JPH08294A - イノシトール三燐酸の測定方法及び試薬 - Google Patents
イノシトール三燐酸の測定方法及び試薬Info
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- JPH08294A JPH08294A JP16329394A JP16329394A JPH08294A JP H08294 A JPH08294 A JP H08294A JP 16329394 A JP16329394 A JP 16329394A JP 16329394 A JP16329394 A JP 16329394A JP H08294 A JPH08294 A JP H08294A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来の方法に比べて、高感度にイノシトール
三燐酸を測定することができる方法及びそのための試薬
を提供すること。 【構成】 遺伝子組換えにより生産されたフォスフォリ
パーゼＣδ１とイノシトール三燐酸との特異的結合を利
用してイノシトール三燐酸を測定する、イノシトール三
燐酸の測定方法を提供した。また、遺伝子組換えにより
生産されたフォスフォリパーゼＣδ１から成るイノシト
ール三燐酸測定試薬を提供した。
三燐酸を測定することができる方法及びそのための試薬
を提供すること。 【構成】 遺伝子組換えにより生産されたフォスフォリ
パーゼＣδ１とイノシトール三燐酸との特異的結合を利
用してイノシトール三燐酸を測定する、イノシトール三
燐酸の測定方法を提供した。また、遺伝子組換えにより
生産されたフォスフォリパーゼＣδ１から成るイノシト
ール三燐酸測定試薬を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、イノシトール三燐酸の
測定方法及び試薬に関する。
測定方法及び試薬に関する。
【０００２】イノシトール三燐酸は、細胞内の二次情報
伝達物質（second messenger) であり、ホルモンや成長
因子などが細胞表面にある受容体に結合すると、細胞膜
の燐脂質から合成される。細胞膜で生合成されたイノシ
トール三燐酸は、細胞膜を拡散し小胞体内のイノシトー
ル三燐酸受容体と結合し、細胞質内にカルシウムイオン
を放出することが明らかにされている。イノシトール三
燐酸は、種々の生理現象の過程で合成されることがわか
っており、生体内のイノシトール三燐酸を測定して種々
の研究が行われている。
伝達物質（second messenger) であり、ホルモンや成長
因子などが細胞表面にある受容体に結合すると、細胞膜
の燐脂質から合成される。細胞膜で生合成されたイノシ
トール三燐酸は、細胞膜を拡散し小胞体内のイノシトー
ル三燐酸受容体と結合し、細胞質内にカルシウムイオン
を放出することが明らかにされている。イノシトール三
燐酸は、種々の生理現象の過程で合成されることがわか
っており、生体内のイノシトール三燐酸を測定して種々
の研究が行われている。
【０００３】現在、イノシトール三燐酸を測定するため
の試薬として、イノシトール三燐酸受容体が用いられ、
市販されている（アマシャム社製）。イノシトール三燐
酸受容体は副腎髄質膜にあり、イノシトール三燐酸と特
異的に結合する。前記市販キットは副腎髄質膜の膜分画
を用いてイノシトール三燐酸の測定を行うものである。
の試薬として、イノシトール三燐酸受容体が用いられ、
市販されている（アマシャム社製）。イノシトール三燐
酸受容体は副腎髄質膜にあり、イノシトール三燐酸と特
異的に結合する。前記市販キットは副腎髄質膜の膜分画
を用いてイノシトール三燐酸の測定を行うものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】イノシトール三燐酸を
測定するにあたり、その測定感度が高ければ微量のイノ
シトール三燐酸が測定できるのでより好ましいことは言
うまでもない。しかしながら、従来の副腎髄質膜の膜分
画には、他の蛋白又は酵素等が含まれており、イノシト
ール三燐酸とイノシトール三燐酸受容体との結合に影響
を与え、満足な感度が得られなかった。従って、本発明
の目的は、従来の方法に比べて、高感度にイノシトール
三燐酸を測定することができる方法及びそのための試薬
を提供することである。
測定するにあたり、その測定感度が高ければ微量のイノ
シトール三燐酸が測定できるのでより好ましいことは言
うまでもない。しかしながら、従来の副腎髄質膜の膜分
画には、他の蛋白又は酵素等が含まれており、イノシト
ール三燐酸とイノシトール三燐酸受容体との結合に影響
を与え、満足な感度が得られなかった。従って、本発明
の目的は、従来の方法に比べて、高感度にイノシトール
三燐酸を測定することができる方法及びそのための試薬
を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、遺伝子組換えにより生産されたフォスフォリ
パーゼＣδ１を用いると、天然型のイノシトール三燐酸
受容体を用いる従来法に比べて数百倍も高感度にイノシ
トール三燐酸を測定することができることを見出し本発
明を完成した。
究の結果、遺伝子組換えにより生産されたフォスフォリ
パーゼＣδ１を用いると、天然型のイノシトール三燐酸
受容体を用いる従来法に比べて数百倍も高感度にイノシ
トール三燐酸を測定することができることを見出し本発
明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、遺伝子組換えにより
生産されたフォスフォリパーゼＣδ１とイノシトール三
燐酸との特異的結合を利用してイノシトール三燐酸を測
定する、イノシトール三燐酸の測定方法を提供する。ま
た、本発明は、遺伝子組換えにより生産されたフォスフ
ォリパーゼＣδ１から成るイノシトール三燐酸測定試薬
を提供する。
生産されたフォスフォリパーゼＣδ１とイノシトール三
燐酸との特異的結合を利用してイノシトール三燐酸を測
定する、イノシトール三燐酸の測定方法を提供する。ま
た、本発明は、遺伝子組換えにより生産されたフォスフ
ォリパーゼＣδ１から成るイノシトール三燐酸測定試薬
を提供する。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】フォスフォリパーゼＣδ１はリン脂質加水
分解酵素の一種であり、ホスファチジルイノシトールを
特異的に加水分解し、リン脂質の代謝回転を促す。ホル
モンや生理活性物質が細胞膜の受容体と結合する際に起
こる、細胞シグナル伝達に関与する酵素である。フォス
フォリパーゼＣδ１はイノシトール三燐酸と特異的に結
合するので、本発明はこの特異的結合を利用してイノシ
トール三燐酸を測定している。
分解酵素の一種であり、ホスファチジルイノシトールを
特異的に加水分解し、リン脂質の代謝回転を促す。ホル
モンや生理活性物質が細胞膜の受容体と結合する際に起
こる、細胞シグナル伝達に関与する酵素である。フォス
フォリパーゼＣδ１はイノシトール三燐酸と特異的に結
合するので、本発明はこの特異的結合を利用してイノシ
トール三燐酸を測定している。
【０００９】本発明の方法に用いるフォスフォリパーゼ
Ｃδ１は、遺伝子組換えにより生産されたものである。
フォスフォリパーゼＣδ１自体は既にクローニングされ
ており、遺伝子組換えにより生産されており、また、フ
ォスフォリパーゼＣδ１遺伝子の全配列は既に決定され
ている（文献：Cell 54, 161-169 (1988), Rhee S.G.et
al）。すなわち、本発明の方法に用いられる遺伝子組
換えフォスフォリパーゼＣδ１は、このような公知の方
法によっても得ることができるし、下記製造例にもフォ
リパーゼＣδ１の生産方法の一例が詳述されている。す
なわち、フォスフォリパーゼＣδ１の塩基配列は既に公
知であるので、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣ
Ｒ法により容易にフォスフォリパーゼＣδ１遺伝子を増
幅させることができる。この増幅されたフォスフォリパ
ーゼＣδ１遺伝子を市販の発現ベクターに組み込み、大
腸菌等の宿主で発現させることにより遺伝子組換え法に
より生産されたフォスフォリパーゼＣδ１を得ることが
できる。なお、フォスフォリパーゼＣδ１遺伝子は比較
的大きいので、ＰＣＲ法の効率を高めるため、下記製造
例に示すように遺伝子を２分割して増幅させ、あとでラ
イゲースで連結することにより完全長フォスフォリパー
ゼＣδ１遺伝子を得ることができる。
Ｃδ１は、遺伝子組換えにより生産されたものである。
フォスフォリパーゼＣδ１自体は既にクローニングされ
ており、遺伝子組換えにより生産されており、また、フ
ォスフォリパーゼＣδ１遺伝子の全配列は既に決定され
ている（文献：Cell 54, 161-169 (1988), Rhee S.G.et
al）。すなわち、本発明の方法に用いられる遺伝子組
換えフォスフォリパーゼＣδ１は、このような公知の方
法によっても得ることができるし、下記製造例にもフォ
リパーゼＣδ１の生産方法の一例が詳述されている。す
なわち、フォスフォリパーゼＣδ１の塩基配列は既に公
知であるので、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣ
Ｒ法により容易にフォスフォリパーゼＣδ１遺伝子を増
幅させることができる。この増幅されたフォスフォリパ
ーゼＣδ１遺伝子を市販の発現ベクターに組み込み、大
腸菌等の宿主で発現させることにより遺伝子組換え法に
より生産されたフォスフォリパーゼＣδ１を得ることが
できる。なお、フォスフォリパーゼＣδ１遺伝子は比較
的大きいので、ＰＣＲ法の効率を高めるため、下記製造
例に示すように遺伝子を２分割して増幅させ、あとでラ
イゲースで連結することにより完全長フォスフォリパー
ゼＣδ１遺伝子を得ることができる。
【００１０】本発明の方法で用いられるフォスフォリパ
ーゼＣδ１は、遺伝子組換えにより生産されたものであ
れば単一のタンパク質であってもよいし、フォスフォリ
パーゼＣδ１のＮ末端側に他のタンパク質が結合した融
合タンパク質であってもよい。下記製造例では、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼがＮ末端に結合した融
合タンパク質が生産されており、このような融合タンパ
ク質も本発明の方法において好ましく用いることができ
る。
ーゼＣδ１は、遺伝子組換えにより生産されたものであ
れば単一のタンパク質であってもよいし、フォスフォリ
パーゼＣδ１のＮ末端側に他のタンパク質が結合した融
合タンパク質であってもよい。下記製造例では、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼがＮ末端に結合した融
合タンパク質が生産されており、このような融合タンパ
ク質も本発明の方法において好ましく用いることができ
る。
【００１１】イノシトール三燐酸の測定自体はイノシト
ール三燐酸とフォスフォリパーゼＣδ１との特異的結合
を利用して行うことができる。イノシトール三燐酸とフ
ォスフォリパーゼＣδ１との結合は、免疫反応ではない
が、特異的に結合する点が免疫反応と共通であるので、
従来の免疫測定方法と同様な手法によりイノシトール三
燐酸を測定することができる。例えば、下記実施例で
は、競合法による放射測定により検体中のイノシトール
三燐酸が測定されている。すなわち、この方法では、フ
ォスフォリパーゼＣδ１を固相担体に不動化し、該不動
化フォスフォリパーゼＣδ１と、標識した既知濃度のイ
ノシトール三燐酸と、検体とを接触させ、固相を洗浄
し、固相に結合されたイノシトール三燐酸を測定する。
検体中に種々の既知濃度のイノシトール三燐酸を含ませ
てこの測定を行うことにより検量線を作成する。未知濃
度のイノシトール三燐酸を含む検体について同様に測定
を行い、測定された放射能を上記検量線と照合すること
により検体中のイノシトール三燐酸の濃度を測定するこ
とができる。なお、イノシトール三燐酸の２位の水酸基
はフォスフォリパーゼＣδ１との結合に全く影響がない
ので、この官能基を使用してイノシトール三燐酸をアイ
ソトープ、酵素、蛍光等で標識することができる。ま
た、この官能基を使用してイノシトール三燐酸を固相に
結合し、上記と同様な競合法を行うこともできる。さら
に、既知濃度のイノシトール三燐酸と検体中のイノシト
ール三燐酸をフォスフォリパーゼＣδ１と液相で反応
後、抗フォスフォリパーゼＣδ１抗体でフォスフォリパ
ーゼＣδ１とフォスフォリパーゼＣδ１−イノシトール
三燐酸複合物を沈降させてフリーのイノシトール三燐酸
と分離し、このフリーのイノシトール三燐酸を測定する
ことにより、検体中のイノシトール三燐酸を定量するこ
ともできる。
ール三燐酸とフォスフォリパーゼＣδ１との特異的結合
を利用して行うことができる。イノシトール三燐酸とフ
ォスフォリパーゼＣδ１との結合は、免疫反応ではない
が、特異的に結合する点が免疫反応と共通であるので、
従来の免疫測定方法と同様な手法によりイノシトール三
燐酸を測定することができる。例えば、下記実施例で
は、競合法による放射測定により検体中のイノシトール
三燐酸が測定されている。すなわち、この方法では、フ
ォスフォリパーゼＣδ１を固相担体に不動化し、該不動
化フォスフォリパーゼＣδ１と、標識した既知濃度のイ
ノシトール三燐酸と、検体とを接触させ、固相を洗浄
し、固相に結合されたイノシトール三燐酸を測定する。
検体中に種々の既知濃度のイノシトール三燐酸を含ませ
てこの測定を行うことにより検量線を作成する。未知濃
度のイノシトール三燐酸を含む検体について同様に測定
を行い、測定された放射能を上記検量線と照合すること
により検体中のイノシトール三燐酸の濃度を測定するこ
とができる。なお、イノシトール三燐酸の２位の水酸基
はフォスフォリパーゼＣδ１との結合に全く影響がない
ので、この官能基を使用してイノシトール三燐酸をアイ
ソトープ、酵素、蛍光等で標識することができる。ま
た、この官能基を使用してイノシトール三燐酸を固相に
結合し、上記と同様な競合法を行うこともできる。さら
に、既知濃度のイノシトール三燐酸と検体中のイノシト
ール三燐酸をフォスフォリパーゼＣδ１と液相で反応
後、抗フォスフォリパーゼＣδ１抗体でフォスフォリパ
ーゼＣδ１とフォスフォリパーゼＣδ１−イノシトール
三燐酸複合物を沈降させてフリーのイノシトール三燐酸
と分離し、このフリーのイノシトール三燐酸を測定する
ことにより、検体中のイノシトール三燐酸を定量するこ
ともできる。
【００１２】
【実施例】以下製造例、ラジオアクティブイムノアッセ
イ系及びレセプターッセイ系を用いたイノシトール三燐
酸測定例に関連して本発明を具体的に説明する。
イ系及びレセプターッセイ系を用いたイノシトール三燐
酸測定例に関連して本発明を具体的に説明する。
【００１３】製造例 １．イノシトール三燐酸との結合活性を有するフォスフ
ォリパーゼＣδ１をコードするＤＮＡの調製 配列既知のフォスフォリパーゼＣδ１をコードする遺伝
子の制限酵素地図をもとに図１に示した各々２つの遺伝
子断片をポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）
にて増幅し、制限酵素Acc I で切断後、この２つの断片
をライゲースで結合して全長の遺伝子を得た。各断片を
ＰＣＲで増幅するにあたって図２に示す４本の一本鎖Ｄ
ＮＡプライマーをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシ
ステム社モデル４３０）を用いて合成し、また、ラット
心臓５’ストレッチｃＤＮＡライブラリー（東洋紡社
製）を鋳型として用いた。最終的に得られた遺伝子は図
３ないし図５に示すように５’末端及び３’末端にHind
IIIの制限酵素認識部位を付加してある。
ォリパーゼＣδ１をコードするＤＮＡの調製 配列既知のフォスフォリパーゼＣδ１をコードする遺伝
子の制限酵素地図をもとに図１に示した各々２つの遺伝
子断片をポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）
にて増幅し、制限酵素Acc I で切断後、この２つの断片
をライゲースで結合して全長の遺伝子を得た。各断片を
ＰＣＲで増幅するにあたって図２に示す４本の一本鎖Ｄ
ＮＡプライマーをＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシ
ステム社モデル４３０）を用いて合成し、また、ラット
心臓５’ストレッチｃＤＮＡライブラリー（東洋紡社
製）を鋳型として用いた。最終的に得られた遺伝子は図
３ないし図５に示すように５’末端及び３’末端にHind
IIIの制限酵素認識部位を付加してある。
【００１４】２．フォスフォリパーゼＣδ１をコードす
る遺伝子の発現ベクターへの組み込み 図６を参照しながら製造例１に記載したように調製した
フォスフォリパーゼＣδ１をコードする遺伝子の発現ベ
クターへの組み込み方について説明する。発現ベクター
として、大腸菌で外来遺伝子産物を発現するためにtac
プロモーターを持ち、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼを発現するようデザインされたプラスミドpGEX3X
（ファルマシア社製）を使用した。
る遺伝子の発現ベクターへの組み込み 図６を参照しながら製造例１に記載したように調製した
フォスフォリパーゼＣδ１をコードする遺伝子の発現ベ
クターへの組み込み方について説明する。発現ベクター
として、大腸菌で外来遺伝子産物を発現するためにtac
プロモーターを持ち、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼを発現するようデザインされたプラスミドpGEX3X
（ファルマシア社製）を使用した。
【００１５】グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと
フォスフォリパーゼＣδ１の融合蛋白質を発現する組換
えプラスミドを再構築するため、pGEX3Xを制限酵素Sma
I で切断し、Hind IIIリンカー（10 mer: d(pCCAAGCTTG
G)) を導入しpGEX3XH を作製した。さらにこのpGEX3XH
とフォスフォリパーゼＣδ１をコードする遺伝子を各々
制限酵素Hind IIIで切断しＤＮＡライゲースを用いて両
遺伝子を結合してできたプラスミドをpGEX3XH-PLC δ1
と命名した。
フォスフォリパーゼＣδ１の融合蛋白質を発現する組換
えプラスミドを再構築するため、pGEX3Xを制限酵素Sma
I で切断し、Hind IIIリンカー（10 mer: d(pCCAAGCTTG
G)) を導入しpGEX3XH を作製した。さらにこのpGEX3XH
とフォスフォリパーゼＣδ１をコードする遺伝子を各々
制限酵素Hind IIIで切断しＤＮＡライゲースを用いて両
遺伝子を結合してできたプラスミドをpGEX3XH-PLC δ1
と命名した。
【００１６】３．フォスフォリパーゼＣδ１の融合蛋白
質の発現 大腸菌を形質転換するためにフォスフォリパーゼＣδ１
をコードする遺伝子を持つ組換えプラスミド（製造例２
で記載したように調製されたpGEX3XH-PLC δ1)を大腸菌
（JM109 株）に塩化カルシウム法により導入した。得ら
れた大腸菌トランスフォーマントをE. coli PLC δ１と
命名した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培
地でトランスフォーマントを３７℃で一晩振盪培養し
た。アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地でこの
培養液を１００倍に希釈して３７℃で４時間振盪培養
後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）を最終濃度１５μｇ／ｍｌになるように添加した。
さらに３０分間振盪培養を続け得られた培養液から遠心
操作（8000 rpm, ４℃、１５分）で菌体を回収した。菌
体の一部をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にて解析
したところ想定した融合蛋白が全蛋白量のおよそ３０％
程度発現していた。また、その溶解性を調べるために菌
体の一部を超音波破砕して、その沈殿と上清とを分離し
て各画分をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で解析し
た。ほとんどの融合蛋白は上清に存在しており可溶性で
あった。発現したこのグルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼとフォスフォリパーゼＣδ１との融合蛋白をＧＳ
Ｔ−ＰＬＣδ１と命名し、その構造を図７に示す。
質の発現 大腸菌を形質転換するためにフォスフォリパーゼＣδ１
をコードする遺伝子を持つ組換えプラスミド（製造例２
で記載したように調製されたpGEX3XH-PLC δ1)を大腸菌
（JM109 株）に塩化カルシウム法により導入した。得ら
れた大腸菌トランスフォーマントをE. coli PLC δ１と
命名した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培
地でトランスフォーマントを３７℃で一晩振盪培養し
た。アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地でこの
培養液を１００倍に希釈して３７℃で４時間振盪培養
後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）を最終濃度１５μｇ／ｍｌになるように添加した。
さらに３０分間振盪培養を続け得られた培養液から遠心
操作（8000 rpm, ４℃、１５分）で菌体を回収した。菌
体の一部をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にて解析
したところ想定した融合蛋白が全蛋白量のおよそ３０％
程度発現していた。また、その溶解性を調べるために菌
体の一部を超音波破砕して、その沈殿と上清とを分離し
て各画分をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で解析し
た。ほとんどの融合蛋白は上清に存在しており可溶性で
あった。発現したこのグルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼとフォスフォリパーゼＣδ１との融合蛋白をＧＳ
Ｔ−ＰＬＣδ１と命名し、その構造を図７に示す。
【００１７】４．ＧＳＴ−ＰＬＣδ１固相化セファロー
スの作製 製造例３で得られた菌体をリシスバッファー（80 mM Tr
is HCl pH8 - 1 mM EDTA）で５倍に希釈し超音波破砕装
置を用いて破砕し超遠心操作（37,000 rpm、３０分）に
より可溶性の蛋白画分を得た。この蛋白画分１００ｍｌ
にグルタチオン−Ｓ−セファロース４Ｂ（ファルマシア
社製）を２ｍｌの割合で添加し氷上で２時間振盪した。
さらに遠心操作（3000 rpm、５分、４℃）後、上清を除
去し、リシスバッファーを加える操作を繰り返すことに
よりグルタチオン−Ｓ−セファロース４Ｂに結合してい
ない蛋白等を除去して目的とするＧＳＴ−ＰＬＣδ１固
相化セファロースを得た。
スの作製 製造例３で得られた菌体をリシスバッファー（80 mM Tr
is HCl pH8 - 1 mM EDTA）で５倍に希釈し超音波破砕装
置を用いて破砕し超遠心操作（37,000 rpm、３０分）に
より可溶性の蛋白画分を得た。この蛋白画分１００ｍｌ
にグルタチオン−Ｓ−セファロース４Ｂ（ファルマシア
社製）を２ｍｌの割合で添加し氷上で２時間振盪した。
さらに遠心操作（3000 rpm、５分、４℃）後、上清を除
去し、リシスバッファーを加える操作を繰り返すことに
よりグルタチオン−Ｓ−セファロース４Ｂに結合してい
ない蛋白等を除去して目的とするＧＳＴ−ＰＬＣδ１固
相化セファロースを得た。
【００１８】実施例１ イノシトール三燐酸の測定 上記製造例で得られたＧＳＴ−ＰＬＣδ１固相化セファ
ロースを用いてレセプターアッセイによりイノシトール
三燐酸量の測定を行った。その方法としては結合バッフ
ァー（例えば250 mM Tris HCl pH 8 - 5 mM EDTA) 10μ
l 、ＧＳＴ−ＰＬＣδ１固相化セファロース２０μｌ、
トリチウム標識されたイノシトール三燐酸（1.48 MBq/m
l, 37 GBp/mM)10 μｌと被検物質である非標識イノシト
ール三燐酸１０μｌを加え氷上で１５分放置し、遠心操
作後（日立Himac CT15D 15000 rpm 、３分）、上清を除
去することにより固相に結合していない、イノシトール
三燐酸を除去した。さらに結合バッファー５００μｌを
加え、遠心操作（同上）後上清を除去する操作を３回繰
り返して固相を洗浄後液体シンチレーションカウンター
にてその放射活性を測定した。
ロースを用いてレセプターアッセイによりイノシトール
三燐酸量の測定を行った。その方法としては結合バッフ
ァー（例えば250 mM Tris HCl pH 8 - 5 mM EDTA) 10μ
l 、ＧＳＴ−ＰＬＣδ１固相化セファロース２０μｌ、
トリチウム標識されたイノシトール三燐酸（1.48 MBq/m
l, 37 GBp/mM)10 μｌと被検物質である非標識イノシト
ール三燐酸１０μｌを加え氷上で１５分放置し、遠心操
作後（日立Himac CT15D 15000 rpm 、３分）、上清を除
去することにより固相に結合していない、イノシトール
三燐酸を除去した。さらに結合バッファー５００μｌを
加え、遠心操作（同上）後上清を除去する操作を３回繰
り返して固相を洗浄後液体シンチレーションカウンター
にてその放射活性を測定した。
【００１９】図８に本測定法により作成した検量線と、
比較のためにアマシャム社製イノシトール三燐酸測定シ
ステムを用いて作成した検量線を示す。組換え蛋白であ
るＧＳＴ−ＰＬＣδ１固相化セファロースを用いた本測
定系と牛副腎由来の膜抽出画分を使用した従来の測定系
とを比較すると、トリチウム標識されたイノシトール三
燐酸の結合量を５０％阻害する非標識イノシトール三燐
酸の濃度はＧＳＴ−ＰＬＣδ１を用いた場合は0.008 pm
ol/tube で牛副腎由来膜抽出画分を用いた場合の2.64 p
mol/tubeよりも感度は３００倍程高かった。また、その
測定範囲としてＰＬＣδ１を用いた場合はＢ／Ｂ０の範
囲で１０〜９０％、非標識イノシトール三燐酸の濃度で
3.0 x 10-6〜0.46 pmol/tubeであるのに対して、牛副腎
由来膜抽出画分を用いた場合ではそれぞれ１０〜９５
％、1.9 x 10-1〜2.5 x 101 pmol/tube でＰＬＣδ１を
用いた場合の方が測定範囲が広かった。
比較のためにアマシャム社製イノシトール三燐酸測定シ
ステムを用いて作成した検量線を示す。組換え蛋白であ
るＧＳＴ−ＰＬＣδ１固相化セファロースを用いた本測
定系と牛副腎由来の膜抽出画分を使用した従来の測定系
とを比較すると、トリチウム標識されたイノシトール三
燐酸の結合量を５０％阻害する非標識イノシトール三燐
酸の濃度はＧＳＴ−ＰＬＣδ１を用いた場合は0.008 pm
ol/tube で牛副腎由来膜抽出画分を用いた場合の2.64 p
mol/tubeよりも感度は３００倍程高かった。また、その
測定範囲としてＰＬＣδ１を用いた場合はＢ／Ｂ０の範
囲で１０〜９０％、非標識イノシトール三燐酸の濃度で
3.0 x 10-6〜0.46 pmol/tubeであるのに対して、牛副腎
由来膜抽出画分を用いた場合ではそれぞれ１０〜９５
％、1.9 x 10-1〜2.5 x 101 pmol/tube でＰＬＣδ１を
用いた場合の方が測定範囲が広かった。
【００２０】
【発明の効果】本発明の方法により、従来法に比べては
るかに高感度にイノシトール三燐酸が測定できるように
なった。
るかに高感度にイノシトール三燐酸が測定できるように
なった。
【図１】本発明の方法に用いられるフォスフォリパーゼ
Ｃδ１遺伝子を調製する方法の一例の概略を示す図であ
る。
Ｃδ１遺伝子を調製する方法の一例の概略を示す図であ
る。
【図２】本発明の方法に用いられるフォスフォリパーゼ
Ｃδ１遺伝子を調製する方法の一例において、ＰＣＲ法
により該遺伝子を増幅する際に使用するプライマーのＤ
ＮＡ配列を示す図である。
Ｃδ１遺伝子を調製する方法の一例において、ＰＣＲ法
により該遺伝子を増幅する際に使用するプライマーのＤ
ＮＡ配列を示す図である。
【図３】本発明の方法に用いられるフォスフォリパーゼ
Ｃδ１遺伝子のＤＮＡ配列を示す図である。
Ｃδ１遺伝子のＤＮＡ配列を示す図である。
【図４】図３に示す配列の続きを示す図である。
【図５】図４に示す配列の続きを示す図である。
【図６】本発明の方法に用いられる、グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼとフォスフォリパーゼＣδ１の融
合蛋白を発現するベクターの作製法の一例の概略を示す
図である。
−トランスフェラーゼとフォスフォリパーゼＣδ１の融
合蛋白を発現するベクターの作製法の一例の概略を示す
図である。
【図７】本発明の方法に用いられる、グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼとフォスフォリパーゼＣδ１の融
合蛋白の構造を示す図である。
−トランスフェラーゼとフォスフォリパーゼＣδ１の融
合蛋白の構造を示す図である。
【図８】本発明の方法と従来の方法によりレセプターア
ッセイで作製したイノシトール三燐酸の検量線を示す図
である。
ッセイで作製したイノシトール三燐酸の検量線を示す図
である。
Claims (5)
- 【請求項１】 遺伝子組換えにより生産されたフォスフ
ォリパーゼＣδ１とイノシトール三燐酸との特異的結合
を利用してイノシトール三燐酸を測定する、イノシトー
ル三燐酸の測定方法。 - 【請求項２】 前記遺伝子組換えにより生産されたフォ
スフォリパーゼＣδ１は、そのＮ末端側に他のタンパク
質が結合した融合タンパク質の形態にある請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 前記他のタンパク質はグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼである請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 前記フォスフォリパーゼＣδ１を固相に
不動化し、該不動化フォスフォリパーゼＣδ１と、標識
した既知濃度のイノシトール三燐酸と、検体とを接触さ
せ、固相を洗浄し、固相に結合された標識イノシトール
三燐酸を測定することにより検体中のフォスフォリパー
ゼＣδ１を測定する請求項１ないし３のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項５】 遺伝子組換えにより生産されたフォスフ
ォリパーゼＣδ１から成るイノシトール三燐酸測定試
薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16329394A JPH08294A (ja) | 1994-06-23 | 1994-06-23 | イノシトール三燐酸の測定方法及び試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16329394A JPH08294A (ja) | 1994-06-23 | 1994-06-23 | イノシトール三燐酸の測定方法及び試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08294A true JPH08294A (ja) | 1996-01-09 |
Family
ID=15771079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16329394A Pending JPH08294A (ja) | 1994-06-23 | 1994-06-23 | イノシトール三燐酸の測定方法及び試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08294A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000011213A1 (fr) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Japan Science And Technology Corporation | Sonde fluorescente et procede pour determiner la quantite de triphosphate d'inositol a l'aide de cette sonde |
| JP2012522978A (ja) * | 2009-04-03 | 2012-09-27 | エリテック・ファルマ | イノシトール六リン酸（ｉｈｐ）をアッセイするための方法 |
-
1994
- 1994-06-23 JP JP16329394A patent/JPH08294A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000011213A1 (fr) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Japan Science And Technology Corporation | Sonde fluorescente et procede pour determiner la quantite de triphosphate d'inositol a l'aide de cette sonde |
| JP2012522978A (ja) * | 2009-04-03 | 2012-09-27 | エリテック・ファルマ | イノシトール六リン酸（ｉｈｐ）をアッセイするための方法 |
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