为克(g)。

9.2结果表示

两个平行试样的测定结果用算术平均值表示，加酶饲料样品保留三位有效数字。

9.3重复性

同一样品两个平行测定值的相对偏差，添加植酸酶的各种饲料样品不大于15％。

根据样品植酸酶活性的不同，建议称样量见下表：

表7建议称样量

第二部分，制粒过程中植酸酶的酶活存留率的测定方法。

1.试验制粒条件：

根据实际制粒要求，可选择一定的饲料配方、蒸汽压力、调质时间、调质温度、制粒温度、压缩比等制粒条件。调质温度和制粒温度以经校准的留点温度计(测定范围0-150℃)测定为准。

2.试验设备：

2.1饲料制粒成套设备

2.2低温粉碎机

2.3留点温度计(测定范围0-150℃)

3.测定步骤：

3.1空白制粒后补加植酸酶样的制取和酶活测定

3.1.1按照配方要求(除去植酸酶)，粉碎、称量、混合各种原料，按照“1.试验制粒条件”制粒，然后在饲料包装阶段，根据该制粒机情况，弃去制粒开始不稳定阶段的颗粒饲料，和因连续生产可能混合有其他试验料的颗粒饲料，每打包3袋(40kg/袋)饲料取一份样品(重量≥600g)，连续取8份样品。

3.1.2每份样品混匀后，分别使用低温粉碎机间歇式粉碎至全部通过0.45mm标准筛，再次混匀。

3.1.3每份样品分别称量500g，按照配方设计的酶活要求添加待测植酸酶，并混匀。待测植酸酶添加前要求首先与20g拟混合的饲料样品预混合。

3.1.4测定各份添加了待测植酸酶的饲料样品的酶活和水分含量，算出8份样品的平均酶活A(U/g)和平均水分含量B(％)，然后计算空白制粒后补加植酸酶样的绝干样品酶活含量C。

绝干样品酶活含量C计算公式为：C＝A/(1-B)

3.2成品颗粒饲料样的制备和酶活测定

3.2.1按照配方要求，粉碎、称量、混合各种原料，同时按照配方设计酶活要求添加待测植酸酶，然后按照“1.试验制粒条件”制粒，然后在饲料包装阶段，根据该制粒机情况，弃去制粒开始不稳定阶段的颗粒饲料，和因连续生产可能混合有其他试验料的颗粒饲料，每打包3袋(40kg/袋)饲料取一份样品(重量≥600g)，连续取8份样品。

3.2.2每份样品混匀后，分别使用低温粉碎机间歇式粉碎至通过0.45mm标准筛，再次混匀。

3.2.3测定每份植酸酶样品的酶活和水分含量，算出平均酶活D(U/g)和平均水分含量E(％)，然后计算出绝干样品酶活含量F，计算公式为：F＝D/(1-E)

3.3待测植酸酶制粒酶活存留率(％)的计算：

待测植酸酶存留率(％)＝F/C×100％

3.4用留点温度计测定实际制粒温度

留点温度计指当测定温度达到最高值，然后开始下降后，其水银面能留在最高值，从而可以读取最高温度值的温度计。

制粒设备一般都有调质温度仪表来记录制粒温度，但该温度实际只是调质器末端湿粉料和蒸汽的混合物料温度，并非实际制粒温度。本发明可以测定两个相关制粒温度

3.4.1调质后湿粉料温度

是在调制后湿粉料出调制器后、未进入制粒仓阶段，用保温桶接料，立即使用留点温度计测定调制后湿粉料的温度，可以更准确的测定调制后湿粉料的最高温度，该最高温度就是我们一般所称的制粒温度。本发明所指的制粒温度也指该温度。

3.4.2制粒仓制粒温度

是在颗粒饲料刚出制粒仓阶段，用保温桶接料，立即使用留点温度计测定颗粒料的温度，可以更准确的测定颗粒离开制粒仓的最高温度，该最高温度就是制粒仓制粒温度，一般比调制后湿粉料高5-10℃。不同室温、不同环膜等条件下，会有较大变化。其高低对植酸酶酶活的影响很大。

有益效果

本发明方法与现有技术相比，改进如下：一是对GB/T 18634—2009饲用植酸酶活性的测定分光光度法进行了重要改进，二是对测定中待测植酸酶的实际制粒过程做了重要改进。

具体如下：

一、对待测植酸酶的酶活测定方法进行改进：

将GB/T 18634—2009饲用植酸酶活性的测定分光光度法修改为低酶活饲料中饲用植酸酶活性的测定方法：

1.仪器和设备调整：

新增对分光光度计的吸光度最大显示范围达到-0.301-4.000A，大幅度提高仪器对光的敏感度。

不同的分光光度计，其吸光度测定范围差别很大。如普通的752N分光光度计的吸光度最大显示范围是0-1.999A。目前，配合饲料的植酸酶酶活一般在0.5-1U/g左右，为保证最终反应体系中酶活浓度在0.008U/mL左右，检测时配合饲料的称样量高达5-10g左右，待侧样的空白吸光值很高，最高达到3A左右，超出了普通的分光光度计的测定范围。改进后的方法中，分光光度计的吸光度最大显示范围要求-0.310-4.000A，即使当透光率只有0.01％时，其仍然可以比较准确的测定吸光值。

2.试剂和材料调整：

不再使用和配制原测定方法中的乙酸缓冲液(1)，只使用现有测定方法中的乙酸缓冲液(2)。

原缓冲液(1)主要是用来稀释提取后酶液的。由于配合饲料中含有大量容易使植酸酶失活的物质，特别是在液体状态中更容易使植酸酶失活，为了在整个测定过程中更好的保护植酸酶活性，本发明用缓冲液(2)完全替代缓冲液(1)。缓冲液(2)中含有的牛血清蛋白等可以更好的保护植酸酶活性。

3.标准曲线调整：

105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾称样量从原来0.6804g调整为0.3402g；容量瓶从100mL调整为500mL；乙酸缓冲液只使用原来方法中的乙酸缓冲液(2)，不再使用原来方法中的乙酸缓冲液(1)；按新的反应步骤反应测定；增加一个标准序号，稀释量0.5mL→0.5mL，反应体系中缓冲稀释液的无机磷浓度量5.0μmol/mL

4.试样溶液的制备的调整

比现有测定方法增加过滤步骤，以便除去试验溶液中漂浮的杂质。

配合饲料样品经缓冲液(2)提取后，饲料中含有的植物油等漂浮于离心上清液表层，所以要在离心后的油状漂浮层和沉淀物之间取清液。同时，即使经过4000转/分钟离心10分钟，配合饲料中有仍然有许多微粒悬浮于上清缓冲液中，所以采用一次性针头滤器(水系，两种规格25mm×0.45μm和13mm×0.22μm)过滤上清液，保证待反应液的澄清度，提高检测结果的准确性。

5.反应调整：

去掉现有测定方法中反应顺序中的步骤1“加乙酸缓冲液(5.2)”，同时原步骤2“加入待反应液0.2mL”改为“加入待反应液2mL”。

本发明将现有测定方法“8.3反应”步骤的第一步：

修改为：

反应顺序	样品、标准	样品空白(标准空白)
			1.加入待反应液	2mL	2mL

当现有测定方法“8.2.2加酶饲料样品中酶的提取”步骤中，当稀释液酶活浓度达到要求的0.4U/mL左右，其在“8.3反应”的最终反应体系10mL(1.8mL缓冲液(1)；0.2mL待反应液；底物溶液4mL；终止及显色液4mL)酶活性浓度是0.008U/mL。

采用本发明改进后的新方法，当检测低酶活的配合饲料样品(0.5U/g)时，称样量10g用100mL乙酸缓冲液(2)提取后，稀释液浓度达到0.05U/g，其在“8.3反应”的最终反应体系10mL(2mL待反应液；底物溶液4mL；终止及显色液4mL)酶活性浓度是0.01U/mL，接近0.008U/mL，保证了比色时合理的酶活性浓度，大大提高了检测结果的准确性。

二、对测定待测植酸酶的实际制粒过程的重要改进

1.采用留点温度计测定制粒实际温度

现有测定方法一般采用制粒设备的调质温度仪表来记录制粒温度，但该温度实际只是调质器末端湿粉料和蒸汽的混合物料温度，并非实际制粒温度。本发明可以准确测定调质后湿料、制粒仓颗粒饲料的最高温度，从而可以更准确的评价待测植酸酶的耐温性能。

2.采用空白制粒后补加植酸酶的方式测定调质前粉料酶活

因为制粒前后植酸酶检出率的明显差异，导致按照现有测定方法不能准确测定植酸酶的耐温性。本发明通过未添加植酸酶的粉状饲料制粒(称为空白制粒)后再添加植酸酶，然后同一配方粉料先添加植酸酶后制粒，最后比较两种植酸酶添加方式酶活含量的差异，就可以很好的消除制粒前后酶活检出率差异，能够准确反映实际制粒的植酸酶存留率(％)。

3.略去检测内源植酸酶步骤。

配方原料所含的内源植酸酶由于耐温性差，在制粒后都全部失去酶活，该方法也省去了检测内源植酸酶这一步骤。本发明的措施，表现为对分光光度计灵敏度的要求；有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度，且吸光度最大显示范围达到-0.301-4.000A。

本发明一是提出了采用留点温度计准确测定制粒温度，从而准确反映制粒温度，从而更准确评估植酸酶的耐温抗逆性，二是提出不添加外源植酸酶情况下制粒，从而消除制粒前后因饲料成分变化导致的植酸酶酶活检测差异，同时也免除了对内源植酸酶的检测步骤。同时，本发明明确了所有缓冲液中添加保护植酸酶活性的牛血清蛋白等物质，同时首次提出采用一次性针头滤器消除反应液系列中不溶性颗粒物的措施。

本发明提出了对分光光度计灵敏度的要求，保证了检测低酶活饲料中低吸光度情况下的准确测定，同时也完整提出了对饲料制粒前后植酸酶检测和存留率的系列测定方法，同时提出了采用留点温度计准确测定制粒温度的措施。保证了最终检测结果的准确性，为植酸酶耐温抗逆性能的评价提供了可靠的依据。

具体实施方式

实施例1

通过实际制粒测定某种耐高温植酸酶样品的耐温抗逆性能。

1.试验材料和设备：

1.1待测植酸酶样品(规格5000U/g，国内市场购买)2000g；

1.2牧羊饲料加工机组，型号MVZL600；

1.3留点温度计(0-150℃)；

1.4低温粉碎机，型号YQ50-1；

1.5分光光度计，型号UV759，吸光度显示范围-0.301-4.000A；

1.6超声波溶解器，型号KQ-100B；

1.7回旋振荡器，MVS-1型；

1.8一次性针头滤器(水系，两种规格25mm×0.45μm和13mm×0.22μm)等。

2.试验条件：

采用中大猪(50kg-出栏)配合饲料配方(玉米48％，小麦20％，次粉17％，豆粕12％，石粉1.1％，磷酸氢钙0.6％，盐0.3％，预混料1％)，每吨配合饲料添加360g待测植酸酶(规格5000U/g)；制粒条件：环模压缩比10:1，调质温度75℃，调质时间20-30s，制粒仓温度86℃，蒸汽压力0.25MPa。

注：温度以经校准的留点温度计测定为准。

3.试验步骤：

3.1空白制粒后补加植酸酶样的制取和酶活测定

3.1.1按照配合饲料配方(不添加植酸酶)要求，粉碎、称量、混合各种原料，配制3吨配合饲料；然后根据试验要求的制粒条件制粒；在饲料包装阶段，弃去制粒开始不稳定阶段生产的2吨颗粒饲料后，每打包3袋饲料(40kg/吨)取一份样品(重量≥600g)，连续取8份样品。

3.1.2每份样品分别混匀后，使用低温粉碎机间歇式粉碎至通过0.45mm标准筛，再次混匀。

3.1.3每份混匀样品取500克，分别添加待测耐高温植酸酶样品0.18g混匀，加入的待测植酸酶要求先经过20g样品的预混合。

3.1.4分别测定8份样品的酶活和水分含量，算出酶活平均值A(U/g)和水分平均值B(％)，然后计算绝干样品酶活平均含量C，计算公式为：C＝A/(1-B)。

酶活测定按照本发明提供的“低酶活饲料中饲用植酸酶活性的测定方法”。水分测定按照GB、GB/T 6435-2006饲料中水分和其他挥发性物质的测定。算出8份样品酶活的和(U/g)，然后除以8，即酶活平均值A。算出8份样品水分含量的和(％)，然后除以8，即水分平均值B。

3.2成品颗粒饲料样的制备和酶活测定

3.2.1按照配合饲料配方(添加植酸酶)要求，粉碎、称量、混合各种原料，配制3吨配合饲料，同时每吨添加360g待测植酸酶，然后按照试验要求的制粒条件制粒；在饲料包装阶段，弃去制粒开始不稳定阶段生产的颗粒饲料2吨后，每打包3袋饲料取一份样品(重量≥600g)，连续取8份样品。

3.2.2每份样品分别混匀后，使用低温粉碎机间歇式粉碎至通过0.45mm标准筛，再次混匀；

3.2.3分别测定每份样品的酶活和水分含量，算出酶活平均值D(U/g)和水分含量平均值E(％)，然后计算绝干样品酶活含量F，计算公式为：F＝D/(1-E)。

酶活测定按照本发明提供的“低酶活饲料中饲用植酸酶活性的测定方法”。按照GB、GB/T6435-2006饲料中水分和其他挥发性物质的测定。算出8份样品酶活的和(U/g)，然后除以8，即酶活平均值D。算出8份样品水分含量的和(％)，然后除以8，即水分平均值E。

3.3植酸酶存留率(％)计算：

植酸酶存留率(％)＝绝干样品酶活含量F/绝干样品酶活含量C×100％

表8对同一植酸酶样品的耐温抗逆性测定结果

可以看出，本实施例的平行取样变异系数小于10％，各平行取样测定值之间稳定性很好。

实施例2通过实际制粒对同种耐高温植酸酶样品多次测定耐温抗逆性能。

1.试验材料和设备：

1.1待测植酸酶样品(规格5000U/g，国内市场购买)2000g；

1.2牧羊饲料加工机组，型号MVZL600；

1.3留点温度计(0-150℃)；

1.4低温粉碎机，型号YQ50-1；

1.5分光光度计，型号UV759，吸光度显示范围-0.301-4.000A；

1.6超声波溶解器，型号KQ-100B；

1.7回旋振荡器，MVS-1型；

1.8一次性针头滤器(水系，两种规格25mm×0.45μm和13mm×0.22μm)等。

2.试验条件：

采用中大猪(50kg-出栏)配合饲料配方(玉米48％，小麦20％，次粉17％，豆粕12％，石粉1.1％，磷酸氢钙0.6％，盐0.3％，预混料1％)，每吨配合饲料添加360g待测植酸酶(规格5000U/g)；制粒条件：环模压缩比10:1，调质温度75℃，调质时间20-30s，制粒仓温度86℃，蒸汽压力0.25MPa。

注：温度以经校准的留点温度计测定为准。

3.试验方法：

3.1空白制粒后补加植酸酶样的制取和酶活测定

3.1.1按照配合饲料配方(不添加植酸酶)要求，粉碎、称量、混合各种原料，配制3吨配合饲料；然后根据试验要求的制粒条件制粒；在饲料包装阶段，弃去制粒开始不稳定阶段生产的2吨颗粒饲料后，每打包3袋饲料(40kg/吨)取一份样品(重量≥600g)，连续取8份样品。

3.1.2每份样品分别混匀后，使用低温粉碎机间歇式粉碎至通过0.45mm标准筛，再次混匀。

3.1.3每份样品各添加待测耐高温植酸酶样品0.18g混匀，加入的植酸酶要求先经过20g样品的预混合。

3.1.4分别测定8份样品的酶活和水分含量，算出酶活平均值A(U/g)和水分平均值B(％)，然后计算绝干样品酶活平均含量C，计算公式为：C＝A/(1-B)。

样品酶活和水分含量如何测定，以及酶活平均值A和水分平均值B的计算同实施例1。

3.2成品颗粒饲料样的制备和酶活测定

3.2.1按照配合饲料配方(添加植酸酶)要求，粉碎、称量、混合各种原料，配制3吨配合饲料，同时每吨添加360g待耐高温植酸酶，然后按照试验要求的制粒条件制粒；在饲料包装阶段，弃去制粒开始不稳定阶段生产的颗粒饲料2吨后，每打包3袋饲料取一份样品(重量≥600g)，连续取8份样品。

3.2.2每份样品分别混匀后，使用低温粉碎机间歇式粉碎至通过0.45mm标准筛，再次混匀。

3.2.3分别测定每份样品的酶活和水分含量，算出酶活平均值D(U/g)和水分含量平均值E(％)，然后计算绝干样品酶活含量F，计算公式为：F＝D/(1-E)。

样品酶活和水分含量如何测定，以及酶活平均值A和水分平均值B的计算同实施例1。

3.3植酸酶存留率(％)计算：

植酸酶存留率(％)＝绝干样品酶活含量F/绝干样品酶活含量C×100％

3.4对该耐高温植酸酶按照以上步骤重复测定耐温抗逆性3次。结果如下

表9对同一植酸酶样品多次耐温抗逆性测定结果

可以看出，经3次重复测定，测定结果无明显差异，该方法测定的结果具有很好的再现性。

实施例3通过实际制粒对多种耐高温植酸酶样品进行耐温抗逆性能测定。

1.试验材料和设备：

1.1待测植酸酶样品5种(规格5000U/g，国内、国外市场购买)各2000g；

1.2牧羊饲料加工机组，型号MVZL600；

1.3留点温度计(0-150℃)；

1.4低温粉碎机，型号YQ50-1；

1.5分光光度计，型号UV759，吸光度显示范围-0.301-4.000A；

1.6超声波溶解器，型号KQ-100B；

1.7回旋振荡器，MVS-1型；

1.8一次性针头滤器(水系，两种规格25mm×0.45μm和13mm×0.22μm)等。

2.试验条件

采用中大猪(50kg-出栏)配合饲料配方(玉米55％，小麦13％，次粉15％，豆粕9.75％，棉粕4％，石粉1.2％，磷酸氢钙0.7％，盐0.35％，预混料1％)，每吨配合饲料添加180g待测植酸酶(规格5000U/g)；制粒条件：环模压缩比10:1，调质温度80℃，调质时间20-30s，制粒仓温度92℃，蒸汽压力0.25MPa。

注：温度以经校准的留点温度计测定为准。

3.试验方法：

3.1防止取样交叉污染措施

因为本实施例要测定5种不同植酸酶产品。为保证试验加工条件的一致，采取连续生产方式完成。该成套设备调质前粉料储备仓储量2吨，颗粒饲料成品储备仓储量3吨，在连续生产中2种产品在储备仓中有混合现象。

为防止不同植酸酶加工时出现交叉污染现象，空白制粒(即不添加植酸酶)、添加5种不同植酸酶后制粒共计6种制粒产品，每种制粒产品分别生产5吨。并均在生产该种产品2吨后开始取样，每打包3袋饲料(40kg/吨)取1份样品，该种产品生产的最后2吨不取样，从而防止了取样交叉污染。

3.2空白制粒后补加植酸酶样的制取和酶活测定

3.2.1按照配合饲料配方(不添加植酸酶)要求，粉碎、称量、混合各种原料，配制5吨配合饲料；然后根据试验要求的制粒条件制粒；在饲料包装阶段，弃去开始阶段生产的2吨颗粒饲料后，每打包3袋饲料(40kg/吨)取一份样品(重量≥3000g)，连续取8份样品。

3.2.2每份样品分别混匀后，使用低温粉碎机间歇式粉碎至全部通过0.45mm标准筛，再次混匀；

3.2.3将3.2.2的每份样品(重量≥3000g)称取5份500g样品，每份500g样品分别添加5种待测植酸酶样品0.09g后混匀。加入的植酸酶要求先经过20g样品的预混合。

3.2.4分别测定该种待测植酸酶的8份样品的酶活和水分含量，算出酶活平均值A(U/g)和水分平均值B(％)，然后计算其绝干样品酶活平均含量C，计算公式为：C＝A/(1-B)。

具体测定方法和计算方法同实施实例1。

3.3成品颗粒饲料样的制备和酶活测定

3.3.1按照配合饲料配方(添加植酸酶)要求，粉碎、称量、混合各种原料，每种待测耐植酸酶要求分别配制5吨配合饲料，同时每吨添加180g待耐高温植酸酶，然后按照试验要求的制粒条件制粒；在饲料包装阶段，弃去制粒开始不稳定阶段生产的颗粒饲料2吨后，每打包3袋饲料取一份样品(重量≥600g)，连续取8份样品。

3.3.2每份样品分别混匀后，使用低温粉碎机间歇式粉碎至通过0.45mm标准筛，再次混匀。

3.3.3分别测定该种待测植酸酶每份样品的酶活和水分含量，算出酶活平均值D(U/g)和水分含量平均值E(％)，然后计算绝干样品酶活含量F，计算公式为：F＝D/(1-E)

具体测定方法和计算方法同实施实例1。

3.3.4分别计算每种待测植酸酶的制粒存留率，计算公式

植酸酶存留率(％)＝绝干样品酶活含量F/绝干样品酶活含量C×100％

表10对多种耐高温植酸酶样品的耐温抗逆性测定结果

结果表明，利用该评价方法能够较好区分不同植酸酶产品的耐温抗逆性能。

Claims (8)

1.一种通过饲料实际制粒评价植酸酶耐温抗逆性能的方法，包括以下步骤：

1)空白制粒后补加植酸酶样的制备和酶活测定：不添加植酸酶，在按照饲料配方要求制粒和取样之后，再混合植酸酶得到待测样品，测定待测样品的酶活和水分含量，算出酶活平均值A，单位为：U/g和水分平均值B，单位为：质量百分比％，然后计算绝干样品酶活平均含量C，计算公式为：C＝A/(1-B)；

2)成品颗粒饲料样的制备和酶活测定：按照饲料配方要求进行制粒和取样以得到待测样品，测定待测样品的酶活和水分含量，算出酶活平均值D，单位为：U/g和水分含量平均值E，单位为：质量百分比％，然后计算绝干样品酶活含量F，计算公式为：F＝D/(1-E)；

植酸酶存留率(％)计算：植酸酶存留率(％)＝绝干样品酶活含量F/绝干样品酶活含量C×100％；

酶活测定方法为分光光度法，样品检出范围为0.1-50U/g；在415nm下测定吸光度，且吸光度显示范围-0.301A-4.000A。

2.根据权利要求1所述的通过饲料实际制粒评价植酸酶耐温抗逆性能的方法，其特征在于，酶活测定方法，包括如下步骤：

(1)绘制标准曲线

准确称取0.3402g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于500mL容量瓶中，用乙酸缓冲液溶解，并定容至500mL，浓度为5.0μmol/mL，用乙酸缓冲液分别稀释为：5μmol/mL、2.5μmol/mL、1.25μmol/mL、0.625μmol/mL、0.3125μmol/mL、0.15625μmol/mL不同浓度基准待反应液，与待测试样一起反应测定；以吸光值为横坐标，反应体系中的无机磷浓度量，单位：μmol/mL为纵坐标，列出直线回归方程：y＝ax+b；

(2)试样溶液的制备：

按照建议称样量，称取添加植酸酶的饲料试样两份，精确至0.0001g，置于200mL刻度锥形瓶中，加入乙酸缓冲液100.0mL，在超声波溶解器上超声溶解15min，再放入回旋式振荡器中振荡30min；然后在离心机上以4000r/min离心10min，用注射器抽取上层漂浮物和底部沉淀物之间的清液，先用规格25mm×0.45μm的一次性水系针头滤器过滤，然后用规格13mm×0.22μm的一次性水系针头滤器过滤；分取不同体积的过滤后清液，根据估计样品酶活浓度，用乙酸缓冲液稀释，使试样溶液的酶活浓度保持在0.04U/mL左右，为待反应液；

所述建议称样量

(3)反应

取10mL试管按下面的反应顺序进行操作，标准空白加入2mL乙酸缓冲液；在反应过程中，从加入底物溶液开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要保持一致，在恒温水浴中37℃水解30min；

反应步骤及试剂、溶液用量见下表；其中样品空白反应测定顺序中，需要第7步和第4步互换；

反应步骤及试剂、溶液用量

反应顺序 样品、标准 样品空白 1.加入待反应液 2mL 2mL 2.混合 √ √ 3.37℃预热5min √ √ 4.依次加入底物溶液 4mL 4mL 5.混合 √ √ 6. 37℃水解30min √ √ 7.依次加入酶反应终止及显色液 4mL 4mL 8.混合 √ √ 总体积 10mL 10mL

(4)样品测定

反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4000rpm离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定试样空白A0和试样溶液A的吸光值，A-A0为实测吸光值；用直线回归方程计算植酸酶的活性；

(5)结果计算

试样中植酸酶活性以X表示，单位为酶活性单位：U/g，按式(1)计算

式中：

X——试样中植酸酶的活性，单位为酶活性单位：U/g；

y──根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的无机磷的量，单位为：μmol；

t──酶解反应时间，单位为：min；

n──试样的稀释倍数；

m──试样的量，单位为：g；

所述乙酸缓冲液，c(CH₃COONa·3H₂O)＝0.25mol/L：称取20.52g无水乙酸钠，0.5g曲拉通X-100，0.5g牛血清白蛋白于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.5±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放2个月有效；

所述底物溶液，c(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂)＝7.5mmol/L：称取0.69g肌醇六磷酸钠，所述肌醇六磷酸钠分子式为C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂，分子量为923.8，纯度为95％，精确至0.1mg，置于100ml烧杯中，用约80ml乙酸缓冲液溶解，用冰乙酸调节pH至5.5±0.01，转移至100mL容量瓶中，并用乙酸缓冲液定容至刻度，现用现配；

所述酶解反应终止及显色液：移取2份硝酸溶液，1份钼酸铵溶液，1份偏钒酸铵溶液混合后使用，现用现配；

所述硝酸溶液：1份浓硝酸+2份水；

所述钼酸铵溶液，100g/L：称取10g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O于50mL烧杯中加热溶解，必要时可微加热，再转移至100ml容量瓶中，加入25％浓度的氨水1.0mL，用水定容至刻度；所述氨水浓度为质量百分比；

所述偏钒酸铵溶液，2.35g/L：称取0.235g偏钒酸铵(NH₄VO₃)于50mL烧杯中，加入2mL硝酸溶液及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再转移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度；避光条件下保存一周内有效。

3.根据权利要求1或2任一所述的通过饲料实际制粒评价植酸酶耐温抗逆性能的方法，其特征在于，空白制粒后补加植酸酶样的制备和酶活测定包括如下步骤：

所述取样为：根据制粒机情况，弃去制粒开始不稳定阶段的颗粒饲料，和因连续生产可能混合有其他试验料的颗粒饲料，规格为40kg/袋的饲料，每打包3袋，取一份重量≥600g的样品，连续取8份样品；

每份样品混匀后，分别使用低温粉碎机间歇式粉碎至全部通过0.45mm标准筛，再次混匀；

分别称量500g，按照配方设计的酶活要求添加待测植酸酶，并混匀；待测植酸酶添加前要求首先与20g拟混合的饲料样品预混合；

测定各份添加了待测植酸酶的饲料样品的酶活和水分含量，算出8份样品的平均酶活A，单位为：U/g和平均水分含量B，单位为质量百分比％，然后计算空白制粒后补加植酸酶样的绝干样品酶活含量C；

绝干样品酶活含量C计算公式为：C＝A/(1-B)。

4.根据权利要求1或2任一所述的通过饲料实际制粒评价植酸酶耐温抗逆性能的方法，其特征在于，成品颗粒饲料样的制备和酶活测定包括如下步骤：

所述取样为：根据制粒机情况，弃去制粒开始不稳定阶段的颗粒饲料，和因连续生产可能混合有其他试验料的颗粒饲料，规格为40kg/袋的饲料，每打包3袋，取一份重量≥600g的样品，连续取8份样品；

每份样品混匀后，分别使用低温粉碎机间歇式粉碎至全部通过0.45mm标准筛，再次混匀；

测定每份植酸酶样品的酶活和水分含量，算出平均酶活D，单位为U/g和平均水分含量E，单位为质量百分比％，然后计算出绝干样品酶活含量F，计算公式为：F＝D/(1-E)。

5.根据权利要求1或2任一所述的通过饲料实际制粒评价植酸酶耐温抗逆性能的方法，其特征在于，制粒过程中采用留点温度计测定温度。

6.根据权利要求5所述的通过饲料实际制粒评价植酸酶耐温抗逆性能的方法，其特征在于，制粒过程中测定制粒温度和制粒仓制粒温度。

7.根据权利要求6所述的通过饲料实际制粒评价植酸酶耐温抗逆性能的方法，其特征在于，测定制粒温度是在湿粉料出调制器后、未进入制粒仓阶段，用保温桶接料，立即使用留点温度计测定调制后湿粉料的温度。

8.根据权利要求7所述的通过饲料实际制粒评价植酸酶耐温抗逆性能的方法，其特征在于，所述测定制粒仓制粒温度是在颗粒饲料刚出制粒仓阶段，用保温桶接料，立即使用留点温度计测定颗粒料的温度。