CN102428367A - 测定肌醇六磷酸（ihp）的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种测定可注射进人或动物中之产品或该产品之级分中的肌醇六磷酸(inositol hexaphosphate，IHP)的方法，在该方法中将金属化合物加至所述产品的样品或级分中，随后检测所述金属化合物与所存在之IHP的络合反应，由此测定所述产品或其级分中存在的IHP。本发明使得可以在悬液或溶液中(特别是在红细胞悬液的不同区室中)测定IHP。

Description

测定肌醇六磷酸(IHP)的方法
本发明涉及测定可注射进人或动物中之产品或该产品之级分(特别是红细胞悬液)中的肌醇六磷酸(或IHP)的方法。
IHP是血红蛋白的强效变构效应物。因此，它可用于降低血红蛋白与氧的亲和力并使组织中的氧释放增加。在癌症学(特别是缺氧肿瘤(hypoxic tumor))中，它可用作放射治疗辅药。WO-A-2006/016247描述了将IHP包封于作为生物运载体的红细胞中。
包封IHP之红细胞的临床应用需要知道所存在的IHP量，从而能够根据处方剂量确定所要输注的悬液体积。此外，由于IHP是一种金属螯合剂(例如钙螯合剂)，如果以游离形式施用可能会潜在地具有有害作用，因此测定最终药物产品中存在的细胞外IHP也是很有必要的。
文献中已描述了多种测定IHP的方法。这些方法大多是为了测定食物提取物中存在的IHP而开发的。根据方法是直接的、间接的或者酶促的，这些方法可分为3类。
在直接法中，特别地涉及质谱法、核磁共振法、电导分析法和折射分析法，这些方法都需要待分析的样品是高纯度的，因而需要很长的实施时间。
间接法是基于IHP与金属离子的络合能力，可以通过比色法或荧光分析法对形成的[金属离子-IHP]络合物进行测量。Kenan Dost，OzgeTokul(Analytica Chimica Acta 558(2006)：22-27)描述了间接测定小麦和基于小麦之产品中的IHP的方法。该方法是基于存在IHP时无色络合物[Fe(III)-肌醇六磷酸]置换有色络合物[Fe(III)-硫氰酸盐]的反应。通过与UV-可见光分光光度检测仪偶联的高效液相色谱法(HPLC)进行读数。
还由Plaami等人(Journal of the association of official analyticalchemists，the association，Arlington，VA，US，1991，74，32-36)已知测定谷物中存在的肌醇六磷酸的方法。该公开的方法是基于用电感耦合等离子体原子发射光谱法(inductively coupled plasma atomic emissionspectrometry，ICP-AES)测定肌醇六磷酸中所含的磷。
还由Park等人(Butterworth，London，2006，17(9)，727-732)已知用于测定儿童食品中肌醇六磷酸之量的多种方法。所描述的方法之一是根据Latta和Eskin(J.Agric.Food.Chem.，1980，28，1315-1317)的分光光度法，其需要利用离子交换树脂进行色谱分析的步骤。根据Park等人测定肌醇六磷酸的最佳方法是AOAC法。
酶促法是基于利用称为“肌醇六磷酸酶”的酶使IHP水解；这些方法不适用于测量红细胞内的IHP。
文献中所描述的有关农产品中的测定方法不能直接转用到含有IHP之药物产品的情形中，特别是因为其组成存在显著差异。本文中的这些著述不应视为评价本发明之专利性的有力证据。
还可以在文献中找到涉及利用直接法测定红细胞中IHP的研究，这些直接法具有某些缺陷，使其不适用于药物产品生产的常规测定中。
S.Villa等人(Adv Exp Med Biol.1992；326：41-49)描述了通过HPLC测量红细胞中IHP的简便、可靠的方法。所提出的分析方法包括下列步骤：
●通过裂解掺有IHP的红细胞并用高氯酸提取来制备样品，
●制备流动相，并使HPLC柱平衡，
●使样品通过柱，
●通过折射分析法测量IHP的浓度。
但是，这种方法需要通过HPLC分离样品，因此其实施时间很长。需要指出的是，制备标定范围需要测定10个不同的IHP浓度，每个浓度测试数次；估计其持续时间可为6小时。此外，该方法的检出限(0.5mM)不足以对终产品中存在的细胞外IHP进行定量。该方法不能满足工业规模生产对测定快速性和灵敏度提出的要求。
B.Teisseire等人(J.Appl.Physiol.1985年6月；58(6)：1810-7)评估了向仔猪中输注入掺有IHP之红细胞的生理作用。该文章描述了一种测量红细胞中IHP的方法，其基于测定IHP掺入之前和之后细胞内磷酸盐的浓度。这两个浓度之间的差异是由IHP引起的。这种估计程度很大的方法不适用于对治疗用产品的红细胞中IHP进行测量。
Mosca等人(Adv Exp Med Biol.1992；326：19-26)和R.Nano等人(Adv Exp Med Biol.1992；326：35-39)描述了与B.Teisseire等人所描述相同的测定红细胞中IHP的方法，只是其中通过NMR测量磷酸盐浓度。除了缺少B.Teisseire方法已提及的精确性之外，该方法还存在与NMR设备相关的实施以及费用过高的难题。
本发明的第一目的是提供一种快速且可靠的测定方法。
本发明的第二目的是提供易于自动化的上述方法。
本发明的第三目的是提供一种能够满足ICH(InternationalConference on Harmonizaiton)制定之指导原则的手动或自动的上述方法。
因此，本发明的一个主题是测定可注射进人或动物中之产品或该产品之级分中的肌醇六磷酸(IHP)的方法，其中将金属化合物加至所述产品的样品或级分中，随后检测所述金属化合物与所存在之IHP的络合反应，由此测定产品或其级分中存在的IHP。
“可注射进入或动物中的产品”的表述意指可含有IHP作为活性成分或作为杂质的药物产品。本发明首先主要涉及测定产品或其级分中作为活性成分存在的IHP。术语“级分”是指可含有IHP之产品的一部分，并且其IHP含量应当是已知的。本发明特别地涉及测定由负责递送IHP之运载体的悬液或溶液形成的产品中的IHP。其可以是含有或包封有IHP的运载体，或者是通过任意键合(包括反离子)结合IHP的运载体。在一种重要的模式中，利用本发明之测定方法来测定运载体悬液中的总IHP，或者测定运载体外介质(特别是上清液或悬液液体)和载体之一或两者的级分中的IHP。优选地，其涉及运载体(例如脂质体、微球或纳米球、微囊或纳米囊、红细胞等)悬液。本发明还涉及在含有IHP运载体之产品的上清液中测定游离的IHP。
根据本发明的一个优选实施方案，所述络合产生络合物，其显色与初始金属化合物不同。可以对络合物相对于初始金属化合物的吸光度变化进行测量。根据一个有利的特征，通过分光光度法来检测吸光度的变化。
根据一个实施方案，试剂是有色的Fe(III)化合物。特别地，其是使得能够产生肌醇六磷酸络合物的金属化合物，具体可参考F Crea等人，2008，Coordination Chemistry Reviews 252，1108-1120。就试剂而言，可提及的是例如Fe(III)-硫氰酸盐和Fe(III)-5-磺基水杨酸(采用Fe(III)-磺基水杨酸盐溶液的形式)。在一个实施方案中，试剂是Fe(III)-硫氰酸盐。
在一个实施方案中，试剂是Fe(III)-磺基水杨酸盐。
根据一个实施方案，利用所述测定方法来测定红细胞悬液中的IHP。本发明特别地用于测定加载有IHP并旨在用于患者治疗的红细胞悬液中存在的IHP。利用该方法对细胞内IHP和/或细胞外IHP的总IHP进行测定。根据一个实施方案，利用该方法测定一定体积悬液中存在的IHP。此测定可用于根据患者处方的IHP剂量(同时考虑到细胞外IHP含量)来确定待施用的悬液量。根据另一实施方案，利用该方法测定上清液中存在的IHP。
用于测定总IHP的方法可特别地包括：
-在细胞外介质存在下使红细胞裂解，
-获得含有IHP但不含血红蛋白和细胞碎片的级分，
-将已知量的金属化合物加至该级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，
-测定总IHP含量。
用于测定红细胞内IHP的方法可特别地包括：
-去除细胞外介质，回收红细胞级分，
-使红细胞裂解，
-获得含有IHP但不含血红蛋白和细胞碎片的级分，
-将已知量的金属化合物加至该级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，
-测定红细胞内IHP含量。
用于测定细胞外IHP的方法可包括：
-回收细胞外级分，
-将已知量的金属化合物加至该细胞外级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，
-测定细胞外IHP含量。
类似步骤可用于任何其它类型含IHP的运载体(例如脂质体或微球)，还可用于测定含有与IHP结合之运载体的产品的上清液中的游离IHP。
如果联合测量同一红细胞悬液中的细胞外IHP和总IHP，则可从中推算出红细胞内的IHP含量。具体地使用下列等式：
Figure BDA0000105144690000051
根据一个特征，通过酸存在下使蛋白质沉淀的步骤去除血红蛋白。可使蛋白质(包括血红蛋白)沉淀的任何酸均可考虑用于进行该提取步骤。该步骤使得可以去除这些蛋白质和膜碎片，从而回收小分子(例如IHP)。其非限制性实例可包括：高氯酸、三氯乙酸、草酸、柠檬酸、硝酸、盐酸、硫酸和乳酸。特别适合的是盐酸。可通过离心回收含有IHP的级分。
根据本发明的一个特征，在加入Fe(III)显色试剂(Fe(III)-硫氰酸盐或Fe(III)-磺基水杨酸盐)之后，使待测样品孵育足以使所形成之Fe(III)-肌醇六磷酸络合物稳定的一段时间。这段时间很短，例如约5至约30分钟的时间即足够。这段时间可特别地为约10至约20分钟，通常为15分钟量级。优选地，在黑暗中进行孵育。
根据一个优选实施方案，Fe(III)-硫氰酸盐显色试剂具有下列特征：
-每毫升试剂中0.1～1μmol Fe(III)，特别地0.25～0.6μmol/ml，优选地0.3～0.4μmol/ml，
-过量的硫氰酸盐，特别地10～50μmol/ml，优选地20～40μmol/ml，更优选地30～40μmol/ml。
根据本发明的一个特征，Fe(III)-硫氰酸盐试剂包含0.25～0.6μmol的Fe(III)/ml以及20～40μmol的硫氰酸盐/ml。优选地，所述试剂包含0.3～0.4μmol的Fe(III)/ml以及30～40μmol的硫氰酸盐/ml。
根据一个优选实施方案，Fe(III)-磺基水杨酸盐显色试剂包含0.5～2μmol的Fe(III)/ml以及5～15μmol的水杨酸盐/ml。
所述试剂还包含水，并且特别地由酸溶液组成，特别地与沉淀过程中所使用的酸相同。
根据一个特征，试剂是Fe(III)和硫氰酸盐的盐酸溶液。
根据一个特征，试剂是Fe(III)和水杨酸盐的盐酸溶液。
根据一个特征，试剂中酸的浓度为0.01～0.2摩尔/升，优选地0.05～0.15摩尔/升。
根据一个实施方案，本发明包括基于IHP络合Fe(III)离子的能力来测定IHP的分光光度法。该方法基于置换反应，其间测定试剂中以有色络合物[Fe(III)-硫氰酸盐]或[Fe(III)-磺基水杨酸盐]形式存在的Fe(III)离子会与待测样品中存在的IHP形成新的无色络合物[Fe(III)-肌醇六磷酸]。由于[Fe(III)-硫氰酸盐]络合物的吸光峰值出现在460nm，因此测量OD460使得可以确定[Fe(III)-硫氰酸盐]的浓度，并且通过总结测定反应的等式从中推算出IHP的浓度。由于[Fe(III)-磺基水杨酸盐]络合物的吸光峰值出现在506nm，因此测定OD506使得可以确定[Fe(III)-磺基水杨酸盐]的浓度，并且通过总结测定反应的等式从中推算出IHP的浓度。
根据本发明的一个特征，临时制备[Fe(III)-硫氰酸盐]或[Fe(III)-磺基水杨酸盐]显色试剂。因此，所述测定方法可包括在将显色试剂加至待测样品或样品级分之前制备显色试剂的步骤。
有利地，Fe(III)-硫氰酸盐或Fe(III)-磺基水杨酸盐试剂在使用前不久(通常提前30分钟至1小时)制备，并且储存于黑暗中备用。
该方法可用于批量的包封有IHP之红细胞样品(在向患者施用前或者作为生产对照)。
可制备经裂解-重封(lysed-resealed)之红细胞(RBC-LR)的空白对照，从而能够消除与红细胞基质有关的背景噪声。
根据一个实施方案，所述方法包括制备IHP标定范围；优选地，该范围于测定当天制备。根据另一实施方案，使用将已知量的IHP加至样品等分试样中的方法来代替标定范围。
本发明的测定优选地适用于红细胞基质。IHP提取步骤使得可以特别地去除显色能够影响吸光度测量值的血红蛋白。使用经裂解-重封且随后与加载IHP之样品进行同样处理的红细胞作为空白对照加入，使得可以确定并消除红细胞的影响。测定试剂的选择以及简单分光光度计的使用使测定实现自动化、快速并且易于实施。因此，可利用自动生化仪器进行测定。本发明的方法不需要使用色谱(HPLC、离子交换色谱)，也不需使用NMR光谱。与现有技术相比，其使得测定的成本和实施时间大为减少。样品通过HPLC需要约15分钟，而利用分光光度计获取OD值仅需要几秒钟。这减少了针对每个测试样品所花费的时间，同时还减少了针对测定前必须进行之标定范围的每个点所花费的时间。样品的制备也不需要长的孵育步骤。因此，测定的总持续时间显著减少，这使得其适用于工业化规模的应用。
最后，使用所述方法可不产生任何危险性产品，例如通过选择针对蛋白质沉淀的酸来实现。
本发明的主题还包括使用由含有IHP的运载体(特别是脂质体、微囊、微球、红细胞等)悬液(特别是包封有IHP的红细胞悬液)形成的或者由与IHP结合之运载体的溶液形成的药物产品治疗患者的方法，其用于治疗可从这种治疗获益的病症，其包括下列步骤：
-获得或制备这样的悬液或溶液，特别是包封有IHP的红细胞悬液，
-取出此悬液样品或此溶液样品，
-利用本发明的测定方法测定样品中的IHP，
-基于浓度数据，参照患者处方剂量计算待施用的悬液或溶液(特别是红细胞悬液)的体积，
-向所述患者施用该体积。
以下通过非限制性实施例的实施方案以及参考附图，对本发明进行进一步详述。
图1是表示ΔOD作为IHP浓度之函数的标定线，其利用Fe(III)-硫氰酸盐试剂获得。
图2是表示ΔOD作为所加入之IHP浓度的函数的线，其根据计量添加法、利用Fe(III)-硫氰酸盐试剂获得。
图3是表示ΔOD作为IHP浓度之函数的标定线，其利用Fe(III)-磺基水杨酸盐试剂获得。
实施例1：试剂和化学溶液
制备氯化铁(III)溶液：将20mg氯化铁(III)溶于40ml蒸馏水中(0.5mg/ml)。
制备硫氰酸铵溶液：将200mg硫氰酸铵溶于40ml蒸馏水中(5mg/ml)。
使用前至少40分钟制备显色试剂，其组成为：1ml 0.5mg/ml的氯化铁(III)、5ml 5mg/ml的硫氰酸铵、0.9ml 1N的盐酸和2ml蒸馏水。
制备三氯乙酸TCA溶液(重量/体积)
18.75％溶液：3ml 6.1N的TCA(100％)+13ml蒸馏水
9.375％溶液：10ml 18.75％的TCA溶液+10ml蒸馏水
7.5％溶液：15ml 6.1N的TCA(100％)+185ml蒸馏水
24％溶液：6ml 6.1N的TCA(100％)+19ml蒸馏水
12％溶液：10ml 24％的TCA溶液+10ml蒸馏水
6％溶液：15ml 6.1N的TCA(100％)+235ml蒸馏水
制备IHP储液：对于1ml 45mM的溶液来说，所要称出的IHP十二钠盐的量X如下计算：X(g)＝415.719/(p×(100-H))，p是盐的纯度(％)，H是水含量(％)。用蒸馏水将终体积调至1ml。
将IHP包封入人红细胞的方法：通过低渗柱透析法将IHP(660g/mol)包封入人红细胞(RBC)中。将袋中的RBC用0.9％NaCl清洗3次。开始透析之前，在以17或20mM终浓度添加的IHP存在下使血细胞比容成为60％。针对低渗裂解缓冲液(以15ml/分钟的逆流)，以流速1.5ml/分钟对RBC进行透析。通过加入高渗溶液并于37℃孵育30分钟，使流出柱的经裂解RBC重封。用0.9％NaCl、0.2％葡萄糖清洗几次后，用储液(AS-3缓冲液)使RBC的血细胞比容成为50％。
实施例2：测定总RBC-IHP样品中以及细胞外介质中的IHP
1)待测样品的性质
为了测定细胞内IHP，对样品(RBC-IHP)中的总IHP以及上清液(细胞外介质)中的IHP含量进行测定。通过使RBC-IHP于4℃以1000g离心10分钟，获得上清液。待测样品还可以是IHP的水溶液，其不必进行任何提取。
标定范围的测定方法(外标法)
样品制备
RBC-IHP(50μl)和上清液(50μl)于-20℃冷冻30分钟。重新加热至环境温度后，用蒸馏水稀释样品，以裂解细胞，并在酸性条件下用三氯乙酸提取IHP。所用稀释根据样品性质而不同。可以使用多种浓度的三氯乙酸(TCA)溶液来制备样品。
如下表所示添加每种试剂：
Figure BDA0000105144690000091
接着使样品于4℃以15000g离心10分钟，并收集提取上清液，使其与显色试剂相接触。在与显色试剂混合前，对RBC-IHP进行进一步稀释(将75μl、7.5％的三氯乙酸与75μl提取上清液混合)。
制备IHP标定范围
制备1mM溶液
将20μl、45mM的IHP溶液(参见实施例1)与880μl、7.5％的三氯乙酸混合。
制备标准溶液：
IHP的终浓度(μM)   20   40   60   80   100   120
  1mM IHP的体积(μl)   20   40   60   80   100   120
7.5％三氯乙酸的体积(μl)   980   960   940   920   900   880
空白为7.5％的三氯乙酸。
光度计检测
对于光度计检测来说，将300μl显色试剂(如实施例1中所制备)加至150μl的每份提取上清液和标准溶液以及空白对照中。振荡并于黑暗中孵育15分钟后，将溶液置于10mm比色皿中，并在460nm下测量吸光度。对于每个浓度(20～120μM)，测定Δ吸光度：ΔOD＝OD空白-OD标准。绘制ΔOD/[IHP]标定曲线，计算线性回归参数，并利用所述参数以及通过ΔOD＝OD空白-OD样品测量值来确定提取上清液中存在的IHP量。对于RBC-IHP来说，通过对经同样透析处理并且在同样条件下将血细胞比容调整为50％的红细胞(RBC-LR)进行测定，来评估由红细胞基质的干扰产生的噪声。对于RBC-IHP上清液来说，未观察到对测定的干扰。
2)通过计量添加的测定方法
该方法使得可以不受红细胞基质的影响，因而测定RBC-IHP中含有的IHP时避免了制备RBC-LR。将含有X mM IHP的待测样品分为50μl体积的等份，并在红细胞裂解步骤期间加入已知浓度(C1、C2、C3、C4、C5等)的IHP(950μl)。向每管中加入18.75％的TCA(333μl)并随后以15000g离心10分钟使得可以回收上清液中的IHP。对于光度计测定来说，将300μl显色试剂(如实施例1中制备)加至150μl的每份提取上清液中。通过将300μl显色试剂加至150μl、6％的TCA中来制备参照管。振荡并在黑暗中孵育15分钟后，将溶液置于10mm比色皿中，并在460nm下测量吸光度。对于每个点来说，测定Δ吸光度：ΔOD＝OD参照-OD样品。绘制ΔOD/所加入之[IHP]的标定曲线。如果曲线不是线性直线，则将最高的浓度点在7.5％三氯乙酸中稀释并进行重新测定。直线与X轴之间的交叉点(绝对值)直接显示初始样品中所含IHP的数值X。
实施例3：计算红细胞中包封之IHP的量
如实施例2中测定RBC-IHP中以及细胞外介质中IHP的浓度。为了计算细胞内IHP，使用下列等式：
Figure BDA0000105144690000101
实施例4：方法有效性的优化和表征
1)显色试剂的稳定性
如实施例1中所述制备显色试剂。通过在460nm下用光度计测量300分钟，对其稳定性进行研究。结果显示，优选在使用前至少40分钟制备显色试剂，之后其稳定至少4小时，这使得可以进行所有分析。
2)范围的线性
在20～120μM IHP(使其与显色试剂接触之前的浓度)范围内对IHP范围的线性进行研究。使150μl的每个范围点(如实施例2中所制备地)与300μl显色试剂混合，并如实施例2中所述对范围进行作图。Fisher检验显示，标定范围是有效的。
3)样品提取条件的优化
对利用2.5倍体积蒸馏水和3.5倍体积9.375％的TCA的常规提取进行优化，以获得经优化的重叠百分比。使用含有不同IHP含量的较大体积非渗透性水溶液(19倍体积)模拟不同IHP浓度之RCB+IHP悬液的提取。使用18.75％的浓TCA，其终浓度为7.5％，这使得不必对样品进行过度稀释，并避免了测定灵敏度损失。根据实施例2中描述的方案对样品进行测定。两种提取方法比较的结果列于下文中。
Figure BDA0000105144690000121
4)所述方法的适用性(robustness)
在不同温度(6℃、22℃和35℃)下对样品进行测定。发现该方法适用于温度变化。
5)定量和检出限
根据ICH的建议进行定量和确定检出限。为此，制备8个空白对照(7.5％TCA)并在其线性范围(20～120μM)内对范围进行研究。与显色试剂混合后，如实施例2所描述地利用分光光度计对空白对照和范围点进行分析。计算获得之OD的标准差，以能够根据下列ICH公式确定LD和LQ：
Figure BDA0000105144690000122
其中σ＝基于空白对照的标准差
P＝标定线的斜率
所获得的范围具有0.0045uOD/μM的斜率(uOD＝OD单位)。由这种方法获得之结果的标准差是0.00477uOD；计算后，范围的LD和LQ值分别为3.5μM和10.6μM。
将方法中的稀释效应考虑在内，校正后获得下列数值：
-上清液LD＝25μM；LQ＝74μM
-总LD＝94μM；LQ＝283μM。
实施例5
1)利用具有标定范围并且通过测定RBC-LR基质消除与红细胞基质有关之噪声的方法的结果实例
利用下表中的数值绘制IHP标定直线(图1)：
Figure BDA0000105144690000131
计算样品中的IHP：
Figure BDA0000105144690000141
2)利用计量添加法的结果实例
将待测样品分为50μl体积的等份，并如实施例2中详细描述地(计量添加法)对其进行处理。添加物列表如下：
Figure BDA0000105144690000142
所获得的点(下表)使得可以绘制图2的直线。
Figure BDA0000105144690000143
确定点y＝0处的浓度，其显示初始样品中[IHP]的绝对值＝1.72mM。其利用等式y＝1.599x+0.2756计算得到。
3)计量添加法与标定范围法的比较
Figure BDA0000105144690000151
实施例6：测定的自动化
利用标定范围进行测定的实例
利用生化仪器(MaxMat)使对包封IHP之RBC的测定部分自动化。如实施例1制备显色试剂(试剂)、7.5％TCA(稀释剂)和1mM IHP储液(标准品)，接着将其置于自动化设备的平台上。根据实施例2中描述的方法手动制备待测样品。将从每个待测样品提取的上清液移至1.5ml管中并置于平台上。
正确地设置所述测定法的参数：
-正向模式(positive mode)
-负向线性回归模式(negative linear regression mode)
-30个循环
循环1：取出75μl所制备的样品，并在460nm下读取OD值
循环2：加入150μl显色试剂
循环30：在460nm下读取OD值
当测定开始时，自动化设备用7.5％TCA制备标定范围的稀释物(1/8.3、1/10、1/12、1/15、1/25、1/50)，接着制备与显色试剂的多种混合物。当完成30个循环时，自动化设备显示范围点和多个样品在460nm下的OD值。接着将结果转送至与实施例3一致的excel计算表格中。一个或多个样品的测定在少于60分钟内进行。
针对血细胞比容为50％的RBC-IHP和上清液，对几个样品进行手动和自动化测定所获得的结果是相当的(％CV＜10％)(见下表)。
Figure BDA0000105144690000161
实施例7：以Fe(III)-磺基水杨酸盐作为配体的测定以及与Fe(III)-硫氰酸 盐的比较
a)方法描述
制备氯化铁(III)溶液：将49mg氯化铁(III)溶于21.2ml蒸馏水中(2.31mg/ml)。
制备5-磺基水杨酸溶液：将98.6mg磺基水杨酸溶于19.7ml蒸馏水中(5mg/ml)。
制备盐酸溶液：将500μl1N的盐酸溶于9.5ml蒸馏水中(0.05N)。
显色试剂由1ml 2.31mg/ml的氯化铁(III)溶液、5ml 5mg/ml的磺基水杨酸溶液、0.9ml 0.05N的盐酸溶液和2ml蒸馏水组成。
根据上述方法制备Fe(III)-硫氰酸盐。
样品制备
RBS-IHP(50μl)和上清液(50μl)于-20℃冷冻30分钟。重新加热至环境温度后，用蒸馏水稀释样品，以裂解细胞，并在酸性条件下用三氯乙酸提取IHP。所用稀释根据样品性质而不同。如下表所示加入每种试剂：
 样品   蒸馏水的体积   三氯乙酸的体积
 上清液IHP   125μl   175μl、12％的三氯乙酸
 RBC-LR   125μl   175μl、12％的三氯乙酸
 RBC-IHP   325μl   125μl、24％的三氯乙酸
接着使样品于4℃以15000g离心10分钟，并收集提取上清液，使其与显色试剂相接触。
光度计检测
对于光度计检测来说，将300μl显色试剂加至150μl的每份提取上清液和标准溶液以及空白对照中。振荡并于黑暗中孵育15分钟后，将溶液置于10mm比色皿中，并在506nm下测定吸光度。对于每种浓度(100～500μM)，测定Δ吸光度：ΔOD＝OD空白-OD标准。绘制ΔOD/[IHP]标定曲线，计算线性回归参数，并利用所述参数以及通过ΔOD＝OD空白-OD样品测定值来确定提取上清液中存在的IHP量。对于RBC-IHP，通过对不含显色试剂、经同样透析处理并且在同样条件下将血细胞比容调整为50％的红细胞(RBC-LR)进行测定，从而评估由红细胞基质的干扰产生的噪声。
b)制备IHP标定范围
制备1mM溶液
将20μl、45mM的IHP溶液(参见实施例1)与880μl、6％的三氯乙酸混合。
制备标准溶液：
IHP的终浓度(μM)   100   150   200   300   400   500
  1mM IHP的体积(μl)   100   150   200   300   400   500
6％三氯乙酸的体积(μl)   900   850   800   700   600   500
空白为6％的三氯乙酸。
图3表示ΔOD作为IHP浓度之函数的标定线，其利用Fe(III)-磺基水杨酸盐获得。
该方法是线性的，因为R2值等于0.99075。
c)标定范围测定的实例
-总样品的测定
总样品涉及终产物(血细胞比容为50％的RBC)中所含总IPH的测定。
所使用的方法如上所述。
Figure BDA0000105144690000181
两种方法得到相似的结果。
-含有大量且已知量IHP之样品的测定
Figure BDA0000105144690000182
-上清液中IHP的测定
Figure BDA0000105144690000183
＊去除背景噪声后获得的数值
使用Fe(III)/磺基水杨酸盐的方法显示测定上清液时背景噪声增加(直至比色法评估值的50％)。
-估测RBC中所含IPH的量
Figure BDA0000105144690000191
利用两种络合物获得的数值是相似的。
-Fe(III)/磺基水杨酸盐法的定量和检出限
所获得的范围具有0.001158uOD/μM的斜率(uOD＝OD单位)。由这种方法获得之结果的标准差是0.0001737uOD；计算后，范围的LD和LQ值分别为22μM和67μM。
将该方法中的稀释效应考虑在内，校正后获得下列数值：
-上清液LD＝154μM；LQ＝469μM
-总LD＝220μM；LQ＝670μM。

Claims (13)

1.测定可注射进人或动物中之产品中或该产品之级分中的肌醇六磷酸(IHP)的方法，其中将金属化合物加至所述产品的样品或级分中，随后检测所述金属化合物与所存在之IHP的络合反应，由此测定所述产品或其级分中存在的IHP。
2.根据权利要求1的方法，其中所述络合反应产生络合物，其显色与金属化合物的显色不同。
3.根据权利要求2的方法，其中测量所述络合物相对于初始金属化合物的吸光度变化。
4.根据权利要求3的方法，其中所述吸光度的变化通过分光光度法检测。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述试剂是Fe(III)化合物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述Fe(III)化合物是Fe(III)-硫氰酸盐。
7.根据权利要求5的方法，其中所述Fe(III)化合物是Fe(III)-磺基水杨酸盐。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品是红细胞悬液。
9.根据权利要求8的方法，其用于测定总IHP，该方法包括：
-使所述红细胞裂解，
-获得含有所述IHP但不含血红蛋白和细胞碎片的级分，
-将已知量的所述金属化合物加至该级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，
-测定总IHP含量。
10.根据权利要求8的方法，其用于测定红细胞内IHP，该方法包括：
-去除细胞外介质，回收红细胞级分，
-使所述红细胞裂解，
-获得含有所述IHP但不含血红蛋白和细胞碎片的级分，
-将已知量的所述金属化合物加至该级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，
-测定红细胞内IHP含量。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述血红蛋白通过在酸存在下使蛋白质沉淀的步骤去除。
12.根据权利要求8的方法，其用于测定细胞外IHP，该方法包括：
-回收细胞外级分，
-将已知量的所述金属化合物加至该细胞外级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，
-测定细胞外IHP含量。
13.根据权利要求8的方法，其联合权利要求12之细胞外IHP测量和权利要求8之总IHP测量，利用如下等式获得红细胞内IHP含量：
Figure FDA0000105144680000021
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