JP2012522978A - イノシトール六リン酸(ihp)をアッセイするための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
・ IHPを取り込んだ赤血球の溶解および過塩素酸を用いた抽出により、試料を調製する工程、
・ 移動相を調製し、HLPCカラムを平衡化する工程、
・ 試料を通過させる工程、
・ 屈折率測定法によりIHP濃度を測定する工程。
―細胞外媒体の存在下で赤血球細胞を溶解する工程、
―ヘモグロビンおよび細胞の破片を欠き、IHPを含む画分を得る工程、
―この画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―合計IHP含有量を決定する工程、
を含むことができる。
―細胞外媒体を除去し、赤血球細胞画分を回収する工程、
―赤血球細胞を溶解する工程、
―ヘモグロビンおよび細胞の破片を欠き、IHPを含む画分を得る工程、
―この画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―赤血球内IHP含有量を決定する工程、
を含むことができる。
―細胞外画分を回収する工程、
―この細胞外画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―細胞外IHP含有量を決定する工程、
を含むことができる。
[細胞内IHP]={[合計IHP]×100-[細胞外IHP]×(100-ヘマトクリット値)}/ヘマトクリット値
―0.1〜1μmol/mlのFe(III)の試薬、特に、0.25〜0.6μmol/mlの試薬、好ましくは、0.3〜0.4μmol/mlの試薬、
―過剰のトリシアネート、特に、10〜50μmol/mlのトリシアネート、好ましくは20〜40μmol/ml、より好ましくは、30〜40μmol/mlのトリシアネート。
―このような懸濁液または溶液、特にIHPを封入した赤血球細胞の懸濁液を得る、または調製する工程、
―この懸濁液またはこの溶液を示す試料を除去する工程、
―本発明のアッセイ方法を用いて試料中のIHPをアッセイする工程、
―患者のために処方した用量を遵守する方法で投与するために、濃度データに基づいて、懸濁液または溶液の、特に赤血球細胞の懸濁液の量を計算する工程、
―前記患者へこの量を投与する工程。
塩化鉄(III)溶液の調製:20mgの塩化鉄(III)を40mlの蒸留水に溶解した(0.5mg/ml)。
18.75%溶液:3mlの6.1N TCA(100%)+13mlの蒸留水
9.375%溶液:10mlの18.75%TCA溶液+10mlの蒸留水
7.5%溶液:15mlの6.1N TCA溶液(100%)+185mlの蒸留水
24%溶液:6mlの6.1N TCA溶液(100%)+19mlの蒸留水
12%溶液:10mlの24%TCA溶液+10mlの蒸留水
6%溶液:15mlの6.1N TCA溶液(100%)+235mlの蒸留水
1)アッセイされる試料の性質
細胞内IHPを決定するために、試料中の合計IHP(RBC-IHP)および上清(細胞外媒体)中のIHP含有量がアッセイされる。上清は、1000g、4℃、10分間の、RBC-IHPの遠心分離により得られる。また、アッセイされる試料はIHPの水性溶液であることができ、それはその後、いかなる抽出も経るべきではない。
<試料調製>
RBC-IHP(50μl)および上清(50μl)を、-20℃で30分間凍結する。周辺温度へ再加熱した後、試料を細胞を溶解するために蒸留水で希釈し、IHPをトリクロロ酢酸を用いた酸性条件下で抽出する。試料の性質により適用される希釈は異なる。様々な濃度のトリクロロ酢酸(TCA)溶液を試料の調製に使用することができる。
1mM溶液の調製
20μlの45mM IHP溶液(実施例1を参照のこと)を880μlの7.5%トリクロロ酢酸と混合する。
光度検出のために、300μlの(例えば実施例1において調製された)着色試薬を150μlの各抽出上清および標準溶液へ、ならびにブランクへ添加する。暗所における15分間の撹拌およびインキュベーションの後に、溶液を10mmキュベットに入れ、吸光度を460nmにおいて測定する。各濃度(20-120μM)について、デルタ吸光度ΔOD=ODblank-ODstandardを決定する。ΔOD/[IHP]較正曲線をプロットし、直線回帰パラメーターを計算し、ΔOD=ODblank-ODsample測定に基づいて抽出上清中に存在するIHP量を決定するために使用する。RBC-IHPについて、赤血球細胞マトリクス由来の干渉に起因するノイズを、同様の透析工程を受け、かつ同様の条件下(RBC-LR)で50%ヘマトクリット値へ調整されている、赤血球細胞のアッセイを介して評価する。RBC-IHP上清について、アッセイで干渉は観察されなかった。
この方法により赤血球細胞マトリクス効果を取り除くことができ、従って、RBC-IHPに含まれるIHPのアッセイについてRBC-LRの生成を避けることができる。X mMのIHPを含むアッセイされる試料は50μl容積でアリコートされ、既知の濃度(C1、C2、C3、C4、C5など)のIHP(950μl)の様々な添加を、赤血球溶解工程中に行う。各チューブへの18.75%TCA(333μl)の添加、それに続く15000g、10分間の遠心分離により上清中のIHPを回収することができる。光度定量のために、(例えば実施例1で調製された)300μlの着色試薬を150μlの各抽出上清に添加する。参考チューブを300μlの着色試薬を150μlの6%TCAに添加することによって調製する。暗所における15分間の撹拌およびインキュベーションの後に、溶液を10mmキュベットに入れ、吸光度を460nmにおいて測定する。各点に関して、デルタ吸光度ΔOD=ODreference-ODsampleを決定する。ΔOD/添加した[IHP]の較正曲線をプロットする。曲線が線型のの直線ではない場合、最も高い濃度の点を7.5%トリクロロ酢酸中で希釈し、再度アッセイする。直線と(絶対値における)x-軸との間の交差点は、直接的に初期試料に含まれたIHPの値Xを与える。
RBC-IHP中の、および細胞外媒体におけるIHP濃度を、例えば実施例2で記載されたように決定する。細胞内IHPを計算するために、以下の等式を適用する:
[細胞内IHP]={[IHP]total×100-[IHP]extracellular)×(100-ヘマトクリット値)}/ヘマトクリット値
1)着色試薬の安定性
着色試薬を実施例1で示したように調製した。その安定性を460nmで300分間、光度計により研究した。結果は、使用の少なくとも40分前に調製するのが好ましく、それから着色試薬は少なくとも4時間安定であり、4時間ですべての分析を行うことが可能であることを示した。
IHP範囲の直線性を20〜120μM IHP(着色試薬に接触させる前の濃度)の範囲にわたって研究した。例えば実施例2のように調製した、各範囲点について150μlを、300μlの着色試薬と混合し、範囲を実施例2に示したようにプロットした。フィッシャー検定(Fisher test)は較正範囲が有効であることを示した。
2.5倍容積の蒸留水および3.5倍容積の9.375%TCAを用いた従来の抽出を、最適化された重複パーセンテージを得るために最適化した。様々なIHP含有量を含む、より大きな容積(19倍容積)の、浸透圧の無い(non-osmolar)水性溶液を、RCB+様々なIHP濃度のIHPの懸濁液の抽出をモデル化するために用いた。終濃度7.5%で使用した濃縮された18.5%TCAの使用により、あまり試料を希釈せず、アッセイ感度の喪失を避けることができる。実施例2に記載されたプロトコルに従い、試料をアッセイした。二つの抽出法を比較した結果を以下に示す。
試料を様々な温度(6℃、22℃、および35℃)でアッセイした。方法が温度の変化に対してロバストであることが判明した。
定量化および検出限界をICHの推奨に従って決定した。これについて、8つのブランク(7.5%TCA)を調製し、範囲を、その直線範囲(20〜120μM)中で研究した。着色試薬との混合の後、ブランクおよび範囲の点を、実施例2で記載したように分光光度計上で分析した。以下のICH式:
に従ってLDおよびLQを決定できるように、得られたODの標準偏差を計算した。
―上清LD=25μM;LQ=74μM
―合計LD=94μM;LQ=283μM。
1)RBC-LRマトリクスのアッセイによる赤血球細胞マトリクスに関連した較正範囲およびノイズの除去を伴う方法を用いた結果の実施例
以下の表中の値を用いたIHP較正直線のプロット(図1):
アッセイする試料を50μl容積にアリコートし、実施例2に詳細に記載したように処理する(計量添加法)。添加の表を以下に示す:
較正範囲によるアッセイを用いた実施例
IHPを封入したRBCのアッセイを部分的に、生化学機器(MaxMat)上で自動化した。着色試薬(試薬)、7.5%TCA(希釈剤)および1mM IHP貯蔵溶液(標準)を実施例1のように調製し、その後、自動化デバイスのプラットホーム上に設置した。アッセイする試料を実施例2に記載した工程により手動で調製した。アッセイする試料の抽出物由来の各上清を1.5mlチューブに移し、プラットホーム上に設置した。
―ポジティブモード
―ネガティブ直線回帰モード
―30サイクル
・サイクル1:調製した試料をサンプリングする工程:75μlおよび460nmのOD読み取り、
・サイクル2:着色試薬を添加する工程:150μl
・サイクル30:460nmでのOD読み取り。
a)方法の説明
塩化鉄(III)溶液の調製:49mgの塩化鉄(III)を、21.2mlの蒸留水に溶解した(2.31mg/ml)。
RBS-IHP(50μl)および上清(50μl)を-20℃で30分間凍結した。周辺温度まで再加熱した後、細胞を溶解するために試料を蒸留水に希釈し、トリクロロ酢酸を用いた酸性条件下でIHPを抽出した。適用された希釈は、試料によって様々であった。各試薬を以下の表に示されたように添加した:
光度検出のために、300μlの着色試薬を150μlの各抽出上清および標準溶液へ、ならびにブランクへ添加した。暗所における15分間の撹拌とインキュベーションの後に、溶液を10mmキュベットに入れ、吸光度を506nmで測定した。各濃度(100-500μl)に関して、デルタ吸光度ΔOD=ODblank-ODstandardを決定した。OD/[IHP]較正曲線をプロットし、直線回帰パラメーターを計算し、ΔOD=ODblank-ODsampleに基づいて抽出上清中に存在するIHPの量を決定するために使用した。RBC-IHPのために赤血球細胞マトリクス由来の干渉に起因するノイズを、着色試薬なしで同様の透析工程を経た、同様の条件(RBC-LR)下の50%ヘマトクリット値に調節されている、赤血球細胞のアッセイを介して評価した。
1mM溶液の調製
20μlの45mM IHP溶液(実施例1を参照のこと)を880μlの6%トリクロロ酢酸と混合した。
―合計試料をアッセイする工程
合計試料は、最終生成物(ヘマトクリット値50%におけるRBC)に含まれる合計IHPのアッセイに関する。
―RBC中に含まれたIHP量を評価する工程、
―上清LD=154μM、LQ=469μM
―合計LD=220μM、LQ=670μM
Claims (13)
- ヒトもしくは動物中に注射することができる生成物中において、またはこの生成物の画分中において、イノシトール六リン酸(IHP)をアッセイするための方法であって、金属化合物が、試料またはこの生成物の画分に添加され、かつ、続いて、前記金属化合物の存在するIHPとの錯体形成が検出され、その錯体形成によって、生成物中のまたはその画分中に存在するIHPがアッセイされる方法。
- 錯体形成により錯体が生成し、その錯体の着色が、金属化合物の着色と異なる、請求項1に記載の方法。
- 出発金属化合物と比較して、錯体の吸光度の変化が測定される、請求項2に記載の方法。
- 前記吸光度の変化が吸光光度分析法によって検出される、請求項3に記載の方法。
- 試薬が、Fe(III)化合物である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- Fe(III)化合物がFe(III)-チオシアネートである、請求項5に記載の方法。
- Fe(III)化合物がFe(III)-スルホサリチレートである、請求項5に記載の方法。
- 試料が赤血球細胞の懸濁液である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 合計IHPに対して適用され、
―赤血球細胞を溶解する工程、
―ヘモグロビンおよび細胞の破片を欠き、IHPを含む画分を得る工程、
―この画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―合計IHP含有量を決定する工程、
を含む、請求項8に記載の方法。 - 赤血球内IHPに適用され、
―細胞外媒体を除去し、赤血球細胞画分を回収する工程、
―赤血球細胞を溶解する工程、
―ヘモグロビンおよび細胞の破片を欠き、IHPを含む画分を得る工程、
―この画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―赤血球内IHP含有量を決定する工程、
を含む、請求項8に記載の方法。 - ヘモグロビンを、酸の存在下でタンパク質を沈殿する工程を用いて除去する、請求項9または10に記載の方法。
- 細胞外IHPに適用され、
―細胞外画分を回収する工程、
―この細胞外画分に、存在するIHPと錯体を形成する、既知の量の金属化合物を添加する工程、
―細胞外IHP含有量を決定する工程、
を含む、請求項8に記載の方法。 - 請求項12に規定される細胞外IHPの測定と請求項8に規定される合計IHPの測定とを組み合わせる請求項8に記載の方法であって、前記赤血球内IHP含有量が以下の等式を用いて得られる:
[細胞内IHP]={[合計IHP]×100-[細胞外IHP]×(100-ヘマトクリット値)}/ヘマトクリット値
方法。
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