KR20120014898A

KR20120014898A - 이노시톨 헥사포스페이트（ｉｈｔ）를 분석하는 방법

Info

Publication number: KR20120014898A
Application number: KR1020117025994A
Authority: KR
Inventors: 바네사 부르쥬; 얀 고프랭
Original assignee: 에리테끄 파르마
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2012-02-20
Also published as: IL215466A0; CN102428367A; AU2010233803A1; SG175019A1; AU2010233803B2; FR2944106B1; FR2944106A1; JP2012522978A; US20120129210A1; WO2010115880A1; CA2757407A1; EP2414831A1

Abstract

본 발명은 인간 또는 동물에 주사될 수 있는 제품, 또는 상기 제품의 분획 중 이노시톨 헥사포스페이트(IHP)를 분석하는 방법으로서, 금속 화합물이 시료 또는 상기 제품의 분획에 첨가되고, 뒤이어 상기 금속 화합물과 존재하는 IHP의 복합체형성(complexation)이 검출되며, 이에 의해 상기 제품 또는 그의 분획 중에 존재하는 IHP가 분석되는 것인 방법에 관한 것이다.

Description

이노시톨 헥사포스페이트（ＩＨＴ）를 분석하는 방법{Method for assaying inositol hexaphosphate(IHP)}

본 발명은 인간 또는 동물에 주사될 수 있는 제품, 또는 이 제품의 분획, 특히, 적혈구의 현탁액 중 이노시톨 헥사포스페이트 또는 IHP를 분석하는 방법에 관한 것이다.

IHP는 헤모글로빈의 강력한 알로스테릭 작용인자(allosteric effector)이다. 이 점에서, IHP는 헤모글로빈의 산소에 대한 친화도를 저하시키고 조직에서 산소의 방출을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. IHP는 종양학에서, 특히, 저산소성 종양(hypoxic tumour)에서 방사선요법 아쥬반트로 이용될 수 있다. WO-A-2006/016247은 바이오벡터(biovector)로 작용하는 적혈구 중 IHP의 봉입(encapsulate)을 개시한다.

IHP를 봉입하는 적혈구의 임상적 용도는 처방된 투여량에 따라 수혈할 현탁액의 용량을 결정할 수 있도록 하기 위해, 존재하는 IHP의 양이 알려질 것을 필요로 한다. 또한, IHP는 유리 형태로 투여되는 경우, 잠재적으로 유해한 효과를 가질 수 있는, 금속-킬레이트제, 예를 들면, 칼슘-킬레이트제이기 때문에, 최종 약제학적 제품 중에 존재하는 세포외 IHP를 분석하는 것이 필수적이다.

IHP를 분석하는 다양한 방법들이 문헌에 개시된다. 이 방법들의 대부분은 식품 추출물에 존재하는 IHP를 분석하는 상황에서 개발되었다. 이 방법들은 그들이 직접적 방법, 간접적 방법, 또는 효소에 의한 방법인지 따라 3개의 그룹으로 분류될 수 있다.

직접적 방법 중에, 특히, 질량분석법(mass spectrometry), 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance), 전도도 측정법(conductimetry), 및 굴절률 측정법(refractometry)이 언급될 수 있으며, 이들은 공통적으로 분석될 시료가 고순도이어야 할 필요성을 가지며, 결과적으로 긴 실행 시간을 갖는다.

간접적 방법은 IHP가 금속 이온과 복합체를 형성하는 능력에 기반하며, 이는 비색법 또는 형광측정법(fluorimetry)에 의해 [금속 이온-IHP] 복합체의 형성을 측정할 수 있다. Kenan Dost, Ozge Tokul(Analytica Chimica Acta 558(2006): 22-27)은 밀 및 밀-기반 제품에서 IHP를 간접적으로 측정하는 방법을 개시한다. 이 방법은 IHP의 존재 하에 무색 복합체 [Fe(III)-티오시아네이트]가 착색된 복합체 [Fe(III)-피테이트(phytate)]에 의해 대체되는 것인 반응에 기반한다. 판독은 UV-가시광선 분광분석 검출기에 결합된 HPLC(high performance liquid chromatography)에 의해 수행된다.

곡물에 존재하는 피트산(phytic acid)을 분석하는 방법이 Plaami 등(Journal of the association of official analytical chemists, the association, Arlington, VA, US, 1991, 74, 32-36)으로부터 또한 알려져 있다. 개시된 방법은 피트산에 포함된 인의 측정을 위한 ICP-AES(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry)에 기반한다.

어린이용 식품 중 피트산의 양을 측정하는 다양한 방법들이 Park 등(Butterworth, London, 2006, 17(9), 727-732)으로부터 알려져 있다. 개시된 방법 중 하나는 이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피에 의해 분석하는 단계를 요구하는 Latta 및 Eskin(J. Agric.Food. Chem. , 1980, 28, 1315-1317)에 따른 분광분석 방법이다. Park 등에 따른 피트산을 분석하는 최선의 방법은 AOAC 방법이다.

효소적 방법은 피타아제(phytase)로 불리는 효소에 의한 IHP의 가수분해에 기반한다; 이 방법들은 적혈구내(intraerythrocytic) IHP를 측정하도록 개조될 수 없다.

문헌에 개시된, 농업 제품에서의 분석과 관련된 방법은 특히, 조성의 현저한 차이 때문에, IHP를 포함하는 약제학적 제품에 직접적으로 적용될 수 없다. 본 명세서에서 이 방법들의 제시는 본 발명의 특허성의 평가에서 이들에게 중요성을 부여하는 것으로 간주될 수 없다.

일정 수의 단점을 가져서 약제학적 제품의 제조에서 통상적인 평가에 적합하지 않은, 직접적인 방법을 사용하여 적혈구 중 IHP를 분석하는 것과 관련된 연구를 문헌에서 찾을 수 있다.

S. Villa 등(Adv Exp Med Biol. 1992; 326: 41-49)은 적혈구 중 IHP를 HPLC에 의해 측정하는 간단하고 신뢰가능한 절차를 개시한다. 제안된 분석 방법은 하기 단계들을 포함한다:

- IHP를 내포하는 적혈구의 용해 및 과염소산에 의한 추출에 의해 시료를 준비하는 단계,

- 이동상을 준비하고, HPLC 컬럼을 평형화시키는 단계,

- 시료를 통과시키는 단계,

- 굴절률 측정법(refractometry)에 의해 IHP 농도를 측정하는 단계.

그러나, 이 방법은 HPLC에 의한 시료의 분리를 요구하고, 그의 실행 시간이 결과적으로 매우 길다. 증거로서, 검정(calibration) 범위의 준비는 각각 수회 테스트된, 10개의 상이한 IHP 농도의 측정을 필요로 한다; 그의 소요시간(duration)은 6시간으로 추정될 수 있다. 또한, 이 방법의 검출 한계(0.5 mM)는 최종 제품에 존재하는 세포외 IHP를 정량하기에는 매우 불충분하다. 이 방법은 산업적 규모의 생산에 의해 부여되는 분석의 신속성 및 감도의 과제를 충족시키지 못한다.

B. Teisseire 등(J. Appl. Physiol. 1985 Jun; 58(6): 1810-7)은 새끼 돼지에서 IHP를 내포한 적혈구의 수혈의 생리적 효과를 평가한다. 동 문헌은 IHP 내포(incorporation) 전 및 후에 세포내 포스페이트의 농도 측정에 근거하여 적혈구내 IHP를 측정하는 방법을 개시한다. 이 두 농도 간의 차이는 IHP에서 기인된다. 이와 같은 매우 개략적인(approximative) 방법은 치료적 용도의 제품을 위한 적혈구내 IHP를 측정하기에 적합하지 않다.

Mosca 등(Adv Exp Med Biol. 1992; 326: 19-26) 및 R. Nano et al.(Adv Exp Med Biol. 1992; 326: 35-39)은 이 경우, 포스페이트 농도가 NMR에 의해 측정된다는 사실을 제외하고는, B. Teisseire 등에 개시된 방법과 동일한 적혈구내 IHP를 분석하는 방법을 기재한다. 따라서, B. Teisseire의 방법에 대해 이미 언급된 정확도의 부족 외에, 실행의 어려움 및 NMR 장치와 연관된 과도한 비용도 수반된다.

본 발명의 제1 목적은 신속하고 신뢰할 수 있는 분석 방법을 제안하는 것이다.

본 발명의 제2 목적은 용이하게 자동화될 수 있는 방법을 제안하는 것이다.

본 발명의 제3 목적은 ICH(International Conference on Harmonization)에 의해 정해진 지침을 충족시킬 수 있는 수동 방법 또는 자동화된 방법을 제안하는 것이다.

따라서, 본 발명의 대상은 인간 또는 동물에 주사될 수 있는 제품 또는 상기 제품의 분획에서 이노시톨 헥사포스페이트(inositol hexaphosphate)(IHP)를 분석하는 방법으로서, 금속 화합물이 시료 또는 상기 제품의 분획에 첨가되고, 뒤이어 상기 금속 화합물과 존재하는 IHP의 복합체형성(complexation)이 검출되며, 이에 의해 상기 제품 또는 그의 분획 중에 존재하는 IHP가 분석되는 것인 방법이다.

표현 "인간 또는 동물에게 주사될 수 있는 제품(product that can be injected in humans or animals)"은 활성 성분 또는 오염물로 IHP를 함유할 수 있는 약제학적 제품을 의미하도록 의도된다. 본 발명은 무엇보다도 제품 또는 제품의 분획 중 활성 성분으로 존재하는 IHP를 분석하는 것에 관한 것이다. 용어 "분획(fraction)"은 IHP를 함유할 수 있고, 그의 IHP 함량이 알려져야 하는 제품의 일부를 의미한다. 본 발명은 특히 IHP를 전달하기 위한 현탁액 또는 벡터의 용액으로이루어진 제품 중의 IHP를 분석하는 것에 관한 것이다. 이들은 IHP를 함유하거나 또는 봉입하는 벡터, 또는 반대이온(counterion)을 포함한, 임의의 결합에 의해 IHP에 결합된 벡터일 수 있다. 하나의 중요한 모드에서, 본 발명에 따른 분석 방법은 벡터의 현탁액 중 총 IHP의 분석 또는 엑스트라-벡터 매질(extra-vector medium), 특히, 상층액 또는 현탁액, 및 벡터로 대표되는 분획 중 하나 또는 양자 모두에서의 IHP의 분석에 적용된다. 바람직하게는, 벡터의 현탁액, 예를 들면, 리포좀, 미소구체 (microsphere), 또는 나노구체(nanosphere), 마이크로캡슐 또는 나노캡슐, 적혈구 등의 현탁액을 포함한다. 본 발명은 또한 IHP 벡터를 함유하는 제품의 상층액에서 유리 IHP를 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 복합체형성(complexation)은 복합체를 생성하고, 그의 착색(colouration)은 출발 금속 화합물의 착색과 상이하다. 출발 금속 화합물 대비 복합체의 흡광도(absorbance)의 변화가 측정될 수 있다. 하나의 유리한 특성에 따르면, 흡광도의 변화는 분광분석법에 의해 검출된다.

일 구체예에 따르면, 시약은 착색된 Fe(III) 화합물이다. 특히, 피테이트(phyate) 복합체를 행성할 수 있게 하는 것은 금속 화합물이고, 특히 F Crea et al. , 2008, Coordination Chemistry Reviews 252, 1108-1120을 참조할 수 있다. 시약으로서, 예를 들면, Fe(III)-티오시아네이트, 및 용액 중 Fe(III)-술포살리실레이트의 형태일 것인 Fe(III)-5-술포-살리실산이 언급될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 시약은 Fe(III)-티오시아네이트이다.

일 구체예에서, 상기 시약은 Fe(III)-술포살리실레이트이다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 분석 방법은 적혈구의 현탁액 중 IHP의 분석에 적용된다. 본 발명은 특히, IHP가 적재되고, 환자의 치료를 위해 의도된 적혈구의 현탁액에 존재하는 IHP의 분석에 적용된다. 상기 방법은 총 IHP, 세포내 IHP 및/또는 세포외 IHP의 분석에 적용된다. 일 구체예에 따르면, 상기 방법은 특정 부피의 현탁액에 존재하는 IHP의 분석에 적용된다. 이 분석은 세포외 IHP 함량을 동시에 고려하여, 환자에게 처방된 IHP의 투여량에 따라 투여될 현탁액의 양을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 상기 방법은 상층액에 존재하는 IHP의 분석에 적용된다.

총 IHP의 분석에 적용되는, 상기 방법은 특히, 하기를 포함한다:

- 세포외 배지(extracellular medium)의 존재 하에 적혈구를 용해시키는 단계,

- IHP를 포함하고, 헤모글로빈 및 세포 파편을 포함하지 않는 분획을 수득하는 단계,

- 이 분획에, 알려진 양의 금속 화합물을 첨가하여, 존재하는 IHP와의 복합체의 형성을 초래하는 단계,

- 총 IHP 함량을 결정하는 단계.

적혈구내(intra-erythrocytic) IHP에 적용되는 경우, 상기 방법은 특히 하기를 포함한다:

- 세포외 배지를 제거하고, 적혈구 분획을 회수하는 단계,

- 적혈구를 용해시키는 단계,

- 이 세포외 분획에, 알려진 양의 금속 화합물을 첨가하여, 존재하는 IHP와의 복합체의 형성을 초래하는 단계,

- 적혈구내 IHP 함량을 결정하는 단계.

세포외 IHP에 적용되는 경우, 상기 방법은 하기를 포함할 수 있다:

- 세포외 분획을 회수하는 단계,

- 세포외 IHP 함량을 결정하는 단계.

유사한 절차가 IHP를 함유한 다른 종류의 벡터, 예를 들면, 리포좀 또는 미소구체에 적용될 수 있고, IHP에 결합된 벡터를 함유한 제품의 현탁액 중 유리 IHP의 분석에 적용될 수 있다.

세포외 IHP 측정값이 동일한 적혈구 현탁액의 총 IHP 측정값과 합쳐지면, 그로부터 적혈구내 IHP 함량이 추론될 수 있다. 특히, 하기의 식이 적용될 수 있다:

하나의 특징에 따르면, 헤모글로빈은 산의 존재 하에 단백질을 침전시키는 단계에 의해 제거된다. 헤모글로빈을 포함한, 단백질을 침전시킬 수 있는 산이 이 추출 단계를 수행할 수 있는 것으로 고려될 수 있다. 상기 단계는 이 단백질 및 막 파편을 제거하고, IHP와 같은 소형 분자를 회수할 수 있게 한다. 비한정적인 예로서, 과염소산, 트리클로로아세트산, 옥살산, 시트르산, 질산, 염산, 황산 및 락트산이 언급될 수 있다. 염산이 완벽하게 적합하다. IHP를 함유한 분획이 원심분리에 의해 회수될 수 있다.

본 발명의 하나의 특징에 따르면, Fe(III)착색 시약(Fe(III)-티오시아네이트 또는 Fe(III)-술포살리실레이트)가 첨가된 후, 분석될 시료는 형성된 Fe(III)-피테이트 복합체가 안정화되기에 충분한 시간 동안 인큐베이션된다. 이 시간은 짧고, 예를 들면, 약 5분 내지 약 30분의 시간이 충분하다. 시간은 특히 약 10분 내지 약 20분일 수 있고, 통상적으로 약 15분 정도이다. 상기 인큐베이션은 바람직하게는 암소(dark)에서 수행된다.

하나의 바람직한 구체예에 따르면, Fe(III) 티오시아네이트 착색 시약은 하기 특징을 갖는다:

- ml 시약 당 0.1 내지 1 μmol의 Fe(III), 특히, 0.25 내지 0.6 μmol/ml, 바람직하게는 0.3 내지 0.4 μmol/ml,

- 과량의 티오시아네이트, 특히, 10 내지 50 μmol/ml, 바람직하게는 20 내지 40 μmol/ml, 훨씬 더 바람직하게는 30 내지 40 μmol/ml.

본 발명의 하나의 특징에 따르면, Fe(III) 티오시아네이트 시약은 0.25 내지 0.6 μmol의 Fe(III)/ml, 및 20 내지 40 μmol의 티오시아네이트/ml를 포함한다. 바람직하게는, 상기 시약은 0.3 내지 0.4 μmol의 Fe(III)/ml, 및 30 내지 40 μmol의 티오시아네이트/ml를 포함한다.

하나의 바람직한 구체예에 따르면, Fe(III)-술포살리실레이트 착색 시약은 0.5 내지 2 μmol의 Fe(III)/ml 및 5 내지 15 μmol의 술포살리실레이트/ml를 포함한다.

상기 시약은 물을 더 포함하고, 특히, 산 용액, 특히, 침전 동안 사용된 것과 동일한 산의 용액으로 제조된다.

하나의 특징에 따르면, 상기 시약은 Fe(III) 및 티오시아네이트의 염산 용액이다.

하나의 특징에 따르면, 상기 시약은 Fe(III) 및 살리실레이트의 염산 용액이다.

하나의 특징에 따르면, 상기 시약 중 산의 농도는 0.01 몰 내지 0.2 몰, 바람직하게는 0.05 몰 내지 0.15 몰이다.

일 구체예에 따르면, 본 발명은 IHP가 Fe(III) 이온과 복합체를 형성하는 능력에 근거한, IHP를 분석하는 분광분석 방법으로 구성된다. 상기 방법은 교체(replacement) 반응에 기반하며, 교체 반응 동안, 착색 복합체 [Fe(III)-티오시아네이트] 또는 [Fe(III)-술포살리실레이트]의 형태로 존재하는 분석 시약 중의 Fe(III) 이온이 분석 대상 시료에 존재하는 IHP와 새로운 무색 복합체 [Fe(III)-피테이트]를 형성한다. [Fe(III)-티오시아네이트] 복합체의 흡광 피크는 460 nm이므로, OD_46O의 측정은 [Fe(III)-티오시아네이트]의 농도를 결정하고 분석 반응을 요약하는 식을 통해, 그로부터 IHP의 농도를 추론할 수 있게 할 것이다. [Fe(III)-술포살리실레이트] 복합체의 흡광 피크는 506 nm이므로, OD₅₀₆의 측정은 [Fe(III)술포살리실레이트]의 농도를 결정하고 분석 반응을 요약하는 식을 통해, 그로부터 IHP의 농도를 추론할 수 있게 할 것이다.

본 발명의 하나의 특징에 따르면, [Fe(III)-티오시아네이트] 또는 [Fe(III)-술포살리실레이트] 착색 시약은 즉석에서 제조된다. 따라서, 분석 방법은 분석 대상 시료 또는 시료 분획에 상기 착색 시약을 첨가하기 전에 상기 착색 시약을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 Fe(III)-티오시아네이트 또는 Fe(III)-술포살리실레이트 시약은 사용하기 직전(통상적으로 30분 내지 1시간 전)에 제조하고 사용하기 전까지 암소에 보관하는 것이 유리하다.

본 발명의 방법으 환자에게 투여하기 전에, 또는 제조 대조군으로서, IHP를 봉입하는 적혈구의 배치(batch)를 대표하는 시료에 적용될 수 있다.

맹검물(blank)은 적혈구 매트릭스와 연관된 백그라운드 노이즈를 제거할 수 있도록, 용해-방출된 적혈구(red blood cells that have been lysed-resealed, RBC-LR)를 이용하여 준비될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 방법은 IHP 검정 범위의 제조를 포함하고; 바람직하게는, 이 범위는 분석 당일에 제조된다. 또 다른 구체예에 따르면, 검정 범위 대신에, 시료의 분량(aliquot)에 알려진 양의 IHP가 첨가되는 방법이 이용된다.

본 발명에 따른 분석은 적혈구 매트릭스에 완벽하게 적합하다. IHP 추출 단계는 특히, 흡광도 측정에 영향을 미칠 수 있는 착색을 갖는, 헤모글로빈을 제거하는 것을 가능하게 한다. 용해-방출되고, IHP가 적재된 시료와 동일하게 처리된 적혈구를 이용한 맹검물의 추가는 적혈구의 영향을 측정하고 제거할 수 있게 한다. 분석 시약의 선택 및 간단한 분광분석기의 이용은 분석이 자동화되고, 실행이 신속하고 용이할 수 있게 한다. 따라서, 상기 분석은 자동화된 생화학 장치에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 크로마토그래피(HPLC, 이온 교환 크로마토그래피)나 NMR 분광분석법의 관여를 요구하지 않는다. 선행 기법 대비, 비용 및 분석의 실행시간의 현저한 감축이 수득된다. 시료가 HPLC를 통과하기 위해서 약 15분이 요구되나, 분광분석기 상에서 OD의 측정은 수초 내에 충분히 이루어질 수 있다. 이와 같은 소요 시간의 단축은 테스트되는 각 시료에 적용되고, 또한, 분석 전에 수행되어야 하는 검정 범위의 각 점에 대해서도 적용된다. 시료의 제조도 긴 인큐베이션 단계를 요구하지 않는다. 분석의 총 시간은 결과적으로 상당히 단축되며, 이는 상기 분석을 산업적 규모에서 이용하기에 적합하게 한다. 마지막으로, 본 발명의 방법은 위험한 생성물 없이, 예를 들면, 단백질 침전을 위한 산의 선택을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 대상은 또한 하기 단계를 포함하는, IHP에 의한 치료에 의해 이로울 수 있는 병리적 상태의 치료를 위해 IHP를 함유한 벡터(특히, 리포좀, 마이크로 캡슐, 미소구체, 적혈구 등)의 현탁액, 특히, IHP를 봉입하는 적혈구의 현탁액, 또는 IHP에 결합된 벡터의 용액으로부터 제조된 약제학적 제품으로 환자를 치료하는 방법이다:

- 상기 현탁액 또는 용액, 특히, IHP를 봉입하는 적혈구의 현탁액을 준비하거나 또는 제조하는 단계,

- 상기 현탁액 또는 상기 용액을 대표하는 시료를 채취(remove)하는 단계,

- 본 발명에 따른 방법을 이용하여, 상기 시료 중 IHP를 분석하는 단계,

- 농도 데이터에 근거하여, 환자에게 처방되는 양을 반영하는 방식으로, 투여될 상기 현탁액 또는 용액, 특히, 적혈구의 현탁액의 용량을 계산하는 단계,

- 상기 용량을 환자에게 투여하는 단계.

본 발명은 비한정적인 실시예로서 제시된 구체예를 이용하고, 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이다:
도 1은 Fe(III)-티오시아네이트 시약에 의해 수득된, IHP 농도의 함수로서 검정 선(calibration line) △OD를 나타내는 그래프이다.
도 2는 Fe(III)-티오시아네이트 시약에 의해 수득된, 정량 첨가 방법(metered additions method)에 따라 수득된, 첨가된 IHP 농도의 함수로서 직선 △OD를 나타내는 그래프이다.
도 3은 Fe(III)-술포살리실레이트에 의해 수득된, IHP 농도의 함수로서 검정 선 △OD를 나타내는 그래프이다.

실시예 1: 시약 및 화학물질 용액

염화 철(III) 용액의 제조: 20 mg의 염화 철(III)을 40 ml의 증류수에 용해시킨다(0.5 mg/ml).

암모늄 티오시아네이트 용액의 제조: 200 mg의 암모늄 티오시아네이트를 40 ml의 증류수에 용해시킨다(5 mg/ml).

착색 시약은 사용 약 40분 전에 제조하며, 1 ml의 0.5 mg/ml 염화 철(III), 5 ml의 5 mg/ml 암모늄 티오시아네이트, 0.9 ml의 1N 염산 및 2 ml의 증류수로 구성된다.

트리클로로아세트산 TCA 용액(중량/부피)의 제조

18.75% 용액: 3 ml의 6.1N TCA(100%) + 13 ml의 증류수

9.375% 용액: 10 ml의 18.75% TCA 용액 + 10 ml의 증류수

7.5% 용액: 15 ml의 6.1N TCA(100%) + 185 ml의 증류수

24% 용액: 6ml의 6.1N TCA(100%) + 19 ml의 증류수

12% 용액: 10 ml의 24% TCA 용액 + 10 ml의 증류수

6% 용액: 15 ml of 6.1N TCA(100%) + 235 ml의 증류수

IHP 스톡 용액(stock solution)의 제조: 45 mM 용액 1 ml를 위해, 칭량될 IHP의 도데카소디움 염의 양 X를 하기 방식으로 계산한다: X(g)= 415.719/(p x(100-H)), 식 중에서, p는 염의 순도(%)이고, H는 수분 함량(%)이다. 최종 부피는 증류수를 이용하여 1ml로 맞춘다.

인간 적혈구 중에 IHP를 봉입시키는 방법: 저장성 컬럼 투석(hypotonic column dialysis) 방법에 의해 인간 적혈구(RBC)에 IHP(660 g/mol)를 봉입시켰다.

백(bag)으로부터의 RBC를 0.9% NaCl로 3회 세척한다. 적혈구 용적율(hematocrit)은 투석의 개시 전에, 17 또는 20 mM의 최종 농도로 첨가된 IHP의 존재 하에 60%로 맞춘다. RBC를 저-삼투압농도 용해 완충액(역유속(counterflow) 15 ml/분)에 대해 1.5 ml/분의 유속으로 투석시킨다. 컬럼을 통과하는 용해된 RBC를 고삼투압성 용액의 첨가 및 37℃에서 30분 인큐베이션에 의해 방출시킨다. 0.9% NaCl, 0.2% 글루코오스에 의한 수회 세척 후에, RBC를 저장 용액(AS-3 완충액)을 이용하여 50%의 적혈구 용적율을 갖게 한다.

실시예 2: RBC - IHP 시료 및 세포외 배지 중 총 IHP 의 분석

1)분석 대상 시료의 속성

세포내 IHP를 결정하기 위해, 시료 (RBC-IHP) 중의 총 IHP 및 상층액(세포외 배지) 중의 IHP 함량을 분석한다. 상층액은 1000 g, 4℃에서 10분 동안 RBC-IHP를 원심분리하는 것에 의해 수득한다. 분석 대상 시료는 또한, 추출을 필요로 하지 않는 IHP의 수용액일 수 있다.

검정 범위를 이용한 분석 방법(외부 검정)

시료 제조

RBC-IHP(50 ㎕) 및 상층액(50 ㎕)을 -2O℃에서 30분 동안 동결시킨다. 실온(ambient temperature)까지 재가열한 후, 시료를 증류수로 희석시켜 세포들을 용해시키고, IHP를 트리클로로아세트산에 의한 산성 조건 하에서 추출한다. 시료의 속성에 따라, 적용되는 희석은 변한다. 다양한 농도의 트리클로로아세트산(TCA)이 시료의 제조를 위해 이용될 수 있다.

각 시약은 하기의 표에 표시된 바와 같이 첨가한다:

시료	증류수의 부피	트리클로로아세트산의 부피
상층액	125 ㎕	9.375% 트리클로로아세트산 175 ㎕
RBC-IHP	950 ㎕	18.75% 트리클로로아세트산 333 ㎕

그 후, 시료를 15 000g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 추출 상층액을 수집하여 착색 시약과 접촉시킨다. 착색 시약과 혼합하기 전에, RBC-IHP를 추가로 희석한다(75 ㎕의 7.5% 트리클로로아세트산을 75 ㎕의 추출 상층액과 혼합한다).

IHP 검정 범위의 제조

1 mM 용액의 제조

45 mM의 IHP 용액(실시예 1 참조) 20 ㎕를 7.5% 트리클로로아세트산 880 ㎕와 혼합한다.

표준 용액(standard solution)의 제조:

IHP의 최종 농도 (μM)	20	40	60	80	100	120
1 mM IHP의 부피 (㎕)	20	40	60	80	100	120
7.5% 트리클로로아세트산의 부피 (㎕)	980	960	940	920	900	880

맹검물(blank)은 7.5% 트리클로로아세트산으로 제조된다.

광도 검출( Photometric detection )

광도 검출을 위해, 300 ㎕의 착색 시약(실시예 1에서와 같이 제조됨)을 각각의 추출 상층액 및 표준 용액 및 맹검물 150 ㎕에 첨가한다. 교반 및 암소에서의 15분의 인큐베이션 후, 용액을 10 mm 큐벳(cuvett)에 넣고 흡광도를 460 nm에서 측정한다. 각 농도(20-120 μM)에 대해, 델타 흡광도(delta absorbance) △OD = OD_맹검물 - OD_표준을 결정한다. △OD/[IHP] 검정 곡선을 작성하고, 선형 회귀 파라미터를 계산하고, 이를 이용하여 △OD = OD_맹검물 - OD_시료 측정에 의해 추출 상층액에 존재하는 IHP의 양을 결정한다. RBC-IHP의 경우, 적혈구 매트릭스로부터의 간섭에 의한 노이즈를 동일한 투석 과정을 거치고, 동일한 조건 하에 50%의 적혈구 용적율로 조정된 적혈구(RBC-LR)의 분석을 통해 평가한다. RBC-IHP 상층액의 경우, 분석과의 간섭이 관찰되지 않았다.

2)정량 첨가( metered addition )에 의한 분석 방법

이 방법은 적혈구 매트릭스 효과를 제거하고 따라서, RBC-IHP에 포함된 IHP의 분석을 위한 RBC-LR의 생성을 피할 수 있게 한다. X mM의 IHP를 포함하는, 분석 대상 시료를 50 ㎕ 부피로 분주하고, 알려진 농도(Cl, C2, C3, C4, C5, 등)의 IHP(950 ㎕)의 다양한 첨가분을 적혈구 용해 단계 동안 제조한다. 각 튜브에 18.75% TCA(333 ㎕)의 첨가, 및 뒤이은 15,000 g에서의 10분 동안의 원심분리는 상층액 중 IHP의 회수를 가능하게 한다. 광도 결정(photometric determination)을 위해, 300 ㎕의 착색 시약(실시예 1에서와 같이 제조됨)을 각각의 추출 상층액 150 ㎕에 첨가한다. 기준 튜브(reference tube)는 300 ㎕의 착색 시약을 150 ㎕의 6% TCA에 첨가하는 것에 의해 제조한다. 교반 및 암소에서의 15분의 인큐베이션 후, 용액을 10 mm 큐벳에 넣고, 460 nm에서 흡광도를 측정한다. 각 점(point)에 대해, 델타 흡광도 △OD = OD_기준 - OD_시료를 결정한다. △OD/ 첨가된 [IHP]의 검정 곡선을 작성한다. 상기 곡선이 선형 직선이 아닌 경우, 최대 농도 점을 7.5% 트리클로로아세트산으로 희석하고 재분석한다. 직선과 x-축의 교차점(절대값)은 직접적으로 최초 시료에 포함된 IHP의 값 X를 나타낸다.

실시예 3: 적혈구 내에 봉입된 IHP 의 양 계산

RBC-IHP 및 세포외 배지 중 IHP의 농도를 실시예 2에서와 같이 결정한다. 세포내 IHP를 계산하기 위해, 하기 식을 적용한다:

실시예 4: 방법의 최적화 및 효과 규명

1) 착색 시약의 안정성

착색 시약은 실시예 1에 표시된 바와 같이 제조했다. 그의 안정성을 300 분 동안 460 nm에서의 광도 측정에 의해 연구했다. 결과는 착색 시약을 사용하기 약 40분 전에 제조하는 것이 바람직하고, 이때부터 4시간 이상 동안 안정하고, 이는 모든 분석을 수행할 수 있게 한다는 것을 보여준다.

2) 범위의 선형성

IHP 범위의 선형성을 20 내지 120 μM IHP(착색 시약과 접촉시키기 전의 농도)의 범위에 대해 연구하였다. 실시예 2에서와 같이 제조된, 150 ㎕의 각 범위 점을 300 ㎕의 착색 시약과 혼합하고, 실시예 2에 표시된 바와 같이, 범위를 그래프로 작성하였다(plot). Fisher 검정은 상기 검정 범위가 유효하다는 것을 보여주었다.

3 ) 시료 추출 조건의 최적화

최적화된 중첩 비율(overlap percentage)을 구하기 위해, 2.5 부피(volume)의 증류수 및 3.5 부피의 9.375% TCA를 이용한 통상적인 추출을 최적화하였다. 다양한 IHP 함량을 포함하는 비-삼투압성(non-osmolar) 수용액의 보다 큰 부피(19 부피)를 이용하여 다양한 IHP 농도에서의 IHP + RCB의 현탁액의 추출을 시뮬레이션하였다. 7.5%의 최종 농도로 사용된 농축된 18.75% TCA의 사용은 시료를 너무 많이 희석하지 않고, 분석 민감도의 저하를 피할 수 있게 한다. 실시예 2에 기재된 프로토콜에 따라 시료를 분석했다. 두 개의 추출 방법을 비교하는 결과가 하기에 제시된다.

4) 방법의 강건성 ( Robustness )

다양한 온도(6℃, 22℃ 및 35℃)에서 시료를 분석했다. 본 발명의 방법은 온도의 변화에 대해 강건한 것으로 확인되었다.

5) 정량 및 검출 한계

ICH의 권고에 따라 정량 및 검출 한계를 결정하였다. 이를 위해, 8개의 맹검물(7.5% TCA)을 제조하고, 그의 선형성 범위 (20 내지 120 μM)에서 범위를 연구하였다. 착색 시약과 혼합한 후에, 맹검물 및 검정 점들(calibratoin points)을 실시예 2에 기재된 바와 같이, 분광분석기 상에서 분석하였다. 하기 ICH 식에 따라 LD 및 LQ를 결정할 수 있도록 수득된 OD의 표준 편차를 계산하였다.

식 :

식 중에서: σ = 맹검물에 근거한 표준 편차

P = 검정 선(calibration line)의 기울기

수득된 범위는 0.0045 uOD/μM(uOD = OD의 단위)의 기울기를 가졌다. 이 방법에 의해 수득된 결과의 표준 편차는 0.00477 uOD이고; 계산 후에, 상기 범위에 대한 LD 및 LQ 값은 각각 3.5 μM 및 10.6 μM이었다.

이 방법의 희석 효과를 고려하고, 보정(correction) 후에, 하기 값을 수득한다:

- 상층액 LD = 25 μM; LQ = 74 μM

- 전체 LD = 94 μM; LQ = 283 μM.

실시예 5

1) 검정 범위에 의한 방법 및 RBC-LR 매트릭스의 분석에 의한 적혈구 매트릭스 연관 노이즈의 제거를 이용한 결과의 예

하기 표의 값을 이용한 IHP 검정 직선의 그래프 (도 1):

시료 중 IHP의 계산:

2)정량 첨가 방법을 이용한 결과의 예

분석 대상 시료를 50 ㎕ 부피로 분주하고, 실시예 2에 상세하게 기재된 바와 같이 처리하였다(정량 첨가 방법). 수행된 첨가가 하기에 표로 요약된다:

첨가	C1	C2	C3	C4	C5
첨가된 용액의 농도(mM)	0	0.0157	0.0314	0.0474	0.0632
최초 시료로의 첨가에 상응하는 농도(mM)	0	0.3	0.6	0.9	1.2

수득된 점(하기 표)은 도 2의 직선을 작성할 수 있게 했다.

첨가[IHP](mM)	△OD	CV
0	0.271	5%
0.3	0.324	1%
0.6	0.381	2%
0.9	0.420	1%
1.2	0.463	3%

점 y = 0에서 농도를 결정하고, 이는 절대값으로 최초 시료 중 [IHP] = 1.72 mM를 나타낸다. 식 y = 1.599x + 0.2756를 이용하여 계산된다.

3) 정량 첨가와 검정 범위 방법의 비교

테스트	검정 범위에 의한 분석(mM)	정량 첨가 분석(mM)	% CV
1	1.64	1.72	3%
2	1.86	1.92	2%
3	1.84	1.82	1%

실시예 6: 분석의 자동화

검정 범위에 의한 분석의 예

IHP를 봉입한 RBC의 분석은 생화학 장치(MaxMat) 상에서 부분적으로 자동화되었다. 착색 시약(시약), 7.5% TCA(희석제) 및 1 mM IHP 스톡 용액(표준)을 실시예 1에서와 같이 제조하고, 자동화된 장치의 플랫폼 상에 배치했다. 분석 대상 시료를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 수동으로 제조했다. 분석 대상 시료의 추출로부터의 각 상층액을 1.5 ml 튜브로 옮기고 플랫폼 상에 배치했다.

분석 방법을 올바르게 파라미터화하였다:

-포지티브 모드(positive mode)

- 네가티브 선형 회귀 모드

- 30 사이클:

ο 사이클 1: 제조된 시료의 채취: 75 ㎕ 및 460 nm에서의 OD 판독

ο 사이클 2: 착색 시약의 첨가: 150 ㎕

ο 사이클 30: 460 nm에서의 OD 판독.

분석이 개시되면, 자동화된 장치는 7.5% TCA 중 검정 범위의 희석(1/8.3, 1/10, 1/12, 1/15, 1/25, 1/50) 및 그 후, 착색 시약과의 다양한 혼합물을 준비한다. 30회의 사이클이 완료되면, 자동화된 장치는 범위 점(range point) 및 다양한 시료에 대한 460 nm에서의 OD 값을 표시한다. 그 후, 결과가 실시예 3의 계산 쉬트와 동일한 엑셀 계산 쉬트로 전달된다. 하나 이상의 시료의 분석은 60분 미만 내에 수행된다.

수동 분석 및 자동 분석에 의해 수득된 여러 시료의 결과는 50% 적혈구 용적율의 RBC-IHP 및 상층액에 대해 유사하다(%CV<10%)(하기 표 참조).

시료	시료의 속성	시료 중 IHP의 자동화 분석 평균 농도(mM)	시료 중 IHP의 수동 분석 평균 농도(mM)	평균	CV
1	RBC-IHP	2.933	2.781	2.857	4%
2	상층액	0.218	0.203	0.211	5%
3	상층액	0.564	0.543	0.554	3%
4	상층액	0.387	0.431	0.409	8%

실시예 7: Fe ( III )- 술포살리실레이트를 리간드로 이용한 분석 및 Fe ( III )- 티 오시아네이트와의 비교

a) 방법의 설명

염화 철(III) 용액의 제조: 49 mg의 염화 철(III)을 21.2 ml의 증류수에 용해시켰다(2.31 mg/ml).

5-술포살리실산 용액의 제조: 98.6 mg의 술포살리실레이트를 19.7 ml의 증류수에 용해시켰다(5mg/ml).

염산 용액의 제조: 500 ㎕의 1N 염산을 9.5 ml의 증류수에 용해시켰다(0.05N).

착색 시약은 1 ml의 2.31 mg/ml 염화철(III) 용액, 5 ml의 5 mg/ml 술포살리실산 용액, 0.9 ml의 0.05N 염산 용액 및 2 ml의 증류수로 구성되었다.

Fe(III)-티오시아네이트를 전술된 방법에 따라 제조하였다.

시료 제조:

RBC-IHP(50 ㎕) 및 상층액(50 ㎕)을 -2O℃에서 30분 동안 동결시켰다. 실온까지 재가열한 후, 시료를 증류수로 희석시켜 세포들을 용해시키고, IHP를 트리클로로아세트산에 의한 산성 조건 하에서 추출하였다. 시료에 따라, 적용되는 희석은 변했다. 각 시약은 하기의 표에 표시된 바와 같이 첨가했다:

시료	증류수의 부피	트리클로로아세트산의 부피
상층액 IHP	125 ㎕	12% 트리클로로아세트산 175 ㎕
RBC-LR	125 ㎕	12% 트리클로로아세트산 175 ㎕
RBC-IHP	325 ㎕	24% 트리클로로아세트산 125 ㎕

그 후, 시료를 15,000 g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 추출 상층액을 수집하여 착색 시약과 접촉시켰다.

광도 검출

광도 검출을 위해, 300 ㎕의 착색 시약을 각각의 추출 상층액 및 표준 용액 및 맹검물 150 ㎕에 첨가했다. 교반 및 암소에서의 15분의 인큐베이션 후, 용액을 10 mm 큐벳에 넣고 흡광도를 506 nm에서 측정했다. 각 농도(100-500 μM)에 대해, 델타 흡광도 △OD = OD_맹검물 - OD_표준을 결정했다. △OD/[IHP] 검정 곡선을 작성하고, 선형 회귀 파라미터를 계산하고, 이를 이용하여 △OD = OD_맹검물 - OD_시료 측정에 의해 추출 상층액에 존재하는 IHP의 양을 결정했다. RBC-IHP의 경우, 적혈구 매트릭스로부터의 간섭에 의한 노이즈를 착색 시약의 부재 하에 동일한 투석 과정을 거치고, 동일한 조건 하에 50%의 적혈구 용적율로 조정된 적혈구(RBC-LR)의 분석을 통해 평가했다.

b) IHP 검정 범위의 제조

1 mM 용액의 제조

45 mM의 IHP 용액(실시예 1 참조) 20 ㎕를 6% 트리클로로아세트산 880 ㎕와 혼합한다.

표준 용액의 제조:

IHP의 최종 농도(μM)	100	150	200	300	400	500
1 mM IHP의 부피 (㎕)	100	150	200	300	400	500
6% 트리클로로아세트산의 부피 (㎕)	900	850	800	700	600	500

맹검물은 6% 트리클로로아세트산으로 제조하였다.

도 3은 Fe(III)-술포살리실레이트에 의해 수득된, IHP 농도의 함수로서 검정 선 △OD를 나타낸다.

R² 값이 0.99075이기 때문에 상기 방법은 선형적이다.

c) 검정 범위에 의한 분석의 예

- 전체 시료의 분석

전체 시료(total sample)는 최종 생성물 중에 포함된 총 IHP를 분석하는 것에 관한 것이다(적혈구 용적율 50%의 RBC).

사용된 방법은 앞서 설명되었다.

분석 시료	사용된 복합체(complex)		두 방법 간의 % CV
분석 시료	FeIII/티오시아네이트	FeIII/설포살리실레이트	두 방법 간의 % CV
1	2.46 mM	2.59 mM	4%
2	2.69 mM	2.61 mM	2%
3	2.55 mM	2.68 mM	4%
4	3.38 mM	3.64 mM	5%

상기 두 방법은 유사한 결과를 가져왔다.

- GR(great) 및 알려진 양의 IHP를 함유한 시료의 분석

	측정된 IHP 농도(mM)
	FeIII/티오시아네이트	FeIII/설포살리실레이트	FeIII/티오시아네이트에 의한 이론값 대비 차이	FeIII/설포살리실레이트에 의한 이론값 대비 차이
10,5 mM의 IHP + GR	10,24	8,10	2.4%	22.8%
17 mM의 IHP + GR	16,24	17,80	3.5 %	4.7%

- 상층액 중 IHP의 분석

	측정된 IHP 농도(mM)
	FeIII/티오시아네이트	FeIII/설포살리실레이트	CV(%)
매트릭스 s-GRLR	/	0.308
상층액 1	0.272	0.298*	6%
상층액 2	0.36	0.414*	10%
상층액 3	0.502	0.587*	11%

* 백그라운드 노이즈를 차감하는 것에 의해 수득된 값.

Fe(III)/술포살리실레이트를 이용한 방법은 상층액의 분석에 대해 증가된 백그라운드 노이즈를 보였다(비색법에 의해 평가된 값의 50% 까지).

- RBC에 함유된 IHP 양의 추정

	복합체 속성
	FeIII/티오시아네이트	FeIII/설포살리실레이트	CV(%)
GR-IHP 1	19.04 μmol/g Hb	19.99 μmol/g Hb	3%
GR-IHP 2	25.03 μmol/g Hb	26.93 μmol/g Hb	5%

상기 두 개의 복합체에 의해 수득된 값들은 유사하다.

- Fe(III)-술포살리실레이트 방법의 정량 및 검출 한계

수득된 범위는 0.001158 uOD/μM(uOD = OD의 단위)의 기울기를 가졌다. 이 방법에 의해 수득된 결과의 표준 편차는 0.0001737 uOD이고; 계산 후에, 상기 범위에 대한 LD 및 LQ 값은 각각 22 μM 및 67 μM이었다.

이 방법의 희석 효과를 고려하고, 보정 후에, 하기 값을 수득한다:

- 상층액 LD = 154 μM; LQ = 469 μM

- 전체 LD = 220 μM; LQ = 670 μM

Claims

인간 또는 동물에 주사될 수 있는 제품, 또는 상기 제품의 분획 중 이노시톨 헥사포스페이트(IHP)를 분석하는 방법으로서, 금속 화합물이 시료 또는 상기 제품의 분획에 첨가되고, 뒤이어 상기 금속 화합물과 존재하는 IHP의 복합체형성(complexation)이 검출되며, 이에 의해 상기 제품 또는 그의 분획 중에 존재하는 IHP가 분석되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 복합체형성은 복합체를 생성하고, 그의 착색(colouration)은 상기 금속 화합물의 착색과 상이한 것인 방법.
제2항에 있어서, 출발 금속 화합물 대비 상기 복합체의 흡광도의 변화가 측정되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 흡광도의 변화는 분광분석법에 의해 검출되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시약은 Fe(III) 화합물인 것인 방법.
제5항에 있어서, Fe(III)화합물은 Fe(III)-티오시아네이트인 것인 방법.
제5항에 있어서, Fe(III)화합물은 Fe(III)-술포살리실레이트인 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 시료는 적혈구의 현탁액인 것인 방법.
제8항에 있어서, 총 IHP에 적용되는 경우, 상기 방법은
- 적혈구를 용해시키는 단계,
- 상기 IHP를 포함하고, 헤모글로빈 및 세포 파편(cell debris)을 포함하지 않는 분획을 수득하는 단계,
- 상기 분획에 존재하는 IHP와 복합체의 형성을 초래하는, 알려진 양의 금속 화합물을 상기 분획에 첨가하는 단계, 및
- 총 IHP 함량을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 적혈구내(intra-erythrocytic)IHP에 적용되는 경우, 상기 방법은
- 세포외 배지(extracellular medium)를 제거하고, 적혈구 분획을 회수하는 단계,
- 상기 적혈구를 용해시키는 단계,
- IHP를 포함하고, 헤모글로빈 및 세포 파편을 포함하지 않는 분획을 수득하는 단계,
- 상기 분획에 존재하는 IHP와 복합체의 형성을 초래하는, 알려진 양의 금속 화합물을 상기 분획에 첨가하는 단계, 및
- 적혈구내 IHP 함량을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 산의 존재 하에 단백질을 침전시키는 단계에 의해 제거되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 세포외 IHP에 적용되는 경우, 상기 방법은
- 세포외 분획을 수집하는 단계,
- 상기 세포외 분획에 상기 분획에 존재하는 IHP와 복합체의 형성을 초래하는, 알려진 양의 금속 화합물을 첨가하는 단계, 및
- 세포외 IHP 함량을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 제12항에 따라 세포외 IHP를 측정하는 단계와 제8항에 따라 총 IHP 함량을 측정하는 단계를 통합하고, 상기 적혈구내 IHP 함량은 하기 식에 의해 수득되는 것인 방법:

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