ES2605236T3 - Método - Google Patents
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Abstract
Un método para la detección de una actividad fitasa o una actividad proteasa que comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio que comprende una fase continua y una fase dispersa, en donde la fase dispersa comprende: i) un primer componente que es un fitato o un ácido fítico ii) un segundo componente que es una proteína en donde el primer componente y el segundo componente se mantienen juntos en un complejo por medio de una o más interacciones intermoleculares; en donde la fase dispersa proporciona una propiedad detectable al medio; (b) proporcionar una muestra que comprende o se sospecha que comprende actividad fitasa y/o actividad proteasa, en donde la actividad fitasa y/o proteasa son capaces de afectar a la fase dispersa causando un cambio en la propiedad detectable del medio; (c) poner en contacto el medio con la muestra; (d) determinar si hay un cambio detectable en la propiedad detectable del medio.
Description
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DESCRIPCION
Metodo
Campo de la presente invencion
La presente invencion se refiere a un metodo. En particular, la presente invencion se refiere a un metodo para detectar actividad enzimatica.
Mas concretamente, en algunos aspectos, la presente invencion se refiere a un metodo de deteccion de actividad fitasa o de la actividad proteasa utilizando una fase dispersa que comprende un componente polivalente y un componente ionico tal como una protema o un acido graso, en donde la fase dispersa se mantiene unida por una interaccion intermolecular, a la utilizacion de semejante fase dispersa en un metodo para la deteccion de la actividad enzimatica y a un kit para llevar a cabo tal metodo.
Antecedentes de la presente invencion
Se conocen en la tecnica diversos metodos para la deteccion de la actividad enzimatica, tambien llamados analisis de actividad enzimatica.
Los ejemplos de los analisis de actividad enzimatica conocidos son los analisis para la deteccion de actividad fitasa y de actividad proteasa. Sin embargo, los metodos de analisis de la actividad fitasa conocidos se basan en la liberacion de fosfato inorganico por la fitasa a partir del fosfato de inositol. La cantidad de fosfato liberada a partir del fosfato de inositol por la fitasa se puede analizar por medio de numerosos metodos conocidos (por ejemplo, veanse Fiske (1925) y Lowry (1946)). Los kits para la realizacion de analisis de la actividad fitasa basados en la liberacion de fosfato inorganico a partir de fosfato de inositol estan disponibles comercialmente (por ejemplo, el analisis de acido ftico (fitato)/fosforo total disponible de Megazyme Internacional Ireland Limited).
Existen varias desventajas de los metodos de analisis de la actividad fitasa conocidos. Una desventaja es que son metodos de analisis de punto final, lo que significa que la cantidad de fosfato inorganico solo se puede medir despues de que se haya detenido la reaccion enzimatica. Esto hace que sea diffcil realizar estudios cineticos de la actividad fitasa.
Otra desventaja de estos analisis conocidos es que el fondo del analisis se complica por el fosfato inorganico que existe de forma natural en las muestras biologicas o que se anade a las mismas. Puesto que el nivel de fosfato inorganico liberado por la fitasa se mide para evaluar la actividad fitasa, este nivel de fondo variable de fosfato inorganico puede hacer que los resultados sean variables y poco fiables, particularmente cuando se utiliza en muestras biologicas.
Una tercera desventaja de algunos metodos de la tecnica anterior es la naturaleza toxica de los reactivos utilizados, tales como el molibdato y el vanadio.
La actividad fitasa tambien se puede medir basandose en el analisis de la liberacion de inositol a partir del fosfato de inositol cuando este es degradado por la fitasa. El inositol se analiza utilizando inositol deshidrogenasa por metodos conocidos (por ejemplo, vease Prestwich (1991)).
La desventaja de este metodo es que se necesita una enzima adicional denominada fosfatasa para hidrolizar el monofosfato de inositol a inositol, ya que las fitasas comerciales tienen poca o ninguna actividad sobre el monofosfato de inositol. El inositol del analisis tambien puede ser problematico debido a que muchas muestras biologicas tienen altos niveles de fondo de inositol, que es uno de los principales polioles en muchos sistemas biologicos.
La actividad fitasa tambien se puede analizar utilizando fitato de calcio como sustrato a pH 5,5 o superior. El fitato de calcio tiene una cierta turbidez y la hidrolisis de este sustrato por la fitasa hace que la turbidez disminuya. El sustrato se puede anadir a un gel de agarosa de manera que la fitasa se pueda analizar utilizando el analisis de difusion en placa. La desventaja de este metodo es que la turbidez del fitato de calcio es baja, y no tiene turbidez a pH mas bajo. Ademas, el fitato de calcio no es un sustrato ideal para las fitasas acidas de histidina comerciales. Otra desventaja del analisis en placa es que los microbios que producen produciran falsos resultados ya que el acido producido disolvera el fitato de calcio formando de este modo halos claros (vease Howson y Davis 1983).
Un analisis de fitasa semi-cuantitativo basado en anticuerpos se describe en el documento WO2007001895. Este metodo utiliza anticuerpos que se pueden unir a la fitasa para analizar las fitasas. Sin embargo, un inconveniente de este metodo es que no puede diferenciar de manera fiable entre fitasa activa, parcialmente inactivada por calor e inactivada por calor, por ejemplo fitasa que ha sido inactivada por calor durante el proceso de alimentacion. Los otros inconvenientes de esta tecnologfa son que resulta costosa de desarrollar, consume mucho tiempo, los resultados no son fiables, y puede conducir a resultados positivos falsos. Los resultados falsos positivos indican o bien que hay fitasa presente cuando no la hay, o bien que la fitasa presente no esta activa. Esto puede conducir a la adicion de menos fitasa de la necesaria para proporcionar la cantidad requerida de actividad fitasa. Si no se
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encuentra presente suficiente actividad fitasa en el pienso, los animales alimentados con el piensos pueden no tener suficiente fosfato disponible.
Los piensos o los ingredientes para piensos o las mezclas de piensos (premezclas) pueden ser sometidos a ensayo para determinar si contienen fitasa y la cantidad de fitasa que contienen. Si no hay suficiente fitasa en el pienso o ingrediente para pienso, se puede anadir fitasa adicional. Los resultados falsos negativos en los ensayos de fitasa pueden conducir a que se anada al pienso un exceso de la fitasa, lo cual es costoso.
Existen muchos metodos conocidos para el analisis de la actividad proteasa. Muchos de ellos estan basados en peptidos sinteticos o analogos de peptidos a menudo marcados con cromoforos o fluoroforos. La ventaja de estos metodos es su alta sensibilidad y su capacidad para controlar la actividad proteasa cineticamente.
Una desventaja de estos metodos es que la informacion obtenida con peptidos sinteticos puede no estar relacionada con la obtenida con las protemas naturales con un alto grado de certeza ya que las protemas naturales a menudo tienen conformaciones complicadas que cambian con su entorno.
Otros metodos utilizan las protemas naturales como sustrato para detectar la actividad proteasa. La desventaja de utilizar protemas naturales como sustrato para proteasas en los metodos de la tecnica anterior es que el control de la hidrolisis de protemas se realiza generalmente por metodos indirectos. Esto significa que estos metodos son analisis de punto final que miden los productos de la reaccion solo despues de que esta se haya detenido. Estos metodos, portanto, no se prestan a realizar estudios cineticos sobre las protemas naturales.
Un ejemplo de un analisis de la actividad proteasa que se realiza utilizando una protema natural es un analisis de la actividad pepsina que se puede realizar utilizando hemoglobina como sustrato. La actividad pepsina puede estar relacionada con la liberacion de acido tricloroacetico (TCA), aminoacidos aromaticos solubles y peptidos. El metodo tiene que ser un analisis de punto final, porque la reaccion enzimatica ha dejado de utilizar TCA antes de que sus productos se puedan analizar.
Lo mismo se cumple para los analisis de proteasa utilizando casema, que a menudo se entrecruza con cromoforos. La reaccion tiene que ser detenida por la elevacion del pH con el fin de separar los cromoforos solubles del substrato insoluble (por ejemplo, vease
www.Megazyme.com).
www.Megazyme.com).
La presente invencion pretende proporcionar un metodo de analisis util. En particular, la presente invencion pretende proporcionar un metodo de analisis que es particularmente util en el ensayo de piensos o ingredientes para piensos o mezclas de piensos (premezcla) para identificar si contienen fitasa y/o proteasa y, en algunos casos, el nivel de las mismas.
Aspectos resumen de la presente invencion
Los aspectos de la presente invencion se presentan en las reivindicaciones y en el comentario siguiente.
En un aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo de deteccion de una actividad fitasa o de una actividad proteasa que comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio que comprende una fase continua y una fase dispersa, en donde la fase dispersa comprende: i) un primer componente que es un fitato o un acido ftico ii) un segundo componente que es una protema en donde el primer componente y el segundo componente se mantienen unidos en un complejo por medio de una o mas interacciones intermoleculares; en donde la fase dispersa proporciona una propiedad detectable al medio; (b) proporcionar una muestra que comprende o se sospecha que comprende actividad fitasa y/o actividad proteasa, en donde la actividad fitasa y/o proteasa es capaz de afectar a la fase dispersa causando un cambio en la propiedad detectable del medio; (c) poner en contacto el medio con la muestra; (d) determinar si hay un cambio detectable en la propiedad detectable del medio.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo de analisis cuantitativo, semicuantitativo o cualitativo para la deteccion de la actividad de la enzima que comprende el metodo de acuerdo con el aspecto anterior.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de un kit para la deteccion de la actividad fitasa o proteasa utilizando el metodo de acuerdo con los aspectos anteriores.
En otro aspecto, la presente invencion se refiere a la utilizacion de un metodo de acuerdo con el aspecto anterior o la utilizacion de un kit de acuerdo con el aspecto anterior para someter a ensayo la actividad enzimatica en una muestra biologica - tal como una preparacion de enzima, un caldo de fermentacion, un alimento, un pienso, un ingrediente alimentario, una mezcla de ingredientes alimentarios, un ingrediente para pienso, un producto alimentario procesado o un producto para pienso procesado o en un extracto de uno cualquiera de los mismos.
Breve descripcion de las figuras
En la presente memoria se hace referencia a las siguientes figuras:
La Figura 1a, que es un grafico.
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La Figura 1b que es un grafico.
La Figura 2 que es un grafico.
La Figura 3 que es un grafico.
La Figura 4 que es un grafico.
La Figura 5 que es un grafico.
La Figura 6 que muestra una serie de fotograffas. La Figura 7 que es un grafico.
La figura 8a que es un grafico.
La figura 8b que es un grafico.
La Figura 9 que es una tabla y una fotograffa.
La Figura 10 que es un grafico.
La Figura 11a que es un grafico.
La figura 11b que es un grafico La Figura 11c que es un grafico.
La figura 12a que es un grafico.
La figura 12b que es un grafico.
La Figura 13 que es una fotograffa.
La Figura 14 que son dos fotograffas.
La Figura 15 que es una serie de fotograffas.
La Figura 16 que es un grafico.
La Figura 17 que es una fotograffa.
La Figura 18 que son dos fotograffas.
La Figura 19 que es una representacion.
La figura 20a que es una fotograffa.
La figura 20b que es una fotograffa.
La Figura 21 que es un grafico.
La figura 22a que es un grafico.
La figura 22b que es un grafico.
La figura 23a que es un grafico.
La figura 23b que es un grafico.
La Figura 24 que es un grafico.
La Figura 25 que es un grafico.
La Figura 26 que es un grafico.
La figura 27a que es un grafico.
La figura 27b que es un grafico.
Las Figuras 28a-f son una serie de graficos. Las Figuras 29a-e son una serie de graficos.
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Las figuras se describen a continuacion con mas detalle.
La Figura 1a muestra la formacion de complejos de protema de soja y p-casema bovina como una funcion de la concentracion de acido fftico a pH 3,0 en glicina-HCl. El grado de formacion de complejo se mide por un aumento en la turbidez de la solucion medido por medio de la absorbancia de luz a una longitud de onda de 600 nm. Como se puede observar en la Figura 1a, la cantidad de absorbancia a una longitud de onda de 600 nm a una concentracion de acido fftico dada depende del tipo de protema utilizado. La beta-casema proporciona una absorbancia mayor que la protema de soja en el intervalo de concentraciones de acido fftico de 0,04 a aproximadamente 0,14 mg/ml. La razon optima de protema con respecto a acido fftico se puede someter a ensayo para cada tipo de protema. La glicina-HCl es el tampon preferido para estas condiciones.
La Figura 1b muestra el efecto del pH sobre la absorbancia del complejo de acido fftico-lisozima de pH 2,73 a pH 6,95 en tampones de glicina-HCl 40 mM, acetato, Mes-NaOH a hexakisfosfato de m/o-inositol 0,3 mM (IP6) y 2,5 mg/ml de lisozima. Como se puede observar en la Figura 1b la absorbancia a 600 nm (tambien denominada DO600) cambia de acuerdo con el pH. Se puede determinar el pH optimo para cada combinacion de protema y acido fftico.
La Figura 2 muestra la turbidez de las soluciones (que corresponden al medio) que contienen o bien un complejo de acido fftico-protema de soja (correspondiente a la fase dispersa) o bien un complejo de MIHS-protema de soja como una funcion del pH de la solucion. Como se puede observar en la Figura 2, la turbidez producida por el complejo de protema vana con el pH. Se puede determinar el pH optimo para cada combinacion de protema y acido fftico.
La Figura 3 muestra la turbidez de las soluciones que comprenden diferentes esteres fosfato de inositol m/o- monofosfato de inositol (IP1 (2)), bisfosfato de m/o-inositol (IP2 (2,4)), trisfosfato de m/o-inositol (IP3 (1,4,5)), tetrakis- fosfato de m/o-inositol (IP4 (1,2,4,5)), pentaquifosfato de m/o-inositol (IP5 (1,2,3,4,5)), hexakisfosfato de m/o-inositol (IP6 (1,2,3,4,5,6)) e isomeros posicionales de IP5 pentakisfosfato de m/o-inositol (IP5 (1,3,4,5,6)) y pentaquifosfato de m/o-inositol (IP5 (1,2,4,5,6)) formando complejos con la protema de soja. La formacion del complejo provoca el aumento de la turbidez en la solucion, que se mide por un aumento en la absorbancia de la luz a 600 nm por la solucion. En particular, la Figura 3 muestra sorprendentemente la drastica disminucion de la turbidez cuando IP6 se converffa en IP5, que forma la base para el desarrollo del metodo de analisis de fitasa actual. En la bibliograffa se suele suponer que la capacidad quelante disminuye proporcionalmente cuando IP6 se convierte en IP5, IP4, IP3 e IP2 (Blaabjerg, K; Carlson, D.; Hansen-M0ller, J.; Tauson, A.-H.; Poulsen, HD 2007).
La Figura 4 muestra la turbidez de las soluciones que comprenden diferentes esteres fosfato de inositol (IP1-IP6) e isomeros posicionales de IP5 que forman complejos con p-casema. La formacion del complejo provoca el aumento de la turbidez en la solucion, que se mide por un aumento en la absorbancia de la luz a 600 nm por la solucion. En particular, la Figura 4 muestra la drastica disminucion de la turbidez cuando IP6 se converffa en IP5.
La Figura 5 muestra el efecto de diferentes niveles de dosis de fitasa (0-1 U/ml) en la reduccion de la turbidez de la solucion causada por los complejos de protema de soja y acido fftico con el tiempo. Como se puede observar en la Figura 5, sin fitasa presente hay una tasa muy lenta de disminucion de la turbidez (lmea superior). Con concentraciones crecientes de fitasa la turbidez de la solucion disminuye mas rapidamente.
Figura 6: El panel superior mas a la izquierda muestra los tubos que contienen la incubacion durante la noche del extracto de pienso filtrado con el complejo protema de soja y acido fftico. Los tubos contienen fitasa (Phyzyme XP®), de izquierda a derecha, 0 (control), 186, 442, 1129, 2301 y 210.368 UFT/kg (UFT = unidades de fitasa). El panel superior derecho muestra un kit de ensayo de actividad proteasa o fitasa. El panel inferior izquierdo muestra un agitador que se puede utilizar en el analisis de actividad fitasa o proteasa. El panel derecho inferior muestra un turbidfmetro y cubetas que se puede utilizar en el analisis de actividad proteasa o fitasa.
La Figura 7 muestra el efecto del pH y el tiempo de incubacion sobre la turbidez de soluciones que comprenden complejo de protema de soja y acido fftico en presencia de fitasa (Phyzyme XP®). Como se puede observar en la Figura 7, a mayor tiempo de incubacion con fitasa mas baja es la turbidez a todos los valores de pH sometidos a ensayo.
La Figura 8a muestra la disminucion de la turbidez del complejo de lisozima y acido fftico causada por la presencia de 0,1 UFT de fitasa como una funcion del tiempo de reaccion. La reaccion se controlo por la disminucion de la absorbancia a 600 nm y midiendo el fosfato inorganico liberado simultaneamente. Se puede observar a partir de la Figura 8a que la disminucion en la turbidez es co-temporal con el incremento de fosfato inorganico libre liberado por la fitasa. Por lo tanto, la turbidez es un buen indicador de la actividad fitasa.
La Figura 8b muestra la disminucion de la turbidez de la solucion de complejo de protema de soja y acido fftico como una funcion del tiempo y la dosis de fitasa (UFT/kg) en el pienso a base de mafz/soja controlada por la disminucion de la absorbancia a 600 nm.
La Figura 9 muestra los resultados (mostrados en el panel superior) de los analisis de fitasa sobre muestras de pienso elaboradas en una microplaca (que se muestra en el panel inferior). En particular la Figura 9 muestra los datos de absorbancia en relacion con las unidades de fitasa presentes en el pienso. Las muestras de pienso fueron seleccionadas al azar entre productos de pienso elaborados en Costa Rica (CR), China (CN), Francia (F) y Australia
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(AU). Las unidades de fitasa se proporcionan despues de los codigos del pa^s. Como se puede observar en la Figura 9, la turbidez medida en este analisis vana entre las diferentes muestras de pienso.
La Figura 10 muestra el efecto del pH y de la dosis de fitasa en la reduccion de la turbidez de las soluciones que contienen el complejo de protema de soja y acido fftico. La mezcla de reaccion contema 0,1 ml de glicina-HCl 0,2 M con un pH de 1,9, 2,5 y 3,0, respectivamente, y 0,1 ml de producto filtrado de extracto de agua de pienso. La concentracion final de fitato de sodio fue de 0,1 mM.
La Figura 11a y la Figura 11b muestran el cambio de turbidez en relacion con la dosis de fitasa y el tiempo de reaccion para 12 muestras de pienso Canadiense. Como se puede observar en la Figura 11a y la Figura 11b, la actividad fitasa medida por el presente metodo puede diferir de la fitasa medida por los metodos de la tecnica anterior. Esto puede ser debido a la presencia de inhibidores de fitasa o al tipo de matriz del pienso en las muestras de pienso que se estan sometiendo a ensayo. Se pueden utiliza controles para contabilizar las diferencias en la reaccion causadas por los inhibidores de fitasa en la muestra o el tipo de matriz del pienso.
La Figura 11c muestra la utilizacion de complejo de lisozima y acido fftico como sustrato en acetato de sodio 35 mM (pH 5,49) para el analisis de la variante de fitasa de Aspergillus (Natuphos). La mezcla de reaccion contema 35 pl de tampon 50 mM, lisozima (2,5 mg/ml), fitato de sodio (IP6) (0,3 mM) y fitasa en varias cantidades. La reaccion se llevo a cabo a 22°C en una microplaca de 96 pocillos y estuvo seguida del control de la disminucion de la absorbancia a 600 nm. Como se puede observar en la Figura 11c la velocidad de disminucion de la absorbancia a 600 nm aumento linealmente con el numero de unidades de fitasa presentes. Los parametros del analisis se pueden ajustar para asegurar que la velocidad de reaccion es convenientemente medible en un kit para la medicion de las muestras de pienso.
La Figura 12a muestra el uso de la protema (lisozima)-acido fftico como sustrato a pH 8,7 en Tris-HCl 35 mM para el analisis de la proteasa alcalina P-3000 (una variante de la subtilisina). La mezcla de reaccion contema 35 pl de tampon 50 mM, lisozima (2,5 mg/ml), fitato de sodio (IP6) (0,3 mM) y proteasa en diversas cantidades. La reaccion se llevo a cabo a 22°C en una microplaca de 96 pocillos y estuvo seguida del control de la disminucion de la absorbancia a 600 nm. Como se puede observar en la Figura 12a la velocidad de disminucion de la absorbancia a 600 nm aumenta casi linealmente con el numero de unidades de proteasa presentes. Los parametros del analisis se pueden ajustar para asegurar que la velocidad de reaccion es convenientemente medible en un kit para la medicion de las muestras de pienso.
La Figura 12b muestra el efecto del pH sobre la actividad proteasa P-3000 utilizando complejo de protema de soja y acido fftico como sustrato como se indica por cambios en la turbidez solucion. Se puede observar a partir de la figura 12b que esta proteasa es mas activa a pH 3,0 que a pH 1,9 o pH 2,5. El pH utilizado en el analisis se puede seleccionar de acuerdo con el intervalo de pH al cual la enzima es activa, asf como para asegurar que las protemas que forman parte del complejo tienen la carga apropiada para formar un complejo.
La Figura 13 muestra un ejemplo de un kit de analisis de la actividad proteasa y/o fitasa basado en una placa de Petri que se puede complementar con una mini-incubadora y una regla (no mostrado).
La Figura 14 muestra los resultados de los analisis en placa de Petri para determinar la actividad fitasa, donde la concentracion de acido fftico en el gel es 0,3 mM (panel de la izquierda) y 0,4 mM (panel de la derecha). Los pocillos marcados con 0, 186, 233, 442, 1129 y 2301 conteman extracto de pienso a base de mafz/soja con la cantidad indicada de fitasa (UFT/kg). Los pocillos marcados con 836 y 1586 conteman extracto de pienso a base de trigo que tema 836 y 1586 UFT/kg, respectivamente. Como se puede observar en la Figura 14, la concentracion de acido fftico final en el gel se puede ajustar para dar el mejor contraste entre la turbidez del gel y los halos claros que indican la actividad fitasa.
La Figura 15 muestra analisis en placa de Petri para determinar la actividad fitasa con diferentes concentraciones de tampon (glicina-HCl, pH 3,0). De izquierda a derecha: glicina-HCl 0,1 M, 0,15 M, 0,20 M, 0,25 M. Los pocillos marcados con 0, 193, 233, 442, 1129 y 2301 conteman extracto de pienso a base de mafz/soja con la cantidad indicada de fitasa (UFT/kg).
La Figura 16 muestra la relacion entre el diametro del halo o el area de aureola desarrollado a 23°C y el numero de unidades de fitasa (UFT/kg) contenido en el extracto de pienso. Para cada grupo de 4 barras, las barras corresponden a 223, 442, 1129, 2301 UFT/kg (de izquierda a derecha). Como se puede observar en la Figura 16 existe una correlacion positiva entre el diametro o el area del halo y la concentracion de fitasa.
La Figura 17 muestra el efecto de la concentracion de acido fftico (0,1-0,4 mM) y el factor de dilucion en agua del pienso sobre el tamano del halo del gel de agarosa que contiene glicina-HCl 0,1 M pH 3,0 y protema de soja 2 mg/ml.
La Figura 18 muestra ejemplos de analisis de proteasa realizados por el metodo de placa de Petri. Los pocillos conteman 0 (control), 114, 570, 1.140, 2.280, 3.420 y 4.560 unidades de Dan (o GSU, Genencor Subtilisin Unit).
La Figura 19 muestra una hidrolisis por etapas esquematica de los grupos fosfato del hexakisfosfato de mio-inositol
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(IP6) con respecto a pentaquifosfato de m/o-inositol (IP5), tetrakisfosfato de m/o-inositol (IP4), trifosfato de m/o- inositol (IP3), bisfosfato de m/o-inositol (IP2) y monofosfato de m/o-inositol (IP1) con la liberacion concomitante de fosfato inorganico en cada etapa. La primera etapa de IP6 a IP5 proporciona el cambio mas grande en la turbidez y se correlaciona con la concentracion de fitasa. Sin embargo, la hidrolisis de los grupos fosfato restantes, en particular IP5 a IP4 tambien se puede utilizar para medir la actividad fitasa.
La Figura 20a muestra el efecto del acido ftico sobre la agregacion de las protemas de soja que producen turbidez de las soluciones y el aclaramiento de las soluciones turbias con fitasa B de la bacteria del suelo Butt/auxella sp. Tubo 0, protema de soja solamente (solucion clara). Tubos 1-7, protema de soja a 0,15 mg/ml de acido ftico (las soluciones de soja en todos los tubos estan turbias). En los tubos 1-3 el producto agregado comienza a precipitar.
Figura 20b: Tubo 0, protema de soja solamente (solucion clara). Tubos 1-7, protema de soja a 0,15 mg/ml de acido ftico con adicion de fitasa B: 0, 5, 10, 50, 100, 200 y 300 UFT/ml. La solucion se volvio clara 1 min despues de la adicion de la fitasa. Como se puede observar en las Figuras 20a y 20b, la disminucion de la turbidez puede ser observada a simple vista. La turbidez tambien corresponde a la Absorbancia a 600 nm.
La Figura 21 muestra la relacion entre el tamano del area del halo y el numero de unidades de fitasa anadido al pienso a base de mafz/soja o trigo. Como se puede observar en la Figura 21, el tamano del halo producido en un analisis basado en gel o placa de Petri depende del tipo de pienso del que proviene la muestra, asf como el numero de unidades de fitasa y de las condiciones de reaccion. Los resultados del analisis se pueden comparar con los patrones o controles para tener en cuenta esta diferencia. Esto es particularmente util en analisis cuantitativos o semi-cuantitativos. Los analisis de piensos basados en trigo se pueden incubar durante mas tiempo si es necesario ya que el halo se desarrolla mas lentamente. El tiempo optimo de incubacion puede ser determinado para este ensayo en diferentes tipos de pienso.
La Figura 22 muestra el efecto de la concentracion de la fitasa sobre la reaccion catalizada por fitasa utilizando complejo de acido ftico (IP6)-lisozima como sustrato.
Figura 23: Efecto de P y de la concentracion de lisozima sobre la turbidez de la solucion de complejo de P y lisozima. El complejo se preparo en tampon acetato de sodio 50 mM pH 4 que contema P 0-0,7 mM y lisozima a diferentes concentraciones:30 pM (♦), 58 pM (■), 116 pM (▲), 174 pM (•), 231 pM (0), 289 pM (□), 347 pM (A), 405 |jM (o) y 463 pM (+) en un volumen total de 120 pl. Los detalles experimentales se describen en la seccion de Materiales y Metodos.
Figura 24: Efecto del pH y la concentracion de (a) de NaCl y (b) CaCl2, respectivamente, sobre la turbidez del complejo de P y lisozima (en una razon de 0,3 mM:0,23 mM) en tampon glicina-HCl 50 mM (pH 2,5 a 3,5), tampon acetato de sodio 50 mM (pH 3,5 a 5,5), y tampon Tris-maleato 50 mM (pH 5,5 a 8,5) que contema P 0,3 mM, lisozima 0,23 mM (2,5 mg/ml) y (a) NaCl a diferentes concentraciones:0 mM (♦), 5 mM (■), 10 mM (▲), 15 mM (•), 30 mM (0), y 45 mM (□), o (b) CaCl2 a diferentes concentraciones:0 mM (♦), 1 mM (■), 3 mM (▲), 5 mM (•), 7 mM (0), 10 mM (□) y 15 mM (A) en un volumen total de 120 pl. Los detalles experimentales se describen en la seccion de Materiales y Metodos.
Figura 25: Efecto de las concentraciones de EDTA y CaCh sobre la turbidez del complejo de P y lisozima (0,3 mM:0,23 mM) en glicina-HCl 50 mM pH 3,5 que contema P 0,3 mM, lisozima 0,23 mM y CaCl2 a diferentes concentraciones:0 mM (♦), 5 mM (■), y 10 mM (▲) en un volumen total de 120 pl.
Figura 26: Efecto de la concentracion de fosfato sobre la turbidez del complejo de P y lisozima (0,3 mM:0,23 mM) en glicina-HCl 50 mM a pH 3,5 que contema IP6,0,3 mM, lisozima 0,23 mM y diferentes concentraciones de KH2PO4 en un volumen total de 120 pl
Figura 27: Actividad de (a) variante 1 de fitasa de E. col/ (0,1 UFT/ml) y (b) Fitasa de A. N^ger (0,5 UFT/ml) con sustrato de P y lisozima basada en la reduccion de la turbidez (♦) y Pi liberado (■); con P basado en Pi liberado (A); y con complejo de P y lisina basado en Pi liberado (o). Los tres sustratos se prepararon en glicina-HCl 50 mM (pH 3,5) que contema P 0,3 mM (para sustrato de IP6) y, o bien lisozima 0,23 mM (para sustrato de IP6-lisozima) o bien lisina 23 mM (para sustrato de IP6-lisina) en un volumen total de 120 pl. Las reacciones se llevaron a cabo a 37°C durante 25 min con mezclado continuo. La turbidez de las reacciones se determino cada 30 seg. Para la determinacion de Pi, las reacciones se detuvieron mediante la adicion de 30 pl de HCl 2,5 M, se centrifugaron y los sobrenadantes se analizaron para determinar Pi en Konelab.
Figura 28: Relacion entre la reduccion de la turbidez y la liberacion de fosfato durante la reaccion con diferentes concentraciones de fitasas:(a, b, c) variante 1 de fitasa de E. col/, 0.1 UFT/ml (♦), 0,2 UFT/ml (■), y 0,3 UFT/ml (▲), y (d, e, f) Fitasa de A. n'/ger, 0.1 UFT/ml (♦), 0,15 UFT/ml (■), y 0,2 UFT/ml (▲), en tampon de acetato 50 mM (pH 5,5 a 37°C) con un volumen total de reaccion de 120 pl. Las mediciones de la turbidez se muestran en la Figura 28a, la Figura 28d; el Pi liberado en la Figura 28b y la Figura 28e; y la relacion entre la reduccion de la turbidez (mDO/min) y la liberacion de Pi (mM/min) en la Figura 28c y la Figura 28f.
Figura 29: Perfiles de pH de (a) variante 1 de fitasa de E. col/, (b) variante 2 de fitasa de E. col/, (c) fitasa de
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Bacillus, (d) fitasa de A. niger, y (e) fitasa de Peniophora Lycii sobre el complejo de IP6-lisozima como sustrato. Las reacciones se llevaron a cabo en potasio-HCl 50 mM (pH 1,5 a 2,5), glicina-HCl 50 mM (pH 2,5 a 3,5), acetato de sodio 50 mM (pH 3,5 a 5,5) y Tris-maleato 50 mM (pH 5,5 a 8,5 ), respectivamente, que contema iPa 0,3 mM y lisozima 0,23 mM en un volumen total de 120 jl a 37°C. La dosis de enzima para cada reaccion fue de 0,1 UFT/ml basandose en Pi liberado de IPa en el analisis de actividad fitasa convencional. En la Figura 7c, las reacciones enzimaticas se llevaron a cabo sin CaCh (♦) y con CaCl21 mM (■).
Aspectos detallados de la presente invencion
En un aspecto amplio, la presente invencion se refiere a un metodo de deteccion de la actividad fitasa o la actividad proteasa que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un medio que comprende una fase continua y una fase dispersa, en donde la fase dispersa comprende: i) un primer componente que es un fitato o un acido ftico ii) un segundo componente que es una protema en donde el primer componente y el segundo componente se mantienen unidos en un complejo por medio de una o mas interacciones intermoleculares; en donde la fase dispersa proporciona una propiedad detectable al medio; (b) proporcionar una muestra que comprende o se sospecha que comprende actividad fitasa y/o actividad proteasa, en donde la actividad fitasa y/o proteasa son capaces de afectar a la fase dispersa para causar un cambio en la propiedad detectable del medio; (C) poner en contacto el medio con la muestra; (d) determinar si hay un cambio detectable en la propiedad detectable del medio.
La presente invencion proporciona un metodo de analisis util para determinar si un pienso comprende una actividad enzimatica en particular, preferiblemente fitasa. Al conocer si un pienso tiene o no tiene bajos niveles de fitasa es posible anadir fitasa al pienso. Esto es ventajoso ya que la fitasa rompe el fitato normalmente no nutricional para proporcionar entidades de fosfato nutricionales.
La deteccion de actividad de la enzima significa la obtencion de una indicacion de la presencia o ausencia de actividad de la enzima o de la cantidad de actividad de una enzima.
El metodo para la deteccion de actividad de la enzima puede ser un metodo cuantitativo, semicuantitativo o cualitativo. En una realizacion, el analisis puede proporcionar una indicacion de la presencia o ausencia de actividad de la enzima. En otra realizacion, el metodo puede proporcionar una indicacion de la cantidad de actividad de enzima en una muestra.
La actividad enzimatica representa la capacidad para catalizar una reaccion particular. La cantidad de sustrato consumido o de producto producido a partir de la reaccion se puede observar o medir.
La cantidad de inhibicion de la actividad de la enzima se puede medir mediante la comparacion de la cantidad de actividad que se espera de una cantidad conocida de enzima en una muestra con la cantidad de actividad enzimatica medida.
El acido ftico (hexakisfosfato de mio-inositol, IPa) es un componente importante, por ejemplo, en cereales, legumbres y oleaginosas. La forma de sal, el fitato, es la principal forma de almacenamiento de fosforo en estas plantas. Las fitasas son utiles como aditivos para piensos animales donde mejoran la disponibilidad de fosforo organico para el animal y disminuyen la contaminacion por fosfato del medio ambiente (Wodzinski R. J., (1996)). Los animales no producen de forma natural las enzimas para descomponer el fitato para obtener fosfato para la formacion de los huesos y el crecimiento. La actividad de las fitasas vegetales vana con las especies y variedades de plantas y muchas fitasas vegetales no tienen una actividad optima al pH encontrado en los sistemas digestivos de los animales. Las fitasas pueden ser inactivadas por calor durante el procedimiento de granulacion del pienso o la actividad fitasa puede disminuir durante el almacenamiento. Portanto, resulta ventajoso poder detectar la presencia, ausencia o cantidad de actividad fitasa en el pienso, los alimentos o los ingredientes para piensos.
En una realizacion de la presente invencion, la actividad de la enzima puede ser fosfohidrolasa o fosfomonoesterasa, preferiblemente una actividad fitasa.
Segun se utiliza en la presente memoria, el termino actividad fitasa se refiere a la capacidad de una enzima o una muestra para catalizar las etapas de la descomposicion del fitato (hexakisfosfato de mio-inositol) para proporcionar fosfato inorganico (p. ej., ortofosfato). Las etapas se muestran en la Figura 19.
El termino fitasa significa una protema o polipeptido que son capaces de catalizar la hidrolisis de los esteres de acido fosforico, que comprende fitato y la liberacion de fosfato inorganico, hexakisfosfato de mio-inositol + H2O <=> 1,2,3,5,6-pentaquifosfato de 1D-mio-inositol + fosfato (E.C.3.1.3.26). Algunas fitasas ademas del fitato, son capaces de hidrolizar por lo menos algunos de los fosfatos de inositol de grados intermedios de fosforilacion lo que da como resultado la formacion por etapas de pentakis-, tetrakis-, tris-, bis- y monofosfatos de mio-inositol, asf como la liberacion de fosfato inorganico. Algunas de estas enzimas son, fosfatasa acida de histidina (HAP), fosfatasa acida de pH 2,5, fitasa de helice enrollada (BPP) y fitasa fosfatasa acida purpura (PAP), por ejemplo, 3-fitasa (EC3.1.3.8), 4-fitasa (tambien conocida como 6-fitasa, EC3.1.3.26), o 5-fitasa (EC3.1.3.72), tambien fitasas neutras y fitasas alcalinas (principalmente de BacilosJ segun la clasificacion de acuerdo con el Comite de Nomenclatura de la Union
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Internacional de Bioqmmica y Biologfa Molecular (IUBBM).
En una realizacion preferiblemente el componente polivalente de la fase dispersa es el hexakisfosfato de mo-inositol y la actividad fitasa hidroliza el hexakisfosfato de m/o-inositol a pentaquifosfato de m/o-inositol. La hidrolisis de hexakisfosfato de m/o-inositol a pentaquifosfato de mio-inositol proporciona un cambio en la propiedad detectable del medio, por ejemplo, un cambio detectable en la turbidez.
En otra realizacion, el componente polivalente de la fase dispersa puede ser pentaquisfosfato de m/o-inositol y la actividad de hidrolisis hidroliza el pentaquifosfato de m/o-inositol a tetrakisfosfato de m/o-inositol.
En otra realizacion, el componente polivalente de la fase dispersa puede ser un fosfato de inositol de grado intermedio tal como pentakis-, tetrakis-, tris-, bis- o monofosfato de m/o-inositol y la actividad de hidrolisis elimina un fosfato lo que se traduce en la formacion por etapas de tetrakis-, tris-, bis- y monofosfato de m/o-inositol o inositol.
En otra realizacion, se puede anadir una combinacion de enzimas a una muestra o a un pienso, alimento, ingrediente para pienso, mezcla de ingredientes para pienso (premezcla) o ingrediente alimentario para catalizar la hidrolisis del monofosfato de m/o-inositol (IP1) a Inositol.
La actividad fitasa se puede medir en unidades de fitasa (UFT). Una UFT se define como la actividad fitasa que genera 1 micromol de fosforo inorganico por minuto a partir de fitato de sodio 5,1 mM a pH 5,5 y a 37°C.
En algunas circunstancias, el numero de unidades de fitasa medido en una muestra no se puede correlacionar con la cantidad de la enzima fitasa, porque pueden estar presentes inhibidores de fitasa. Por lo tanto, se pueden utilizar preferiblemente controles adecuados que comprenden una cantidad conocida de fitasa para comprobar la presencia y la cantidad de inhibidores de fitasa en la muestra.
En otra realizacion, la actividad enzimatica de la presente invencion puede ser la actividad proteasa. Segun se utiliza en la presente memoria la actividad proteasa es la capacidad de catalizar la hidrolisis de enlaces pepffdicos de proternas o peptidos para liberar cadenas pepffdicas mas cortas o aminoacidos. Adecuadamente, la proteasa es una endoproteasa de microbios, plantas y otros organismos vivos.
Adecuadamente, la proteasa es capaz de hidrolizar lisozima, p-caserna, y/o proterna de soja.
En una realizacion, el metodo se puede utilizar para detectar la presencia, ausencia o cantidad de actividad enzimatica, de manera adecuada la actividad proteasa o fitasa en una muestra. La muestra puede ser una solucion enzimatica acuosa o una muestra compleja tal como una muestra de un pienso, alimento, premezcla de pienso, ingrediente de pienso o ingrediente alimentario o un extracto de alimentario, alimento, ingrediente de pienso o ingrediente alimentario. Adecuadamente, el ingrediente de pienso o premezcla de pienso puede comprender o consistir en un microorganismo. Adecuadamente, el pienso puede ser un pienso a base de mafz/soja o un pienso a base de trigo. Adecuadamente, el extracto de pienso, la comida, la premezcla de pienso, el ingrediente de pienso o el ingrediente alimentario pueden ser un extracto acuoso.
La proterna en la fase dispersa de la presente invencion puede ser cualquier proterna, siempre que sea capaz de formar una interaccion intermolecular con el componente polivalente para formar una fase dispersa. Cuando el metodo, el uso o el kit son un metodo, un uso o un kit para la deteccion de actividad proteasa, la proterna debe ser tambien susceptible de ser hidrolizada por la proteasa de interes para destruir la fase dispersa.
Adecuadamente, la proterna puede ser una proterna natural o una proterna sintetica con valores de pl preferiblemente por encima de pH 4,6, tal como proterna de soja, proterna de semilla de colza, proterna de mostaza, p-caserna bovina, caserna N,N-dimetilada (C9801), beta-lactoglobulina bovina, albumina de suero bovina, lisozima, o hemoglobina porcina. La proterna puede ser modificada con un cromoforo por ejemplo, un cromoforo o un fluoroforo.
Segun se utiliza en la presente memoria el termino componente ionico representa cualquier componente cargado, preferiblemente un ion de carga multiple. El componente ionico puede ser cualquier componente ionico siempre que sea capaz de formar una interaccion intermolecular con el componente polivalente de la presente invencion para formar una fase dispersa. El componente ionico puede ser una proterna o un acido graso o un acido graso con iones de calcio.
Cuando el metodo, el uso o el kit son un metodo, un uso o un kit para la deteccion de la hidrolisis catalizada por enzima del componente ionico, el componente ionico debe ser susceptible de ser hidrolizado por la enzima de interes para destruir la fase dispersa mediante hidrolisis intramolecular dentro del componente ionico en lugar de mediante ruptura de la interaccion intramolecular. La fase dispersa se destruye cuando ya no proporciona una propiedad detectable al medio o hay un cambio en la propiedad detectable que la fase dispersa proporciona al medio.
Cuando la enzima de interes es una fitasa, el componente polivalente puede ser adecuadamente acido fftico (hexakisfosfato de m/o-inositol, IP6), pentaquifosfato de m/o-inositol IP5, o polifosfato.
Cuando la enzima de interes es una proteasa, el componente polivalente puede ser adecuadamente acido fftico
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(hexakisfosfato de m/o-inositol, IP6), FIMPM (hexasulfato de m/o-inositol), pentaquisfosfato de m/o-inositol, o polifosfato.
La fase dispersa de la presente invencion comprende al menos una protema o peptido y al menos un componente polivalente. En una realizacion, la fase dispersa puede ser un complejo o un agregado. En una realizacion, la fase dispersa puede ser un semisolido o un solido.
En una realizacion, la fase dispersa es un agregado o un complejo, tal como un agregado de protema y fitato o un complejo de protema-fitato.
En una realizacion, la fase dispersa se proporciona dispersa en una fase continua para formar un medio que comprende una fase dispersa y una fase continua. La fase continua puede ser un lfquido o un gel, adecuadamente un lfquido acuoso o un gel acuoso, de manera adecuada un gel de agar o un gel de agarosa o un gel de poliacrilamida o un gel formado con otro polfmero formador de gel. La presencia de la fase dispersa en la fase continua proporciona una propiedad detectable al medio, tal como turbidez, viscosidad, absorbancia de la luz o dispersion de la luz. Esta propiedad detectable se puede medir con referencia a una muestra de la fase continua que no comprende la fase dispersa. La cantidad de turbidez, viscosidad, absorcion de la luz o la dispersion de la luz por el medio es proporcional a la cantidad de fase dispersa en el medio.
La destruccion o la degradacion de uno o ambos miembros de la fase dispersa, es decir, el primer componente que es un componente polivalente, por ejemplo IP6 (= IPa) O el segundo componente que es un componente ionico, por ejemplo una protema, por hidrolisis del IP6, por ejemplo, por la fitasa, o la hidrolisis de la protema por la proteasa daran lugar a la destruccion de la fase dispersa. La destruccion de la fase dispersa conduce a una disminucion en la turbidez, la viscosidad o la absorbancia del medio que es directamente proporcional a la actividad de la enzima.
En algunas realizaciones, la actividad enzimatica es la actividad fitasa y el componente polivalente es preferiblemente IP6. Los complejos de protema con IP6 proporcionan una mayor absorbancia a a0o nm que los complejos de otros esteres fosfato e isomeros posicionales de IP5. Por lo tanto el cambio de absorbancia a 600 nm es mayor con la hidrolisis de 1 grupo fosfato inorganico a partir de IP6 que a partir de otros esteres fosfato e isomeros posicionales de IP5.
Los componentes de la fase dispersa de la presente invencion pueden ser mantenidos juntos por medio de interacciones intermoleculares tales como las interacciones carga-carga (interacciones electrostaticas) o enlaces de hidrogeno.
En una realizacion, la protema esta a un pH por debajo de su punto isoelectrico (pl) y esta cargada positivamente. Preferiblemente, en este caso, el componente polivalente esta cargado negativamente, por ejemplo IP6, y estos dos componentes forman una interaccion carga-carga entre la protema cargada positivamente y el IP6 cargado negativamente. La interaccion carga-carga conduce a la formacion de la fase dispersa.
En una realizacion el medio o la protema estan a un pH entre 1,8 y 7,5, preferiblemente a un pH entre 1,8 y 5,5.
En otra realizacion, el componente polivalente es acido ftico o un componente de una sal de fitato. En una realizacion adicional la enzima es una fitasa.
En otra realizacion, la protema esta a un pH que esta por encima de su pl y esta cargada negativamente. Preferiblemente, en este caso, el componente polivalente esta cargado positivamente, por ejemplo polilisina, quitina, quitosano o un oligomero de quitina o quitosano. Estos dos componentes forman un complejo mediante la interaccion carga-carga entre la protema cargada negativamente y el componente polivalente cargado positivamente.
En otra realizacion, la protema esta por encima de su pl y esta cargada negativamente y el componente polivalente tambien esta cargado negativamente. Estos dos componentes cargados negativa forman una fase dispersa entre sf por la interaccion carga-carga con cationes monovalentes o divalentes o trivalentes cargados positivamente.
Segun se utiliza en la presente memoria un cation monovalente es cualquier ion cargado positivamente que tiene solamente una carga positiva, por ejemplo, Na+ o K+, un cation divalente es cualquier ion cargado positivamente que tiene dos cargas positivas, por ejemplo, Ca , Mg , Zn . Fe , un cation trivalente es cualquier ion cargado positivamente que tiene tres cargas positivas, por ejemplo, Fe3+.
La cantidad de fase dispersa en una solucion o gel es proporcional a la turbidez, absorbancia o dispersion de luz de la solucion o gel o la viscosidad de una solucion. Por tanto, se puede obtener una indicacion de la cantidad de fase dispersa en la solucion o gel mediante la medicion de la turbidez, absorbancia o dispersion de luz de la solucion o gel o la viscosidad de una solucion por cualquier mecanismo adecuado conocido en la tecnica.
La cantidad de fase dispersa en la solucion o gel despues de la adicion de la enzima o de la muestra depende de la cantidad de actividad enzimatica. La presencia, ausencia o cantidad de actividad de la enzima pueden ser determinadas por la diferencia de turbidez, absorbancia o dispersion de luz de la solucion o gel o la viscosidad de
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una solucion antes y despues de la adicion de la enzima o de la muestra o con y sin adicion de la enzima o la muestra.
En una realizacion de turbidez se puede observar a simple vista o utilizando un turbid^etro. La turbidez de las soluciones puede ser observada a simple vista en cubetas o tubos como se muestra en la Figura 6, panel de la izquierda superior o se puede medir utilizando un turbidfmetro. La turbidez de los geles tambien se puede observar a simple vista - por ejemplo, como se demuestra en las Figuras 13, 14 y 17. La turbidez de las soluciones en microplacas se puede observar a simple vista o se puede medir utilizando un lector de microplacas adecuado para un escrutinio de alto rendimiento.
En otra realizacion, la cantidad de fase dispersa en solucion se mide por la absorbancia de la luz de la solucion, de forma adecuada la absorbancia de la luz se puede medir a cualquier longitud de onda entre 200 y 800 nm, preferiblemente entre 350 y 700 nm, mas preferiblemente de entre 400 y 600 nm y lo mas preferiblemente a 600 nm. La absorbancia de muchas muestras se puede analizar y/o comparar en una microplaca mediante el uso de un lector de ELISA o un lector de microplacas.
En una realizacion, la senal proporcionada por la destruccion o la degradacion de la fase dispersa se puede amplificar mediante el uso de una protema esta marcada covalentemente o no covalentemente con una sonda de fluorescencia, que cambia su intensidad de fluorescencia con el cambio de viscosidad de la solucion o cuando la protema forma parte de un complejo, producto agregado o fase dispersada. La protema tambien puede estar marcado con un cromoforo, adecuadamente un fluoroforo.
En un aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para detectar la actividad fitasa como se reivindica.
En una realizacion, el acido fftico es IP6 y la actividad fitasa hidroliza el IP6 a IP5. En realizacion la hidrolisis de IP6 a IP5 degrada la fase dispersa. En una realizacion, la fase dispersa proporciona turbidez al medio y la hidrolisis de IP6 a IP5 causa una disminucion detectable en la turbidez del medio. Ventajosamente la actividad fitasa se puede detectar a partir de la hidrolisis de IP6 a IP5, que causa una disminucion detectable en la turbidez del medio. Debido a que la disminucion detectable de la turbidez del medio es observable a partir de la hidrolisis de IP6 a IP5, el cambio en la turbidez ocurre en un corto penodo de tiempo (10-60 minutos). El metodo de la presente invencion puede proporcionar un metodo de analisis cinetico rapido para determinar la actividad fitasa. En otra realizacion, la actividad fitasa hidroliza IP5 a IP4 o IP6 a IP5 luego a IP4. La hidrolisis de IP5 a IP4 o de IP6 a IP5 luego a IP4 causa una disminucion detectable en la turbidez del medio.
En una realizacion, el metodo, el uso o el kit de la presente invencion se pueden llevar a cabo en ausencia de anticuerpos.
En una realizacion, el metodo, el uso o el kit de la presente invencion se pueden llevar a cabo en solucion sobre una placa de microtitulacion. Las ventajas de esta realizacion son que se pueden utilizar pequenas cantidades de muestra, la placa puede ser lefda de manera sencilla y con precision utilizando un lector de microplacas. Esta realizacion se puede utilizar para los analisis cuantitativos, semi-cuantitativos o cualitativos, ventajosamente se pueden realizar analisis cuantitativos, utilizando controles en la misma placa de microtitulacion.
En otra realizacion el metodo, el uso o el kit de la presente invencion se pueden llevar a cabo en un gel en un recipiente adecuado, por ejemplo una placa de Petri. En esta realizacion el metodo puede ser cuantitativo, semi- cuantitativo o cualitativo, ventajosamente se pueden realizar analisis cualitativos con las areas del gel que no se han expuesto a la actuacion de la enzima o la muestra como controles. En esta realizacion, el gel comprende una fase dispersa y una continua. El gel puede estar turbio. Se pueden hacer numerosos agujeros o pocillos en el gel a los que se pueden anadir las muestras y los controles. Aparecen parches transparentes o halos en el gel alrededor de los pocillos que contienen la actividad enzimatica, preferiblemente la actividad proteasa o fitasa, los halos se desarrollan (ampffan) con el tiempo (el diametro o tamano del halo aumentan cineticamente con el tiempo).
Ventajosamente, cuando la fase dispersa consiste esencialmente en complejos de fitato y protema, la fase dispersa se puede degradar bien por una proteasa o bien por una fitasa. El mismo medio que comprende un complejo de protema y fitato (fase dispersa) en un ffquido o gel (fase continua) se puede usar para un analisis de proteasa o fitasa. Esto evita la necesidad de dos analisis o sustratos de analisis separados, uno para los analisis de fitasa y uno para los analisis de proteasa. Ventajosamente se puede producir un kit que comprende un medio que es turbio debido a que comprende complejos de protema y fitato y esto se puede utilizar para llevar a cabo un analisis para determinar la actividad proteasa o bien la actividad fitasa.
En una realizacion, la razon del acido fftico con respecto a la protema en el complejo (fase dispersa, por ejemplo un complejo o producto agregado de fitato-protema) esta en el intervalo de 1-100:1-100.
Para algunas realizaciones, la razon del acido fftico con respecto a la protema en el complejo (fase dispersa, por ejemplo un complejo o producto agregado de fitato-protema) esta en el intervalo de 1-100:1-90, 1-100:1-80, 1-100:170, 1-100:1-60, 1-100:1-50, 1-100:1-40, 1-100:1-30, 1-100:1-20, 1-100:1-10, 1-100:1-5, 1-100:1. Para tales realizaciones, los ejemplos de una razon preferida de acido fftico con respecto a protema en el complejo estan en el intervalo de 1-100:1, 1-70:1, 1-60:1, 1-50:1, 1-40:1, 1-30:1, 1-20:1, 1-10:1, 1-5:1, 1:1. Para tales realizaciones, una
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razon preferida de acido fftico con respecto a protema en el complejo es de aproximadamente 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1 o 1:1. Para tales realizaciones, una razon preferida de acido fftico con respecto a protema en el complejo es de aproximadamente 60:1.
En algunas realizaciones preferidas, la razon del acido fftico con respecto a la protema en el complejo (fase dispersa, por ejemplo un complejo o producto agregado de fitato-protema) esta en el intervalo de 1-90:1-100, 1-80:1100, 1-70:1-100, 1-60:1-100, 1-50:1-100, 1-40:1-100, 1-30:1-100, 1-20:1-100, 1-10:1-100, 1-5:1-100, 1:1-100. Para tales realizaciones, los ejemplos de una razon preferida de acido fftico con respecto a protema en el complejo estan en el intervalo de 1:1-100, 1:1-70, 1:1-60, 1:1-50, 1:1-40, 1:1-30, 1:1-20, 1:1-10, 1:1-5, 1:1. Para tales realizaciones, una razon preferida de acido fftico con respecto a protema en el complejo es de aproximadamente 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5 o 1:1.
Los ejemplos de una razon preferida del acido fftico con respecto a la protema en el complejo (fase dispersa, por ejemplo un complejo o producto agregado de fitato-protema) estan en el intervalo de 1:6-1:100, preferiblemente 1:20-1:70, mas preferiblemente de 1:45-1:55, mas preferiblemente 1:50. En otra realizacion, la razon del acido fftico con respecto a la protema en el producto agregado o complejo es de 1:6-1:100, preferiblemente de 1:10-1:70, mas preferiblemente 1:15-1:30, mas preferiblemente 1:15.
En una realizacion la concentracion de acido fftico es de 0,1-0,3 mM. Esta es menor que la concentracion utilizada en otros analisis que miden la liberacion de fosfato inorganico. Tambien es al menos 10 veces menor que el fitato encontrado en muchos cereales, que a menudo comprenden 0,2% de acido fftico. Ventajosamente una concentracion de acido fftico inferior hace que el tiempo de reaccion mas corto y conduce a que la reaccion sea de primer orden. Se pueden calcular facilmente y con precision las razones estequiometricas a partir de una reaccion de primer orden conocida. Se pueden ajustar las velocidades de reaccion mediante el ajuste de la concentracion de IP6. Asf, en el caso de una dosis mas alta de fitasa o proteasa, se puede anadir mayor concentracion de IP6 de modo que las velocidades de reaccion se ralenticen para la comodidad de medicion o la observacion.
Ventajosamente, se puede llevar a cabo un analisis para la actividad proteasa o la actividad fitasa de acuerdo con la presente invencion poniendo en contacto la muestra sospechosa de comprender actividad proteasa o actividad fitasa con el medio que comprende la fase dispersa, adecuadamente un complejo de protema-fitato. La muestra y el medio se pueden mezclar si el medio es un ffquido o parte de la muestra se puede aplicar a la superficie del medio si el medio es un gel. Se puede observar el aclaramiento de la turbidez del medio ffquido o una zona clara o halo en un medio de gel.
Ventajosamente no se requieren mas reactivos, que no sean el medio y la muestra para analizar la actividad proteasa o la actividad fitasa. Esto evita la necesidad de reactivos toxicos o reactivos que son perjudiciales para el medio ambiente. Debido a que no son necesarios reactivos toxicos en el analisis de la presente invencion, este se puede realizar en condiciones que estan proximas a las condiciones fisiologicas in vivo. Esto hace que el analisis sea adecuado para su uso en la modificacion de la protema fitasa, en las fabricas de piensos y laboratorios de analisis industriales para estimar la actividad fitasa antes de su uso en aplicaciones alimentarias y de piensos. El metodo de la presente invencion tambien proporciona un analisis de una etapa para determinar la actividad proteasa cuando la muestra se mezcla con el medio y se observa el resultado. No se requieren etapas de reaccion adicionales para analizar la actividad proteasa o fitasa. Por ejemplo, no hay ningun requisito para analizar el acido fftico liberado del complejo. El analisis de la presente invencion es adaptable para su uso en una microplaca.
Ventajosamente, debido a uno o mas de los atributos del metodo de analisis de la presente invencion, por ejemplo, un tiempo de reaccion corto, un pequeno numero de reactivos y una reaccion de una sola etapa, la presente invencion es adecuada para el escrutinio de alto rendimiento de actividad proteasa y/o fitasa.
En una realizacion en la que el medio es un gel, por ejemplo gel de agarosa en una placa de Petri, la fitasa o la proteasa formaran un halo claro sobre una placa de agarosa opaca que contiene el complejo de acido fftico-protema. El aumento en el tamano del halo con el tiempo y la dosis de fitasa o proteasa se pueden observar a simple vista o se pueden medir mediante el uso de un robot de analisis de imagenes asistido por una camara. Se puede anadir opcionalmente un reactivo de color a la placa para hacer mas facil de ver la zona clara. Si se anade un reactivo de color el metodo es un metodo de punto final ya que el reactivo de color por lo general detendra la reaccion de la fitasa o la proteasa.
El metodo de la presente invencion se lleva a cabo preferiblemente en un intervalo de pH entre 2,5 y 8,5. En una realizacion, el intervalo de pH es un pH de 3 a 3,5. Este intervalo de pH es ventajoso porque, en este intervalo de pH, la fitasa es activa mientras que el sustrato es mas estable y el analisis resulta menos afectado por las altas concentraciones de sustancias que interfieren, tales como diversas sales. En una realizacion, el pH del medio se puede ajustar al pH optimo para la actividad fitasa o proteasa que se esta sometiendo a ensayo.
En otro aspecto, la presente invencion utiliza un kit para la deteccion de la actividad proteasa o fitasa utilizando el metodo de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores.
En una realizacion, el kit puede comprender una fase continua en forma de un gel y una fase dispersa. En esta realizacion, el kit puede comprender ademas un recipiente adecuado, por ejemplo una placa de Petri, para contener
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el gel. El gel puede ser suministrado con pocillos o agujeros donde se pueden anadir las muestras que se van a someter a ensayo. El kit puede comprender uno o mas controles o patrones. Estos se pueden suministrar en forma lfquida, en forma seca o preservada o se pueden anadir previamente al gel.
En otra realizacion, el kit puede comprender una fase dispersa en forma de un lfquido, y una fase continua. El kit puede comprender ademas una serie de tubos de reaccion o una microplaca. En otra realizacion, el kit puede comprender una fase dispersa seca, o preservada, por ejemplo, secada por congelacion o depositada en el interior de un tubo de reaccion. En esta realizacion, el kit puede comprender tambien la fase continua en forma de lfquido o de componente secado o preservado, por ejemplo, un polvo que puede formar la fase continua cuando se anade agua. La fase continua se puede depositar en el interior de un tubo de reaccion. El kit tambien puede comprender uno o mas controles o patrones. Los controles o patrones pueden estar en forma lfquida, en polvo o preservada.
Los kits de la presente invencion pueden comprender ademas diagramas de color o patrones de turbidez para la comparacion con las muestras.
Preferiblemente, el metodo, el uso o el kit de la presente invencion son un metodo, un uso o un kit in vitro. Definiciones
La actividad enzimatica se define como la capacidad de una enzima para catalizar una reaccion. Esto se relaciona con la cantidad de enzima activa en una muestra. Cualquier enzima que se encuentre en la muestra, pero este inactiva no se mide por una medida de la actividad enzimatica. Esto tiene la ventaja de que solo la enzima activa se toma en cuenta y las enzimas inactivas, por ejemplo las enzimas desnaturalizadas o mal plegadas y aquellas unidas a inhibidores no se incluyen en la medida de la actividad enzimatica. En una realizacion, la actividad de la enzima puede ser una actividad de hidrolisis.
El medio es el sustrato en el que la reaccion tiene lugar. El medio puede estar compuesto por una mezcla de sustancias y puede comprender dos sustancias en diferentes fases, por ejemplo un gel y un solido o un lfquido y un solido.
En una realizacion, la fase continua puede ser un lfquido, por ejemplo, agua o un tampon. En otra realizacion, esta puede ser un gel, por ejemplo un gel de agarosa o un gel de poliacrilamida o cualquier gel formado por una sustancia polimerica.
La fase dispersa puede consistir en partmulas de un solido o un gel dispersas en la fase continua. Las partmulas pueden ser discretas entre sf. Cada partmula de la fase dispersa puede estar formada por dos o mas componentes mantenidos juntos por una interaccion intermolecular. La fase dispersa puede ser un complejo que comprende dos o mas componentes.
Una interaccion entre dos o mas partmulas o moleculas puede ser, por ejemplo, una interaccion electrostatica o hidrofoba. En una realizacion, el medio comprende una fase dispersa en donde cada partmula de la fase dispersa se compone de al menos una molecula de protema y al menos una molecula de fitato o sus productos de degradacion. El fitato puede ser un ester fosfato de m/o-inositol, por ejemplo, hexakisfosfato de m/o-inositol (IP6) y sus productos de degradacion pentakis-, tetrakis-, tris-, bis-, y monofosfato de m/o-inositol (IP5, IP4, IP3, IP2 e IP1). La protema y el fitato y sus productos de degradacion pueden estar unidos por una interaccion electrostatica en donde las una o mas protemas tienen uno o varios grupos de carga positiva, preferiblemente el medio esta a un pH por debajo del punto isoelectrico (pi) de la protema y la protema esta cargada positivamente. La protema puede formar una interaccion electrostatica con el acido ftico cargado negativamente.
La muestra puede ser cualquier sustancia que se sospecha que comprende una actividad enzimatica, por ejemplo, una actividad proteasa o una actividad fitasa. La muestra puede ser, por ejemplo, un alimento, un pienso, un ingrediente de pienso, un componente de un alimento, un componente de un alimento, una preparacion de enzima, un caldo de fermentacion o un medio de cultivo celular que contiene la enzima que se va a someter a ensayo.
La muestra puede ser un extracto de uno cualquiera o mas de los ejemplos anteriores que puede ser extrafda en agua o en otro disolvente, por ejemplo un tampon o un disolvente organico. El disolvente puede ser compatible con la fase continua utilizada en el mismo analisis, por ejemplo los disolventes deben ser miscibles y no sufrir reacciones entre sf que afecten adversamente al analisis. En una realizacion, el disolvente puede ser el mismo que se utiliza en la fase continua del mismo analisis.
La fase dispersa puede ser afectada por la hidrolisis de uno de los componentes de la fase dispersa. Por ejemplo, la hidrolisis de una protema que forma parte de la fase dispersa o la hidrolisis de un grupo fosfato del fitato y sus productos de degradacion que forman parte de la fase dispersa. En una realizacion la hidrolisis es de un grupo fosfato de hexakisfosfato de m/o-inositol (IP6) para formar pentaquifosfato de m/o-inositol (IP5).
La propiedad detectable del medio puede ser una propiedad optica, por ejemplo, densidad optica, turbidez o fluorescencia. La propiedad optica puede ser detectada a simple vista o mediante el uso de un dispositivo optico tal como un espectrofotometro, turbidfmetro, espectrofotometro, fluonmetro.
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El cambio detectable puede ser una reduccion de la cantidad de turbidez, un cambio en la absorbancia de luz o un cambio en la propiedad de fluorescencia o fosforescencia del medio.
Un control negativo puede ser una parte del medio al que no se anade la muestra o a la que se anade una muestra de control, que se sabe que no comprende la actividad de la enzima, o donde la muestra que contiene la enzima o las enzimas se ha desactivado, por ejemplo, por medio de calentamiento o mediante la adicion de un inhibidor de la enzima o un agente desnaturalizante al medio o al gel. En una realizacion, el medio esta en forma de un gel en una placa de Petri. La muestra se anade a una seccion del gel y no se anade muestra o se anade una muestra de control a otra seccion del gel. La seccion del gel donde no se anade ninguna muestra o se anade una muestra de control puede ser comparada con la seccion del gel donde se ha anadido la muestra para evaluar la diferencia de la turbidez. En un analisis lfquido el medio lfquido con la muestra anadida puede ser comparado con un medio lfquido en el que no se ha anadido muestra o se ha anadido una muestra de control.
Un control positivo puede ser una parte del medio o una muestra que contiene una cantidad conocida de actividad enzimatica. En una realizacion, se puede elaborar un control positivo mediante la inactivacion de las enzimas en una porcion de la muestra que se va a someter a ensayo, por ejemplo por medio de calentamiento, y despues anadiendo una cantidad conocida de actividad enzimatica. Esto tiene en cuenta los componentes de la muestra que pueden afectar a la velocidad de reaccion, por ejemplo, la posible presencia de inhibidores, el tipo de pienso y el tipo de matriz de pienso en la muestra. En un analisis en placa de Petri con el medio en forma de gel, la muestra de control positivo puede anadir gota a gota sobre el medio y formara una zona clara en el medio turbio. El tamano de la zona clara causada por la muestra de control puede ser comparado con el tamano de la zona clara provocada por la muestra que se va a someter a ensayo.
Con respecto a los controles positivos, se pueden elaborar patrones de fitasa con cantidades conocidas de unidades de fitasa NaCl al 10% a un pH 2,5 a 7,5, preferiblemente a un pH de 4,5 o un pH de 5,5 en glicina-HCl 0,2 M, tampon de acetato, Mops-NaOH 0,1 M o en soluciones que contienen alcohol de azucar, tal como sorbitol. Los patrones de fitasa pueden estar, alternativamente, en forma solida, tal como en una forma recubierta, adsorbida en diversos portadores, tales como subproductos de cereales o depositados en el interior de un tubo de reaccion.
Una placa de control negativo puede ser la misma que la placa de toma de muestra, excepto que, ademas, tiene fluoruro de sodio (5-50 mM), que sera capaz de inhibir la actividad fitasa por completo. Esto significa que no se formaran halos (zonas claras) en esta placa debido a la actividad fitasa. Si se forma un halo, esto se debe muy probablemente sustancias que interfieren.
La propiedad detectable del medio puede ser comparada con muestras patron con actividad fitasa conocida. Los patrones se pueden utilizar para construir una curva patron o curva de calibracion con la que se puede comparar la propiedad detectable del medio. El kit de la presente invencion puede incluir uno o mas patrones o curvas patron o curvas de calibracion. La curva de calibracion puede tener un lfmite inferior de 300 UFT (unidades de actividad fitasa)/kg.
La sensibilidad de un analisis de fitasa realizado en una placa de Petri con agarosa o una microplaca se puede modular de acuerdo con la dosis de fitasa, se puede ajustar la velocidad de reaccion o el tamano del halo ajustando la concentracion de IP6. De 0,1 mM a 0,2, 0,3, etc. Cuanto mayor sea la concentracion de IP6 (fitato) mas baja sera la sensibilidad. En una realizacion la concentracion de acido ftico preferida es de 0,1 mM.
La razon optima en ml/mg (peso) entre las protemas (beta-casema, protemas de soja) y la lisozima es de 10-12, por lo que la razon entre la protema y el fitato debe ser de 1000 a 0,01.
En una realizacion, para los analisis de actividad fitasa, se pueden anadir inhibidores de la proteasa al extracto de pienso o a la muestra que se va a someter a ensayo para evitar que la actividad proteasa afecte a los resultados del analisis. En otra realizacion las proteasas actuan sobre la fase dispersa significativamente mas despacio que las fitasas, por lo tanto, el analisis se puede incubar durante un tiempo corto para evitar que la actividad proteasa afecte a los resultados.
En otra realizacion, para los analisis de proteasa, se pueden anadir inhibidores de fitasa al extracto de pienso o a la muestra que se va a analizar. En otra realizacion, para los ensayos de proteasa, la fase dispersa puede ser un complejo de protema con un sulfato de inositol, por ejemplo hexasulfato de m/o-inositol (MIHS). Esto puede evitar que la actividad fitasa afecte a los resultados del analisis de proteasa.
Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "alimento" se emplea en un sentido amplio y abarca alimentos y productos alimentarios para seres humanos asf como alimentos para animales (es decir, pienso). El termino "pienso" se utiliza en referencia a los productos que se administran como alimento para los animales en la cna de ganado. En un aspecto preferido, el alimento o el pienso son de origen vegetal, por ejemplo a base de cereales. En una realizacion, el pienso es un pienso animal a base de soja/trigo o de soja/mafz.
El alimento o pienso puede ser en forma de una solucion o en forma de un solido dependiendo del uso y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.
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Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "ingrediente alimentario o ingrediente de pienso" incluye una formulacion, que esta o se puede anadir a los alimentos o piensos e incluye formulaciones que se pueden utilizar a niveles bajos en una amplia variedad de productos. En una realizacion, el alimento o ingrediente de pienso puede comprender o consistir en un grano, tal como mafz o trigo, soja y/o un micro-organismo. Los ejemplos de ingredientes de pienso que comprenden productos de plantas que contienen fitato incluyen harina de mafz, harina de soja, harina de colza, harina de semilla de algodon, mafz, trigo, cebada y/o sorgo.
El ingrediente alimentario o ingrediente de pienso puede estar en la forma de una solucion o en forma de un solido - en funcion de la utilizacion y/o el modo de aplicacion y/o el modo de administracion.
Las sustancias, por ejemplo sales, que pueden interferir en la interaccion entre la protema y el fitato o interferir en la actividad fitasa o proteasa pueden ser retiradas de extracto de la muestra mediante diversas tecnicas de separacion, por ejemplo, filtracion en gel, intercambio ionico o utilizacion de una membrana de desalacion.
Ventajas
Ya se han presentado algunas ventajas. A continuacion se describen otras ventajas.
La presente invencion proporciona un analisis de actividad fitasa o un analisis de actividad proteasa que se pueden llevar a cabo sin detener la reaccion enzimatica. El analisis tambien se puede realizar utilizando protemas naturales.
Ventajosamente, los analisis para la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente invencion pueden ser seguidos en tiempo real. El metodo no se basa en el analisis de los productos finales de la reaccion y por lo tanto se pueden llevar a cabo estudios cineticos.
Ventajosamente, los analisis para la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente invencion se pueden llevar a cabo cuantitativamente, semi-cuantitativamente o cualitativamente.
Ventajosamente, los analisis de la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente invencion se puede realizar rapidamente. En la presente invencion la primera etapa de hidrolisis se puede medir, p.ej. hidrolisis de IP6 a IP5. Esto hace mas rapido el analisis porque no hay ningun requisito para que la reaccion se complete con el fin de medir la actividad enzimatica. El analisis de la presente invencion puede medir la velocidad de reaccion en lugar de los productos de una reaccion completada. En la presente invencion se puede obtener una indicacion de actividad de la enzima a partir de la velocidad de reaccion inicial. Esto hace que los analisis de actividad de la presente invencion sean mas rapidos debido a que se puede obtener una indicacion de la actividad de la enzima a partir de la velocidad inicial de la hidrolisis. Los metodos de la tecnica anterior son mas lento debido a que la reaccion tiene que completarse de manera que se puedan medir los productos de la reaccion para proporcionar una indicacion de la actividad enzimatica.
Ventajosamente, la presente invencion proporciona metodos para el analisis cinetico de la actividad enzimatica.
Ventajosamente, los analisis de la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente invencion pueden ser seguidos a simple vista. En particular, se puede realizar un analisis cualitativo o semicuantitativo sobre placas de agar mediante la observacion de los cambios en la turbidez a simple vista. Esto hace que el analisis sea simple de realizar.
Ventajosamente, los analisis de la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente invencion se pueden realizar sobre polipeptidos de origen natural in vitro.
Ventajosamente, los analisis de la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente invencion se pueden realizar utilizando reactivos no toxicos.
Ventajosamente, los analisis de la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente
invencion se pueden realizar sobre extractos de piensos, alimentos o caldo de fermentacion, por ejemplo extractos
de pienso con una base acuosa, sin etapas de purificacion adicionales.
Ventajosamente, los analisis de la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente invencion se pueden realizar sobre muestras biologicas, por ejemplo extractos de pienso, sin que el fondo del analisis se complique por los productos qmmicos, tales como el fosfato inorganico, que existen naturalmente en las muestras biologicas.
Ventajosamente, los analisis de la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente
invencion son altamente espedficos, ya que miden directamente la reaccion catalizada por la enzima en lugar de
cuantificar la protema la cantidad de protema enzimatica presente, que puede estar en forma tanto activa como inactiva, como en el caso del metodo basado en anticuerpos, por ejemplo se pueden realizar ImmunoStrip y ELISA sobre muestras biologicas, por ejemplo extractos de pienso, sin que el fondo del analisis se complique con por os productos qmmicos, tales como el fosfato inorganico, que existen de naturalmente en las muestras biologicas.
Ventajosamente, los analisis de la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente
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invencion se pueden realizar sin el uso de anticuerpos.
En particular en fitato de pH acido interacciona con las protemas de la dieta conduciendo a la formacion de productos agregados y precipitados de fitato y protema que tienen una menor accesibilidad a las proteasas y pueden dar como resultado una digestion ineficaz de las protemas. Ventajosamente, los analisis de la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente invencion se pueden utilizar para estudiar la influencia del acido fftico sobre la digestion de protemas por las proteasas. En una realizacion de la presente invencion, el sustrato sobre el que actua la proteasa es una fase dispersa que comprende un complejo de protemas con acido fftico.
Ventajosamente, los analisis de la actividad enzimatica con los metodos, usos o usos de los kits de la presente invencion se pueden utilizar para analizar espedficamente la actividad fitasa y distinguirla de la actividad fosfatasa.
Ventajosamente, los analisis de la actividad fitasa con los metodos, usos o usos de los kits de la presente invencion se puede realizar muy rapidamente debido a que la hidrolisis de un solo grupo fosfato, por ejemplo la hidrolisis de IP6 a IP6, proporciona una propiedad detectable que se correlaciona con la actividad fitasa. No es necesario eliminar todos los grupos fosfato para proporcionar inositol con el fin de realizar el analisis.
Ventajosamente se puede obtener una indicacion de la actividad de la enzima por la velocidad de reaccion inicial, por lo tanto, no es necesario que todo el sustrato, por ejemplo IP6, sea hidrolizado con el fin de proporcionar una indicacion de la actividad enzimatica.
La presente invencion se describira a continuacion a modo de ejemplo solamente.
Ejemplos
Abreviaturas: UFT, unidad de actividad fitasa; IPa, acido fftico, fitato de sodio; IPx, esteres fosfato de m/o-inositol, donde x denota el numero de enlaces de ester fosfato; Pi, fosfato inorganico.
Seccion Ejemplos - Parte A
1. Preparacion de las soluciones
1.1. Soluciones de acido fftico (hexakisfosfato de m/o-inositol (IP6)), pentakis-, tetrakis, tris-, bis- y monofosfato de m/o-inositol, 10 mM preparadas en agua.
1.2. Solucion de sulfatos de inositol (hexasulfato de m/o-inositol (MIHS)), 10 mM preparada en agua.
1.3. Solucion de glicina-HCl 0,25 M (BG, Tampon G) con pH de 1,5 a 4,0.
1.4. Se prepararon solucion de beta-casema y solucion de protema de soja en BG a una concentracion de 2 mg/ml. La solucion de lisozima se preparo en glicina HCl 0,1 M (pH 3,0) a 2,5-43 mg/ml.
1.5. Phyzyme XP®, una variante de fitasa de E. col/.
1.6. Proteasa P-3000, una variante de subtilisina, una proteasa de Bacillus subt/l/s.
1.7. Extracto enzimatico de pienso: se mezclaron 5 g de pienso con 45 ml de agua y se filtraron despues a traves de papel de filtro o un filtro de fibra de vidrio, que es mucho mas rapido que el papel de filtro. El producto filtrado obtenido se utilizo como extracto de enzima (tambien referido como "producto filtrado" en estos ejemplos). Alternativamente, se mezclaron 12,5 g de pienso con 37,5 ml de agua. Despues de reposar durante un par de minutos, el sobrenadante obtenido se aplico directamente a los pocillos de las placas de Petri sin filtrado. En general, la razon de agua de pienso puede ser de 1:1 a 1:20. La separacion del sobrenadante de las suspensiones de pienso se puede lograr por gravedad o por centrifugacion a 4.000 rpm durante 20 min.
Los cocteles inhibidores de proteasa fueron de Roche (www. Roche.com), y conteman inhibidores para las 4 clases principales de proteasas (serina proteasa cistema proteasa, metaloproteasas, y acido aspartico proteasa).
Todos los otros productos qmmicos se obtuvieron de Sigma Fine Chemicals; incluyendo todas las enzimas incluyendo la fitasa Phyzyme XP® y Protease P-3000® son productos comerciales de Danisco A/S (Brabrand, Dinamarca).
2. Aparatos y utensilios de laboratorio
El espectrofotometro de barrido para microplacas SpectraMax M5 se obtuvo de Molecular Devices Corp. (Sunnyvale, Estados Unidos). Se obtuvieron microplacas de diferentes formatos de Nunc AIS (
www.nunc.com) y Corning (
www.corning.com).
www.nunc.com) y Corning (
www.corning.com).
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3. Sistemas de analisis.
3.1. El metodo del tubo de ensayo/cubeta:
A un tubo transparente o una cubeta se anadieron:
20 |jl de IP6 10 mM (llamado Tubo de ensayo) o MIHS 15 |jl (llamado Tubo de control);
1 ml de solucion de enzima (p. ej., producto filtrado de extracto de enzima de pienso);
1 ml de glicina-HCl 0,25 M de manera que el pH final de la mezcla fuera un pH de alrededor de 3,0.
Despues de mezclar, se leyo la DO a 600 nm utilizando un espectrofotometro o un turbidfmetro, o se observo a simple vista.
La presencia de fitasa en la solucion de enzima provoca una disminucion de la turbidez en presencia de IP6, pero no en presencia de MIHS, que puede actuar como un control negativo. La presencia de la proteasa tendra el mismo efecto que la fitasa no solo en presencia de IP6 sino tambien en presencia de MIHS.
Los ensayos analisis de la actividad fitasa tambien se pueden realizar en presencia de mezclas de inhibidores de proteasa (por ejemplo coctel inhibidor de proteasa de Roche), EDTA a 10 mM, Tween 20 al 0,02% (p/v), pectina al 0,01-0,5% (p/v) y antimicrobianos tales como acido benzoico a alrededor de 0,05-0,5% (p/v). No se encontro que ninguno de fuera inhibidor de la formacion de complejo de IP6 o MIHS con protema de soja y fitasa. Los analisis de proteasa se realizaron en ausencia de inhibidores de proteasa espedficos para la proteasa analizada.
Los Tubos de ensayo y los Tubos de control que conteman IP6, MIHS, protema de soja y uno o mas de los aditivos mencionados anteriormente fueron alternativamente liofilizados. Cuando se pusieron en uso, se anadio el producto filtrado de extracto de pienso directamente a estos tubos que conteman el material seco y se mezclo para disolver el material. Despues de la incubacion, se observo la claridad de los Tubos de ensayo y los Tubos de control.
3.2. El metodo de microplacas:
A una microplaca con formato de 96 pocillos se le anadieron:
2 jl de IP6 10 mM o 1,5 jl de MIHS 10 mM;
0,1 ml de solucion de enzima (p. ej., producto filtrado de extracto de enzima de pienso);
0,1ml glicina-HCl 0,25 M que contema protema de soja, beta-casema o lisozima
de manera que el pH final de la mezcla fuera un pH de alrededor de 3,0. Despues de mezclar, se leyo la DO a 600 nm espectrofotometricamente cada 1-5 min durante 10 min a 16 horas. La presencia de fitasa en la solucion de enzima provoco una disminucion de la absorbancia en presencia de IP6, pero no en presencia de MIHS, que actuaba como control. La presencia de la proteasa tuvo el mismo efecto que la fitasa no solo en presencia de IP6 sino tambien en presencia de MIHS.
3.3. El metodo de la placa de Petri
Se elaboro una solucion de protema de soja a 2 mg/ml en glicina-HCl 0,1 M (pH 3,0) que contema agarosa al 1,5% (p/v) y se calento en un bano de agua para fundir la agarosa. A 1 ml de esta solucion de protema de soja con agarosa se le anadieron 10-40 jl de IP6 10 mM o 10 jl de MIHS, se mezclaron y se vertieron en placas de Petri de manera que cada placa de Petri de 9 centimetros de diametro contema alrededor de 9 ml que teman una concentracion de IP6 de 0,1-0,4 mM. La placa de gel de agarosa que tema MIHS podfa funcionar como un control negativo para el analisis de la actividad fitasa. Como alternativa, una placa de gel de agarosa con NaF 10 mM, que inhibfa la fitasa se podfa utilizar como un control negativo. Tanto MIHS como NaF son inhibidores reversibles de la fitasa. Si se desarrollaba un halo claro en poco tiempo en las placas de control negativo, este podfa estar causado por sustancias que interfieren, tales como iones de carga positiva altamente solubles, por ejemplo Ca2+, que compiten con las protemas con carga positiva que se unen al acido ftico de carga negativa conduciendo a la formacion de halos claros.
Despues de la gelificacion mediante la colocacion de la placa de Petri a temperatura ambiente (preferiblemente por debajo de 30°C), se hicieron agujeros (pocillos) en los geles de modo que cada agujero pudiera contener 20 jl de lfquido. A cada uno de los agujeros se le anadieron 20 jl de extracto de pienso con o sin filtracion. Para los controles negativos, se anadieron 20 jl de tampon de extraccion o agua al agujero en lugar de solucion de enzima. Para los controles positivos y con fines de cuantificacion se anadio al agujero una cantidad conocida de fitasa o proteasa disuelta en el extracto de pienso en vez de extracto de pienso.
Las placas de agarosa en placa de Petri se incubaron a 5-35°C y se observo el aspecto y el tamano de los halos a simple vista, se midio el diametro con una regla o utilizando un sistema de formacion de imagenes digital. Se podfan
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utilizar agar y otros poUmeros formadores de gel en lugar de agarosa. Las placas de Petri pueden ser sustituidas por cualquier recipiente que tenga diferentes dimensiones e incluso pueden ser placas (20x20 cm por ejemplo).
La protema de soja tambien se puede reemplazar por otra protema, siempre que la protema forme una interaccion intermolecular con el componente polivalente para formar una fase dispersa que proporcione una propiedad detectable, tal como la turbidez, al medio o al gel.
En condiciones en las que la protema esta cargada positivamente, se puede sustituir IP6 por cualquier otro componente polivalente con carga negativa como MIHS. En los analisis para la deteccion de proteasa el Ip6 puede ser sustituido por otros componentes polivalentes cargados negativamente tales como polilisina y oligomeros y polfmeros de quitina y quitosano o cualquier protema que tenga carga negativa en las condiciones de analisis.
4. Analisis de la fitasa en las muestras de pienso por metodos convencionales
Esto se llevo a cabo basicamente como describen esencialmente Engelen AJ, van der Heeft FC, Randsdorp PH, Smit EL. Se extrajeron 5 g de pienso con 50 ml de tampon acido acetico-acetato de Na 0,25 M (pH 5,5) que contema, dihidrato de cloruro de calcio 0,0147% (p/v) y Tween 20 al 0,01%. Se mezclaron 0,25 ml de producto filtrado despues de la filtracion del extracto con 0,75 ml de tampon de extraccion, y despues se mezclaron con 2 ml de solucion de sustrato de acido ftico (250 ml de tampon de extraccion que contema 2,1 g de decahidrato de fitato de sodio). La mezcla se incubo a 37°C y se analizo para determinar la liberacion de fosfato inorganico por un metodo de analisis de fosfato tradicional utilizando los reactivos toxicos molibdato-vanadato desarrolladas en los anos 1920 y 1940 (por ejemplo por Fiske (1925) y Lowry (1946)). Una unidad de fitasa (UFT) se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 micromol de fosfato inorganico a partir de fitato de sodio 5,1 mM a 37°C.
5. Elaboracion de patrones de fitasa para la fabricacion de las curvas de calibracion y para ser utilizados como controles positivos
Los patrones de fitasa se elaboraron mediante la dilucion de la solucion de partida de Phyzyme XP® de 7150 UFT/ml a 1 UFT/microlitro con agua. Se anadieron 0-26 microlitros a cada tubo (Tabla 1) y los tubos se colocaron en tubos Falcon de 50 ml en la campana extractora para secarlos al aire.
Tabla 1
- Num. de muestra o tubo.
- UFT/kg 13 g pienso tienen UFT Phyzyme XP® (1 UFT/microlitro) anadida al tubo
- 1
- 0 0 0
- 2
- 100 1,3 1,3
- 3
- 200 2,6 2,6
- 4
- 300 3,9 3,9
- 5
- 400 5,2 5,2
- 6
- 500 6,5 6,5
- 7
- 700 9,1 9,1
- 8
- 1000 13 13
- 9
- 1500 19,5 19,5
- 10
- 2000 26 26
Se anadieron 2-20 pl de solucion de partida de Phyzyme XP® a un tubo Falcon de 50 ml y se sometieron a secado a temperatura ambiente, como se muestra en la tabla 1 anterior de manera que los tubos conteman fitasa en el intervalo de 0-26 UFT/kg. Se anadieron 13 g de un material de pienso diferente que no contema fitasa o que contema fitasa en una cantidad de menos de 50 UFT/kg a cada tubo que contema Phyzyme XP® seco a 0-26 UFT. Se anadio agua para llevar el volumen a 50 ml y el pienso y el agua se mezclaron. Se colocaron muestras de 0.02 ml de cada tubo en los pocillos de una placa de Petri que contema gel de agarosa que contema IP6 0,1 mM y protema de soja de 2 mg/ml. El analisis de la placa de Petri se desarrollo a 22°C durante 7 h, a continuacion, se midio el diametro o la zona de halo. Se trazo una curva de UFT/kg, frente a diametro del halo o la zona del halo.
Alternativamente se pueden anadir 50 ml de agua a los tubos de 50 ml que contienen 1,3-26 UFT y mezclar. Se puede anadir una muestra de 20 microlitros a la placa de Petri que contiene gel de agarosa que contiene IP6 0,1 mM y protema de soja de 2 mg/ml. Las soluciones de fitasa patron deben ser capaces de causar halos claros en el plazo de 16 h. Si no se forma un halo claro en este tiempo el material de pienso o el agua utilizada pueden contener uno o varios inhibidores de fitasa.
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Resultados
1. Agregacion de lisozima de protema de soja, p-casema bovina y clara de huevo de gallina como una funcion de la concentracion de acido f^tico
En la Figura 1a se puede observar que, con el aumento de la concentracion de acido fftico en presencia de protema de soja o p-casema bovina, la turbidez medida a una DO de 600 nm aumento linealmente al principio y luego se estabilizo. La mezcla de reaccion consistio en acido fftico (1 mg/ml) 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 pl, de p- casema o protema de soja 100 pl en glicina-HCl 0,25 M pH 2,5 (Tampon G), y tampon G a un volumen final de 120 pl. La concentracion de protema final fue de 1,5 mg/ml. La mezcla se mezclo y se midio la DO a 600 nm inmediatamente.
En la Figura 1b, se puede observar que la lisozima y el acido fftico pueden formar un complejo con turbidez razonable como se indica por la absorbancia a 600 nm desde pH 2,73 a pH 6,95 sometido a ensayo en 40 mM de diferentes tampones de glicina-HCl, acetato, Mes-NaOH a temperaturas entre 21 y 37°C. Esto indica que el complejo de lisozima (2,5 mg/ml) y acido fftico (0,3 mM) se puede utilizar como sustrato para el analisis de la actividad fitasa o proteasa en un intervalo de pH de al menos pH 2,73 a pH 6,95 siguiendo la disminucion de absorbancia a 600 nm como consecuencia de la reaccion enzimatica.
En la Figura 2 se puede observar que la turbidez del complejo de acido fftico y protema de soja y el complejo de MIHS y protema de soja aumentaba con el pH. El sistema de acido fftico y protema de soja es aparentemente mas sensible al pH a un pH superior a pH 2,5. La concentracion final de ion poli-negativo (acido fftico o MIHS) fue de 0,2 mM, la concentracion de protema de soja fue de 1,5 mg/ml. La turbidez del complejo de acido fftico y protema de soja aumento linealmente a pH 3,8 y luego se estabilizo (datos no mostrados).
2. Relaciones entre el grado de fosforilacion del inositol y su capacidad para agregar protemas
Se observo que la hidrolisis de un unico residuo de fosfato del acido fftico disminuyo drasticamente su capacidad para formar un complejo con las protemas como la protema de soja (que es una mezcla de diferentes protemas) y la p-casema bovina. El m/o-inositol con 4 o menos de 4 grupos fosfato tiene poca o ninguna capacidad de formar agregados con estas dos protemas.
2.1. Formacion de complejos de protema de soja con acido fftico y sus productos de degradacion
Se sometieron a ensayo los efectos de diferentes esteres fosfato de inositol e isomeros posicionales de IP5 sobre la agregacion de protema de soja. La mezcla de reaccion consistio en 5 pl de ester fosfato (30 nmoles/10 pl), 15 pl de Tampon G y 100 pl de protema de soja en Tampon G. La concentracion final de IP1-IP6 fue de 125 um, la concentracion final de p-casema fue de 1,5 mg/ml. La turbidez como una medida del grado de agregacion se controlo a 600 nm. La concentracion final de los esteres de inositol fue de 125 pM para IP1-IP6 y una concentracion final de protema de soja de 1,45 mg/ml. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 3.
2.2 Formacion de de complejos p-casema con acido fftico y sus productos de degradacion
Se sometieron a ensayo los efectos de diferentes esteres fosfato de inositol e isomeros posicionales de IP5 sobre la agregacion de p-casema bovina. La mezcla de reaccion consistio en 5 pl de esteres fosfato (30 nmoles/10 pl), 15 pl de Tampon G y 100 pl de p-casema en Tampon G. La concentracion final de IP1-IP6 fue de 125 pM, la concentracion final de p-casema fue de 1,5 mg/ml. La turbidez como una medida del grado de agregacion se controlo a 600 nm. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 4.
2.3 Adicion de fitasa
En la Figura 5 se puede observar que la adicion de la enzima fitasa (Phyzyme XP®) aclaraba el complejo de acido fftico y protema de soja turbio. Las condiciones de reaccion fueron las mismas que en el apartado 2.1 anterior, excepto que la temperatura se fijo a 37°C en lugar de a 25°C. El tiempo necesario para que la solucion del complejo de IP6 y protema de soja se aclarara completamente utilizando diferentes concentraciones de fitasa anadida fue: 5 min para 1 U/ml, 12 min para 250 mU/ml, 20 min para 125 mU/ml, 40 min para 50 mU/ml, 1,6 h para 12,5 mU/ml, y 2 h para 6.25 mU/ml (1 U = 1 unidad de fitasa o 1 UFT, 1 U = 1000 mU).
3. Metodos desarrollados para el analisis de fitasa y proteasa utilizando complejo de protema de soja con acido fftico como sustrato
3.1. El metodo del tubo de ensayo/cubeta
La Figura 6 muestra el kit de analisis de la actividad fitasa o proteasa basado en tubo de ensayo (arriba, panel derecho), que se puede complementar con un aparato de sacudimiento (Abajo, panel izquierdo) y un turbidfmetro con cubetas de forma redonda con un volumen que vana de 1 a 25 ml (abajo panel derecho). El panel superior izquierdo de la Figura 6 muestra tubos que contienen ensayos que han sido incubados durante la noche de producto filtrado de extracto de pienso con acido fftico y protema de soja. Desde la izquierda los tubos de la Figura 6 contienen: extracto de pienso que tiene 0 (control), 186, 442, 1129, 2301 y 210, 368 UFT/kg.
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Procedimiento para el metodo del tubo de ensayo/cubeta de analisis rapido de la actividad fitasa
1) Anadir aproximadamente 45 ml de agua (puede ser agua del grifo, agua embotellada potable) a los tubos de pienso de 50 ml que contienen 5 g de pienso de manera que el volumen final sea de aproximadamente 50 ml o 90 ml de agua al recipiente de 100 ml que contiene 10 g de pienso, 180 ml de agua al recipiente que contiene 20 g de pienso.
2) Agitar los tubos/recipientes de modo que la pella de pienso o el pienso machacado se disuelvan (aproximadamente 5-10 minutos). Dejar que los tubos reposen durante un par de minutos para que el sobrenadante se separe de la masa de pienso.
3) Verter el sobrenadante en el embudo para que pueda ser filtrado mediante papel de filtro o un filtro de fibra de vidrio. Recoger unos 3 ml de producto filtrado.
4) Transferir 1 ml de producto filtrado utilizando una pipeta Pasteur graduada desechable al tubo marcado con "Control", que puede contener o bien 1 ml de lfquido que contiene MIHS y protema de soja o MIHS seco y material de protema de soja, sacudir los tubos para mezclar las dos soluciones o disolver el material solido en el tubo.
5) Transferir 1 ml de producto filtrado utilizando la pipeta Pasteur graduada a los tubos marcados como "Ensayo", los cuales pueden contener o bien 1 ml de lfquido que contiene IP6 y protema de soja o bien IP6 seco y el material de protema de soja. Sacudir estos tubos.
6) Observacion. Para el pienso basada en mafz/soja, la diferencia de turbidez entre el tubo de control y el tubo de ensayo que contiene extracto de alimentacion puede ser visto en aproximadamente:
5 minutos con nivel de dosis de fitasa por encima de 2000 UFT/kg de pienso;
30 minutos con nivel de dosis de fitasa por encima de 1000 UFT/kg de pienso;
5 horas con nivel de dosis de fitasa de 500 UFT/kg; y
Durante la noche con nivel de dosis de fitasa de alrededor de 200 UFT/kg.
La reaccion entre el producto filtrado del extracto de pienso y el complejo de IP6 y protema de soja se realiza preferiblemente mediante la colocacion de los tubos en un aparato de sacudimiento como se muestra en Figura 6, panel inferior izquierdo.
El tiempo necesario para observar la diferencia de claridad entre el Tubo de ensayo y los Tubos de control puede variar con diferentes matrices de pienso. Usualmente es mas rapido con pienso a base de mafz/soja que con pienso a base de trigo.
Si no existe diferencia entre el tubo de ensayo y el tubo de control, no se puede excluir completamente que el pienso no tenga fitasa anadida debido a que el pienso puede contener inhibidores de fitasa desconocidos o no caracterizados, lo que a su vez puede afectar al rendimiento de fitasa in vivo despues de la ingesta del pienso por los animales. Se puede realizar un control en el que se anade una cantidad conocida de la enzima fitasa al producto filtrado del extracto de pienso. Si el extracto de pienso con la enzima fitasa anadida no puede causar una disminucion de la turbidez en el tiempo esperado, esto puede ser debido a la presencia de inhibidores de la fitasa.
Alternativamente, se puede comprobar el pH de la mezcla de reaccion, que debe ser preferiblemente pH 2,9 pH-3,1 si se utiliza como sustrato el complejo de protema de soja y acido fftico.
Si no se puede observar diferencia entre los Tubos de ensayo y de control el extracto de pienso puede contener inhibidor o inhibidores de fitasa intrmsecos. En tal caso, la fitasa en el producto filtrado de pienso puede ser separada del inhibidor o de los inhibidores mediante filtracion en gel, intercambio ionico o cromatograffa de afinidad antes del analisis.
La diferencia de claridad entre el Tubo de ensayo y el Tubo de control se puede leer utilizando un espectrofotometro o un medidor de turbidez o simplemente observar a simple vista. La diferencia entre el Tubo de ensayo y el Tubo de control tambien se puede observar por medio de la cantidad de precipitacion en el fondo de los tubos despues de dejarlos reposar durante un cierto tiempo. Usualmente, el Tubo de ensayo no debe tener ningun precipitado o debe tener menos en comparacion con el Tubo de control.
3.2. El sistema de microplacas
El sistema de microplacas es una miniaturizacion del sistema del tubo de ensayo de manera que se pueden analizar muchas muestras en la misma placa de forma simultanea y se pueden verificar mediante el uso de un lector de ELISA o lector de microplacas para la cuantificacion de la fitasa o la proteasa en cualquier longitud de onda entre 200 y 800 nm, preferiblemente entre 350 y 700 nm, mas preferiblemente entre 400 y 600 nm. Puesto que las soluciones turbias pueden absorber luz en la region de longitud de onda visible, tambien es posible, e incluso puede
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ser preferible utilizar lectores de microplacas con filtros en lugar de monocromadores. Ademas, se pueden anadir sondas de cromoforos o sondas de fluorescencia como tioflavina T y DCVJ [9-(dicianovinil)-julolidina] al sistema de reaccion que convertiran la agregacion de protemas y los cambios de turbidez en senales de fluorescencia, que pueden ser controladas por medio de un fluonmetro ( tambien llamado un fluorometro) o un espectrofotometro de fluorescencia.
3.2.1 Complejo de protema de soja con acido ftico como sustrato para la fitasa
La Figura 7 muestra que para el pienso a base de mafz/soja, el pH del complejo de protema de soja con acido ftico debe estar preferiblemente entre pH 2,5 y pH 4,0, donde la diferencia de turbidez es la mas grande. La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo donde una solucion que comprende complejo de protema de soja con acido ftico se mezclo con un volumen igual de extracto en agua del grifo de mafz/soja y se incubo a 25°C durante 5, 30 y 60 min.
La Figura 8 muestra que para el pienso a base de mafz/soja que tema 2301 UFT/kg, llevo 4 min que la solucion se volviera clara, para el pienso que tema 1129 UFT/kg llevo 15 minutos, para el pienso que tema 442 UFT/kg llevo 1,5 h. Para el pienso que tema 233 o 184 UFT/kg, la solucion todavfa no era clara despues de 5 h de incubacion. Todos estos ensayos se realizaron a temperatura ambiente (25°C).
3.2.2 Comparacion de la actividad de fitasa en diferentes muestras de pienso En los siguientes ensayos, cada uno de los micropocillos contema:
2 Ml de IP6, 10 mM;
20 Ml de agua;
100 Ml de producto filtrado de extracto de pienso;
80 Ml de protema de soja.
En el blanco, se omitieron los 2mI de IP6 o el pienso que tema fitasa a menos de 50 UFT/kg, que es el lfmite de deteccion por medio del metodo de analisis de fitasa convencional.
En el control negativo (Ctrl) 2 Ml de IP6 10 mM se remplazaron por 2 Ml de MIHS 10 mM.
Despues de 2 horas de incubacion a 25°C se registro la lectura a 600 nm. Las lecturas se muestran en la tabla de la Figura 9.
Los ensayos se realizaron sobre muestras de pienso seleccionadas al azar de diferentes pafses.
La tabla de la Figura 9 muestra el analisis de fitasa utilizando muestras de piensos seleccionadas al azar de fabricas de piensos de 4 pafses diferentes. Se puede observar que despues de 2 horas a 25°C, la absorbancia de los pocillos en las filas A, B, C, E, F y G, que corresponde a 6 muestras de pienso de Costa Rica (CR), 3 de Australia (AU), y 4 de Francia (F) con Phyzyme XP ® habfa disminuido al valor del blanco, que tema una DO a 600 nm de alrededor de 0,060.
Las muestras de control correspondientes a cada muestra de pienso, pero sin Phyzyme XP ® anadida se muestran en la fila D. Su absorbancia fue similar a la de los controles negativos.
Despues de 2 horas de incubacion a 25°C, 3 muestras seleccionadas al azar de China (CN), mostradas en los pocillos A8-D9, A11-D11, mostraron una DO 600 nm que tambien habfa disminuido, pero no tan significativamente como las muestras de los otros pafses. Fue necesaria una incubacion durante la noche (aprox. 16 horas) para las muestras chinas antes de que sus valores de DO disminuyeran al valor del blanco.
La fotograffa de la Figura 9 fue tomada despues de 2 horas de incubacion de la microplaca a 25°C y representa los resultados de la tabla de la Figura 9 visualmente.
La Figura 10 muestra los cambios de turbidez a lo largo del tiempo del complejo de protema de soja con acido fftico en solucion de glicina 0,25 M a diferentes pH. El producto filtrado de extracto pienso se anadio al complejo y la turbidez de la solucion se siguio a lo largo del tiempo. Las muestras de piensos utilizadas fueron dos muestras de piensos seleccionadas al azar de las fabricas de piensos canadienses que tienen 641 UFT/kg y 988 UFT/kg, respectivamente. Las reacciones se realizaron a 25°C.
Se puede observar que despues de 4 horas de incubacion la turbidez de los producto filtrados de los extractos de pienso incubados con solucion de protema de soja en glicina 0,25 M con un pH de 3,0 en presencia de IP6 (acido fftico) no disminuyo sustancialmente.
Por el contrario, la turbidez disminuyo mas rapidamente para la solucion de protema de la soja en glicina-HCl 0,25 M con pH 2,5 y aun mas rapido a pH 1,9.
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Estos resultados indican que el pH de la mezcla de reaccion puede ser esencial para la hidrolisis catalizada por fitasa de acido f^tico en complejo con las protemas de soja. Esto es debido a que el producto filtrado del extracto de pienso preparado en agua tiene una cierta cantidad de capacidad tamponadora. La capacidad tamponadora del extracto de pienso de diferentes piensos puede variar. Usualmente, el pienso a base de mafz/soja tiene mayor capacidad tamponadora que el pienso a base de trigo. Cuanto mas proximo este el pH final de la mezcla que comprende el producto filtrado, la solucion de protema de soja e IP6, a pH 3 mas rapida sera la reaccion.
La Figura 11a y la Figura 11b muestran la relacion entre el cambio de turbidez y la dosis de fitasa contenida en 12 diferentes muestras de pienso canadiense seleccionados al azar de las fabricas de piensos canadienses. Como se puede observar, dos de las 12 muestras, que se encontro que teman actividad fitasa de 276 y 561 UFT/kg, respectivamente por medio de los metodos de ensayo tradicionales de fitasa, no cambiaron su turbidez de la solucion despues de una incubacion de 2,5 horas.
Es posible que la muestra de pienso que se midio que tema 561 UFT/kg por medio de metodos de ensayo de fitasa tradicionales contenga un fuerte inhibidor de la fitasa. Alternativamente, la cantidad de actividad fitasa medida puede ser afectada por la matriz de pienso. La velocidad de reaccion es mas rapida cuando este ensayo se utiliza con pienso a base de mafz/soja que con pienso a base de trigo/soja. Esto puede ser debido al tipo de polisacaridos en la matriz de pienso. Con el fin de explicar las diferencias en las velocidades de reaccion debidas a la matriz de pienso o a la presencia de inhibidores de proteasa se pueden utilizar controles adecuados.
3.2.2. Complejo de protema de soja con acido fftico como sustrato para la proteasa P-3000®
La Figura 12 muestra complejo de la protema de soja con acido fftico como sustrato para la proteasa P-3000® supervisado mediante absorbancia a 600 nm como una funcion del tiempo de reaccion y a diferentes valores de pH. La mezcla de reaccion contema IP6, extracto de pienso que contiene proteasa P-3000 y solucion de protema de soja en glicina-HCl 0,25 M pH 1,9, 2,5 y 3,0, respectivamente. Las condiciones fueron las mismas que anteriormente excepto que cada pocillo contema 114 unidades de proteasa P-3000. Se puede observar que a pH 3,0 la turbidez disminma con el tiempo, mientras que a pH 1,9 y 2,5 no se pudieron observar cambios significativos en la turbidez, lo que indica que P-3000 como proteasa alcalina no tema actividad a pH demasiado bajo.
4. El metodo de placa de Petri:
4.1 Ventajas del metodo de la placa de Petri
El metodo de la placa de Petri es una alternativa importante al metodo del tubo de ensayo o de la cubeta y al metodo de microplacas.
Algunas de las ventajas del metodo de la placa de Petri son:
1) no siempre existe la necesidad de preparar un control negativo que contenga MIHS puesto que el agua en lugar del extracto de pienso puede funcionar como un control negativo;
2) solo se requieren pequenos volumenes de muestra, por ejemplo, esta tecnica se puede realizar solo con 0,02 ml de la muestra;
3) la etapa de filtracion se puede evitar ya que tambien se pueden usar suspensiones de pienso puesto que las muestras pueden ser aplicadas directamente al pocillo de la muestra en la placa de Petri;
4) se pueden someter a ensayo muchas muestras ensayarse en paralelo en una sola placa;
5) el diametro o el area del halo proporciona una indicacion de cuantas unidades de fitasa hay en la muestra;
6) la comparacion de los halo-diametros entre diferentes muestras es mas sencilla que la comparacion de la turbidez de diferentes tubos;
7) todos los materiales utilizados para el metodo de placa de Petri son seguros y desechables.
El grado de la turbidez o el diametro de los halos con respecto a la cantidad de fitasa presente solo estan proporcionalmente relacionados si la matriz de pienso o la composicion de pienso son las mismas. Si hay la misma cantidad de fitasa pero la matriz de pienso es diferente el tamano del halo puede ser diferente. Por ejemplo, el pienso a base de trigo a 836 UFT/kg tiene un tamano de halo similar al pienso a base de mafz/soja a 442UFT/kg (Figura 14).
La matriz de pienso es la misma que la composicion de pienso. Los agricultores siempre pueden formular su propia composicion de pienso basandose en el coste de diferentes materias primas, y si quieren anadir aditivos adicionales, todos ellos pueden tener cierto efecto (grande o pequeno) sobren la velocidad de reaccion de la fitasa en la degradacion de acido fftico presente en el complejo de protema de soja con acido fftico. Por ejemplo, el extracto de agua de pienso del pienso a base de trigo es mucho mas viscoso que el pienso a base de mafz/soja. Semejante alta viscosidad puede contribuir al hecho de que a la misma dosis de fitasa el tamano del halo es menor si la matriz de
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pienso es a base de trigo en comparacion con la matriz de pienso a base de ir^z/soja. Por lo tanto, las muestras de control se pueden utilizar para cuantificar la cantidad de actividad de la enzima en una muestra particular.
Materiales utilizados para el metodo de placa de Petri (Figura 13):
1. Placa de Petri: La placa de Petri puede tener lmeas de division de color negro y numeracion. Las placas se pueden almacenar en bolsas de plastico cerradas preferiblemente a 8°C o por debajo, pero no congelar.
2. Pipeta: pipeta para succionar 20 pl de extracto de pienso. Puede ser una pipeta Pasteur de plastico desechable.
3. Tubos de plastico o recipientes para la extraccion de piensos
4. Regla convencional.
5. Una mini-incubadora ajustada a 35°C puede ser ventajosa para la incubacion de las placas de Petri de manera que el halo puede aparecer mas rapido.
La Figura 14 muestra los resultados de un analisis realizado mediante el metodo de la placa de Petri de la siguiente manera. Se mezclaron 9 ml de solucion de protema de soja en glicina-HCl 0,25 M de pH 3,01 con 0,095 g de agarosa, se calento, para disolver la agarosa, a continuacion, se anadieron 0,27 ml o 0,36 ml de acido fftico 10 mM de manera que la concentracion final fuera 0,3 y 0,4 mM, respectivamente. Las soluciones se mezclaron y la mezcla se vertio en una placa de Petri para preparar una placa. Despues de enfriar la placa se realizaron agujeros en el gel.
Se anadieron 5 g de pienso a base de mafz/soja que contema fitasa de 0, 186, 233, 442, 1129 y 2301 UFT/kg o 5 g pienso a base de trigo que contema 836 y 1586 UFT/kg, respectivamente, a 45 ml de agua del grifo y se sacudio durante 5-10 minutos para su disolucion. La mezcla se dejo reposar durante 1-2 min y despues se anadieron 20 pl de sobrenadante a cada pocillo de las placas de Petri. La tapa de la placa de Petri se remplazo y se dejo que la placa reposara a temperatura ambiente durante varias horas hasta que se pudo observar el desarrollo de un halo (zona transparente en el gel opaco). El diametro del halo debe ser proporcional a la cantidad de fitasa presente en el extracto. Para las dosis de fitasa superiores, por ejemplo 1000-2000 UFT, el anillo transparente podna verse en el plazo de 10-20 min.
En Figura 14 la placa se incubo a 35°C durante 4 h y a continuacion a 23°C durante 15 h. Esto hizo que la placa "reaccionara en exceso", puesto que los halos se volvieron muy grandes y algunos de ellos se fusionaron entre sf a las dosis de fitasa mas altas, es decir, 1129 y 2301 UFT/kg.
La Figura 14 tambien muestra que los resultados no difieren mucho cuando la concentracion de acido fftico final es 0,3 o 0,4 mM.
En Figura 14 los pocillos se marcan 0, 186, 233, 442, 1129 y 2301, que indica el numero de unidades de fitasa por kg de pienso a base de mafz/soja. Los pocillos marcados 836 y 1586 se refieren a 836 y 1586 unidades por kg de pienso a base de trigo, respectivamente.
El tamano de halo para las muestras de pienso a base de trigo es generalmente mas pequeno que el de las muestras de pienso a base de mafz/soja puesto que el trigo a 836 UFT/kg tiene un tamano de halo similar a mafz/soja a 442 UFT/kg. Esto podna estar relacionado con las diferencias en las matrices de pienso de estos dos piensos. La adicion de xilanasa y pectinasa al extracto de trigo no mejora la actividad fitasa.
La Figura 15 muestra el efecto de la concentracion del tampon en el tamano del halo en el ensayo de la placa de Petri.
Los ensayos cuyos resultados se muestran en la Figura 15 fueron disenados para ver si la concentracion de tampon utilizada para preparar el gel tendna algun efecto sobre el tamano del halo. La concentracion de acido fftico fue 0,4 mM, la agarosa fue al 1,5% (p/v). La protema de soja fue 2 mg/ml. Los resultados indican que el tamano del halo (relacionado con la actividad de Phyzyme XP® ) fue similar para las 4 concentraciones de tampon. El fondo del gel se volvio mas claro con el aumento de concentraciones de tampon. Se puede utilizar una concentracion baja de tampon, por ejemplo glicina-HCl 0,10 M para proporcionar un buen contraste entre las zonas de halo aclaradas y el fondo.
El diametro medio de halo (cm) y la zona de halo (cm2 ) medidos para las 4 placas P de las fotos en los paneles inferiores de la Figura 15 son aparentemente proporcionales a la cantidad de actividad de fitasa en el pienso a 0 (control), 193, 233, 442, 1129, y 2301 UFT/kg (Figura 15-16).
La Figura 17 muestra el efecto de la concentracion de acido fftico (0,1-0,4 mM) y del factor de dilucion en agua del pienso en el tamano de halo del gel de agarosa que contiene glicina-HCl 0,1 M de pH 3,0 y la protema de soja a 2 mg/ml.
Los ensayos mostrados en la Figura 14 muestran que una concentracion de IP6 final de 0,3 o 0,4 mM produjo mas o menos los mismos resultados en tampon de glicina-HCl 0,25 M. La Figura 17 muestra datos adicionales para
5
10
15
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40
concentraciones de IP6 finales de 0,1 y 0,2 mM en glicina-HCl 0,1 M de pH 3,0, y tambien el efecto de diluciones de pienso (razon de volumen de agua (ml) a pienso (g)).
El pienso utilizado fueron 3 muestras peletizadas de trigo a 386 UFT/kg (pocillo 1 a 3), 537 UFT/kg (pocillo 1'-3'), 836 UFT/kg (pocillo 1"-3"), en diluciones 1:5, 1:4,1:3, respectivamente, es decir, a 2 g de pienso pulverizado se les anadieron 10, 8 y 6 ml de agua del grifo, respectivamente; un pienso a base de mafz/soja a 401 UFT/kg en diluciones 1:9, 1:6 y 1:3 en los pocillos CW1, CW2 y CW3, es decir, a 10 g de pienso fue de 90, 60 y 30 ml de agua del grifo, respectivamente. Las 4 placas de Petri (Placa 1-4) se incubaron a 35°C.
El contenido de los pocillos en la Figura 17 se describe a continuacion.
Placa 1 (abajo a la izquierda, 0,1 mM IP6): sentido contrario a las agujas del reloj: 386 FTU/kg para W1 (1:5), W2 (1:4) y W3 (1:3); 537 FTU/kg para W1' (1:5), W2' (1:4), W3' (1:3); 836 FTU/kg para W1" (1:5), W2" (1:4), W3" (1:3). Pocillos intermedios 401 FTU/kg, CW1 (1:9), CW(1:6), CW(1:3).
Placa 2 (abajo a la derecha, 0,2 mM IP6): sentido contrario a las agujas del reloj: 386FTU/kg para: W1 (1:5), W2 (1:4) y W3 (1:3); 537 FTU/kg para W1' (1:5), W2' (1:4), W3' (1:3); 836 FTU/kg para W1" (1:5), W2" (1:4), W3" (1:3). Pocillos intermedios 401FTU/kg para CW1 (1:9), CW2 (1:6), CW3 (1:3).
Placa 3 (arriba a la derecha, 0,3 mM IP6): sentido contrario a las agujas del reloj.: 386FTU/kg para W1 (1:5), W2 (1:4), W3 (1:3). 537 FTU/kg para W1' (1:5), W2' (1:4), W3' (1:3). 836 FTU/kg paraW1" (1:5), W2" (1:4), W3" (1:3). Pocillos intermedios 401 FTU/kg para CW1 (1:9), CW (1:6), CW (1:3).
Placa 4 (arriba a la izquierda, 0,4 mM IP6): sentido contrario a las agujas del reloj: 386FTU/kg para W1 (1:5), W2 (1:4), W3 (1:3). 537 FTU/kg para W1' (1:5), W2' (1:4), W3' (1:3). 836 FTU para W1" (1:5), W2" (1:4), W3" (1:3). Pocillos intermedios 401 FTU/kg para CW1 (1:9), CW2 (1:6), CW3 (1:3).
Observaciones (vease la Figura 17):
1) . Opacidad de fondo con respecto a las concentraciones de IP6: el gel de agarosa de la Placa 1 con IP6 0,1 mM tiene un fondo mas claro, mientras que los geles de agarosa en las Placas 2-4 que tienen IP6 0,2-0,4 mM) muestran opacidad de fondo muy similar.
2) . Tamano de Halo con respecto a la concentracion de IP6: Despues de 1 hora a 35°C, comenzo a aparecer el halo. El tamano de halo incremento en general la disminucion de la concentracion IP6 de 0,4 a 0,1 mM, especialmente a los niveles de dosis de fitasa mas bajos. Esto podna explicarse por el tiempo que toma para digerir el IP6 a 0,1 mM en la zona de halo.
3) . Tamano del halo con respecto al factor de dilucion de pienso: En general, una menor dilucion produjo un mayor tamano de halo en todas las muestras de pienso sometidas a ensayo.
4.3 Analisis de la proteasa
El metodo de la placa de Petri tambien se puede utilizar para los analisis de la proteasa. Se prepararon geles de agarosa con protema de soja con acido fftico (0,4 mM) y con MIHS (0,2 mM) siguiendo el metodo descrito en el apartado 4.2 anterior. La cantidad de proteasa P-3000 anadida a cada gel fue: 0 (control), 114, 570, 1140, 2280, 3420 o 4560 unidades. Las condiciones de incubacion fueron de 15 horas a 23°C. A partir de las fotos de la Figura 18, se puede observa que los halos en el gel que contiene acido fftico 0,4 mM (foto de la izquierda en la Figura 18) tienen dos estructuras anulares de color blanco en comparacion con el gel que contiene MIHS (mostrado a la derecha en la Figura 18), ambos de los cuales son drasticamente diferentes en apariencia de los halos formados con fitasa, que por lo tanto se pueden utilizar para distinguir si un halo se produce por la accion de fitasa o proteasa. Los anillos pueden estar formados por productos de hidrolisis de protema de soja insoluble.
Tabla 2
- Composicion de los piensos a base de mafz/soja utilizados
- Composicion del pienso a base de soja con mafz
- Porcentaje (%)
- Mafz
- 60,01
- Harina de soja
- 31,52
- Aceite de soja
- 4,00
- Sal
- 0,40
- DL Metionina
- 0,20
- Piedra caliza
- 1,16
- Fosfato dicalcico
- 1,46
- Composicion de los piensos a base de mafz/soja utilizados
- Composicion del pienso a base de soja con mafz
- Porcentaje (%)
- Vitaminas y minerales
- 1,25
- Total
- 100,00
Las composiciones de los piensos a base de mafz/soja y los piensos a base de trigo/soja se recogen, respectivamente, en la Tabla 2 anterior y en la Tabla 3 a continuacion.
Tabla 3
- Composicion de los piensos a base de trigo/soja utilizados
- Ingrediente
- %
- Trigo
- 72,33
- Harina de soja
- 22,60
- Aceite de soja
- 2,21
- Dical (20% Ca; 18,5% P)
- 1,07
- Piedra caliza (36% Ca)
- 0,30
- Sal
- 0,30
- LisinaHCl
- 0,33
- DL-Metionina
- 0,04
- L-Treonina
- 0,13
- Premezcla V/TM
- 0,70
- TOTAL
- 100
Efecto del pH y la temperatura sobre la estabilidad del complejo de acido fftico-lisozima
5 Es ventajoso que el sustrato de acido fftico-protema sea lo suficientemente estable de modo que se pueda utilizar un sustrato para el analisis de la fitasa. A partir de la Tabla 4 siguiente, se puede observar que la vida media (ti/2) de la reduccion de la turbidez del complejo de IP6-lisozima es de 75 min a 37°C y 1,5 horas a 30°C. Estas estabilidades son mas de lo que se necesita para el analisis de la fitasa, que esta en el intervalo de 10 a 60min.
Tabla 4
Estabilidad del complejo de IP6-lisozima a diversos pH y temperaturas
- Temperatura
- 2,5 <pH <3,5 3,5 <pH <5,5 5,5 <pH
- 45°C
- 10 minutos > 50 min 6 - 12 min
- 37°C
- 75 min 110 -170 min 10-70 min
- 30°C
- > 1,5 h Estable durante 60 minutos > 90 min
- Temperatura ambiente (20 - 25°C)
- 16 dfas 40 - 45 dfas 12 -13 dfas
- Refrigeracion (5 - 8°C)
- 84 dfas No hay cambios en 2 meses > 2 meses
10 El complejo de IP6-lisozima (0,3 mM:0,23 mM) se preparo en un volumen total de 120 pl en glicina-HCl 50 mM (pH 2,5 a 3,5), acetato de sodio 50 mM (pH 3,5 a 5,5) y Tris-maleato 50 mM (pH 5.5 a 8.5) que contema IP6 0,3 mM y lisozima 0,23 mM. Los complejos de IP6-lisozima a diferentes valores de pH se incubaron a diferentes temperaturas y se siguio su turbidez. Los datos se presentan como semivida (t1/2) de la reduccion de la turbidez del complejo de IP6-lisozima.
15 Efecto de la concentracion de fitasa sobre la reaccion catalizada por fitasa utilizando complejo de IP6-lisozima como sustrato
A partir de la Figura 22, se puede observar que utilizando lisozima-acido fftico (IP6) como sustrato a pH 3,5 y 30°C, la velocidad de reaccion es lineal a la dosis de fitasa de la mezcla de reaccion 0,05 a 0,85 UFT/ml de fitasa de E. Coli y de 0,05 a 1,3 UFT/ml de fitasa de A. niger.
20 La mezcla de reaccion contema 12 pl de lisozima (0,23 mM), 12 pl de IP6 (3 mM), 60 pl de glicina-HCl (50 mM, pH
3,5), agua y variante 1 de fitasa de E. Coli (Phyzyme XP®) (a) o fitasa de A. niger (b). La mezcla de reaccion se pre- incubo a 30°C y se mezclo rapidamente durante 2 minutos a 1400 rpm en un termomezclador Ependorf. La reaccion se inicio mediante la adicion de fitasa en varias cantidades. El cambio de turbidez se registro cada 30 segundos durante el curso del tiempo de reaccion. La velocidad de reaccion se expreso como disminucion de mili DO (mDO) a 5 600 nm por minuto.
Uso de acido fftico-lisozima como sustrato para la evaluacion de las fitasas comerciales
Se sabe que el acido ftico esta complejado con sales minerales (lo que se denomina fitina) y protemas en el material vegetal en forma de globoides. Es comercialmente importante que una fitasa pueda hidrolizar eficientemente acido fftico en presencia de protemas. La Tabla 5 muestra que Phyzyme XP es la enzima mas 10 eficiente entre las 4 fitasas sometidas a ensayo. Bajo las condiciones de ensayo la turbidez se puede convertir en pmoles de liberacion de Pi por unidad de tiempo (p. ej., por min). La razon es de 1:3, es dear, la DO600nm disminuye en un factor de 3 que equivale a 1 pmol de Pi liberado.
Tabla 5:
Actividad de diferentes fitasas comerciales sobre el complejo de IP6-lisozima e IP6-protema de soja en comparacion 15 con IP6 como sustrato
- Fitasas
- Actividad relativa (%)
- IP6-protema de soja
- IP6-lisozima IP6-Na
- Fitasa de Escherichia coli Phyzyme XP
- 164,3 229,0 100,0
- Fitasa de Escherichia coli OptiPhos
- 137,8 151,8 102,7
- Fitasa de Aspergillus niger Natuphos
- 31,8 23,1 37,0
- Fitasa de Peniophora Lycii Ronozyme P-(CT)
- 24,5 13,0 9,8
El analisis se llevo a cabo en un volumen total de 120 pl en glicina-HCl 50 mM de pH 3,0 a 37°C para las 5 fitasas diferentes anadidas a una dosis de 0,1 UFT/ml. Las velocidades de reaccion en terminos de liberacion de Pi (pmoles de Pi/ml/min) se midio deteniendo la reaccion a diferentes intervalos de tiempo y analizando Pi en Konelab. La actividad de la variante 1 de fitasa de E. coli (0,096 pmoles de Pi/ml/min) en IP6-Na se establecio como 100%. Las 20 actividades de las fitasas en los otros sustratos se presentan con respecto a la actividad de la variante 1 de la fitasa de E. coli sobre IP6-Na.
Tabla 6
Uso del metodo actual para el estudio del perfil de pH de la fitasa alcalina en helice enrollada de Bacillus sp. en
presencia o ausencia de CaCl2 0,1 mM.
Tampon Glicina-HCL Tampon acetato Tampon Tris-maleato
- pH 2,5 3,5 3,5 4,5 5,5 5,5 6,5 7,5 8,5
- Sin CaCl2
- 7,33 3,99 4,40 3,46 4,11 8,01 6,62 50,97 15,10
- mDO/min
- 0,43 0,16 0,05 0,02 0,07 0,39 0,070 4,57 1,17
- con 1mM
- 20,6 86,4
- CaCl2
- 7,69 5,71 6,47 6 0 100,10 10,50 3,25 2,47
- mDO/min
- 0,74 0,11 0,17 0,77 6,16 7,55 1,249 0,09 0,06
25 Las reacciones se llevaron a cabo en glicina-HCl 50 mM (pH 2,5 a 3,5), acetato de sodio 50 mM (pH 3,5 a 5,5) y Tris-maleato 50 mM (pH 5,5 a 8,5), respectivamente, conteniendo IP6 0,3 mM y lisozima 0,23 mM en un volumen total de 120 pl a 37°C. La dosis de enzima fue de 0.1 UFT/ml basandose en Pi liberado de IP6 en el analisis de actividad fitasa convencional.
Seccion de Ejemplos - Parte B
Un ensayo cinetico sencillo y rapido para fitasas utilizando complejo de acido fftico-protemas como sustrato Materiales y metodos Enzimas y productos qmmicos
5 Las fitasas bacterianas (EC 3.1.3.26) utilizadas en este estudio fueron: fitasa de E. coli a 10000 UFT/g (Phyzyme XP, Danisco, Brabrand, Dinamarca), a la cual se hace referencia aqu como variante 1 de la fitasa de E. coli, fitasa de E. coli a 2000 UFT/g (OptiPhos, JBS United, Indiana, EE.UU.), a la cual se hace referencia aqu como variante 2 de fitasa de E. coli, y fitasa MD2 Bacillus sp. a 163,5 UFT/ml, que se clono y se expreso en los laboratorios de los autores de la presente invencion [33]. Las fitasas fungicas utilizadas en este estudio fueron: fitasa (EC 3.1.3.8) de 10 Aspergillus niger a 5000 UFT/g (Natuphos, BASF Animal Nutrition, Alemania) y fitasa (EC 3.1.3.26) de Peniophora Lycii a 10000 UFT/g (Ronozyme P- (CT), DSM Nutritional Products Europe Ltd, Suiza). El fitato de sodio (IPe) y la lisozima de clara de huevo de gallina (CE 3.2.1.17) se adquirieron de Sigma-Aldrich y otros productos qmmicos de grado analttico se obtuvieron de Merck.
Extraccion de fitasa y determinacion de la actividad
15 Las cuatro fitasas comerciales se obtuvieron en forma granulada y se extrajeron como se describe a continuacion, excepto la fitasa de Peniophora, que fue molida en primera lugar en un mortero para mejorar la extraccion. Las enzimas granuladas o el polvo molido de fitasa de Peniophora (200-500 mg) se dispersaron en 50 ml de agua MilliQ en vasos de precipitados de 100 ml y se agitaron utilizando un agitador magnetico a temperatura ambiente (22°C) durante 30 min. Las suspensiones se dejaron reposar durante la noche (16-18 h) a 5°C para permitir que las 20 partfculas se asentaran. El sobrenadante fue retirado suavemente utilizando pipetas Pasteur, y se diluyo con agua
MilliQ a una concentracion final de enzima de 20 UFT/ml basandose en los valores de UFT proporcionados por los fabricantes. Las soluciones de fitasa convencionales se almacenaron como soluciones de enzima de partida a -20°C para experimentos posteriores. La fitasa del pienso animal (12,5 g) se extrajo con agua MilliQ (37,5 ml), el sobrenadante se obtuvo por centrifugacion y se analizo para determinar la actividad fitasa mediante el uso de P y 25 complejo de IP6-lisozima como sustrato, respectivamente.
Se determino la actividad de las diferentes fitasas bacterianas y fungicas comerciales basandose en la cantidad de Pi liberado de P en tampon de acetato 0,25 M de pH 5,5 a 37°C [24, 25]. La actividad de la fitasa MD2 de Bacillus sp. se analizo en Tris-HCl 0,1 M (pH 7,0). Las soluciones de partida de enzimas se diluyeron a aproximadamente 0,03 UFT/ml en tampon de acetato 0,25 M (pH 5,5) para las fitasas acidas de histidina o en tampon Tris-HCl 0,1 M 30 (pH 7,0) que contema CaCl21 mM y Tween 20 al 0,01% (v/v) para la Fitasa MD2 de Bacillus sp. Se anadieron 2 ml de IP6 7,5 mM en tampon de acetato 0,25 M (pH 5,5) a 1 ml de la solucion de enzima pre-incubada a 37°C durante 5 min. La reaccion se realizo durante 60 min seguido de la adicion de 2 ml de reactivo de parada recien preparada que contema una mezcla 1,5:1,5:1 de heptamolibdato de amonio al 10%, vanadato de amonio al 0,24% y acido mtrico al 65%. Con posterioridad, las mezclas de reaccion se centrifugaron a 8000 g a temperatura ambiente durante 10 min 35 antes de registrar la absorbancia del sobrenadante a 415 nm. Se preparo una curva de calibracion de Pi por tratamiento estandar de soluciones de Pi de KH2PO4 0-4,0 mM sin fitasa anadida en las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Todas las muestras se analizaron portriplicado. La actividad fitasa se calculo a partir de la curva de calibracion de la absorbancia (DO415) frente a la concentracion (mM) de Pi. Una unidad de actividad fitasa (UFT) se define como la cantidad de fitasa que libera 1 mol de Pi por minuto bajo las condiciones de analisis. Los 40 valores de actividad obtenidos para las cinco fitasas se utilizaron para disenar todas las reacciones enzimaticas subsiguientes.
Preparacion de complejo de sustrato de fitato
Se prepararon complejos de sustrato de fitato-proterna en placas de 96 pocillos de fondo plano en un volumen total de 120 |jl. Se anadieron a cada pocillo 60 jl de un tampon espedfico, 12 jl de lisozima de 25 mg/ml, 12 jl de P 3 45 mM y 36 jl de agua Milli-Q, y se mezclaron a 1400 rpm en un termomezclador Eppendorf (modelo:Comfort MTP) durante 2 minutos a temperatura ambiente para formar un complejo de IPs- lisozima homogeneo.
Otros complejos de sustrato (complejo de IP6-proterna de soja, IP6-lisina e IP6-Ca, respectivamente) se prepararon de la misma forma que IP6- lisozima variando la concentracion final de P y los correspondientes ligandos (proterna de soja, lisina o calcio) para obtener la turbidez deseada.
50 Medicion cinetica de la reduccion de la turbidez del complejo de sustrato catalizado por fitasas
Los complejos de sustrato preparados como se ha descrito anteriormente se pre-calientan a 37°C con agitacion vigorosa (1400 rpm) durante 2 min antes de la adicion de 1 a 12 jl de fitasa para llegar a la concentracion de enzima final deseada en UFT. La reaccion se lleva a cabo a 37°C durante 20-60 min utilizando un lector de microplacas (PowerWavex, BioTek Instruments, Vermont, EE.UU.). La reaccion se controlo a 600 nm y los datos se recogieron 55 cada 30 segundos. Antes de cada lectura la microplaca se sacudio al maximo de escala durante 5 segundos. Las reacciones con agua MilliQ en lugar de las muestras de fitasa se utilizaron como controles para cada reaccion
5
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20
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30
35
40
45
enzimatica. Todas las muestras se analizaron por triplicado. La actividad de cada muestra de fitasa se calculo como el porcentaje de reduccion de la turbidez del complejo de sustrato en la densidad milioptica a 600 nm (mDO600) por minuto.
Analisis del fosfato inorganico mediante Konelab
Con el fin de medir el Pi liberado del complejo de sustrato en las reacciones descritas anteriormente, las reacciones se detuvieron a diferentes intervalos de tiempo mediante la adicion de 30 jl de HCl 2,5 N. Las microplacas que teman los reactivos se centrifugaron a 8000 g durante 10 min, y 100 jl de los sobrenadantes claros se transfirieron manualmente a copas de muestra de 0,5 ml para el analisis de Pi mediante Konelab™ Analyser (Thermo Scientific, Ulm, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las muestras se midieron por triplicado.
Analisis mediante HPLC de esteres fosfato de inositol
El sustrato IPe y sus productos de degradacion (IP1-5) de las reacciones catalizadas por fitasa se analizaron en un sistema de cromatografo de iones Dionex DX-500 (Sunnyvale, CA, EE.UU.) con una columna Dionex CarboPac PA- 100 (4 x 250 mm ) y una bobina tejida Dionex (75 jl) para la reaccion post-columna. Las reacciones se detuvieron mediante la adicion de 30 jl de HCl 2,5 N en un momento espedfico y las soluciones se filtraron a traves de membranas de filtro de 96 pocillos (Pall life sciences, DeLand, Florida, USA) con un tamano de poro de 0,45 jm antes de ser inyectadas en el columna de HPLC con un volumen de inyeccion de 100 jm. La separacion se realizo mediante un gradiente lineal de HCl 1 N de 1a 92% a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El eluyente se mezclo en la camara de mezcla post-columna con Fe(NO3)3.9H2O al 0,1% en HCO4 al 2% [23] para la deteccion de los esteres fosfato de inositol. Las muestras se analizaron por triplicado.
Resultados y discusion
Efecto de la concentracion de acido fftico y lisozima sobre la turbidez del complejo de acido fftico-lisozima
La mayona de las protemas de origen vegetal, tales como los derivados de soja, cacahuete, semilla de algodon y semilla de colza, tienen sus puntos isoelectricos (pi) en el intervalo acido (alrededor de pH 4). Por lo tanto la solucion del complejo de IPe con estas protemas desarrolla turbidez cuando el pH es inferior a su pl [34, 35]. Por ejemplo, la solucion de complejo de IPe-protema de soja es turbia solo cuando el pH de la solucion se reduce por debajo de pH 4. Por otra parte, la lisozima de clara de huevo de gallina tiene un pl de alrededor de 11 [36] y es considerablemente estable en el intervalo de pH acido. Se encontro que el complejo de IPe-lisozima mostraba turbidez y estabilidad en un amplio intervalo de pH de pH 2,5 a pH 8,5.
La Figura 23 muestra que la turbidez del complejo de IPe-lisozima aumenta con el aumento de las concentraciones de IPe y lisozima a pH 4,0. A IPe en torno a 0,5 mM y lisozima a 0,35 mM, los niveles de turbidez desaparecen. Se observa mayor turbidez de la solucion a una razon molar de IPe:lisozima > 1,5:1. La razon de IPe 0,3 mM:lisozima 0,23 mM (aproximadamente 2,5 mg de lisozima por ml) se eligio posteriormente para preparar un complejo de IPe- lisozima para su uso como sustrato para diversos analisis de fitasa ya que mostro una alta turbidez (DOe00 > 1) y la reduccion de la turbidez del complejo fue relacionada linealmente con la hidrolisis de IPe en el complejo. Los cambios en el pH, la temperatura y la concentracion de sal se examinaron posteriormente por su impacto en la turbidez y la estabilidad del complejo de IPe- lisozima como se muestra a continuacion.
Factores que afectan a la turbidez y la estabilidad del complejo de acido fftico-lisozima
La Tabla 7 muestra la semivida del complejo de IPe-lisozima basada en su turbidez a diferentes temperaturas y pH. Entre pH 2,5 y 5,5, el complejo era estable durante mas de 10 dfas a temperatura ambiente (22-25°C) y durante dos meses a 5-8°C sin ninguna reduccion significativa de la turbidez. Sin embargo, a temperaturas mas elevadas (>30°C), la estabilidad del complejo se redujo drasticamente, en particular a un pH de 5,5 y por encima, debido a la inestabilidad de la lisozima en estas condiciones. Se observo que las protemas desnaturalizadas incluyendo la lisozima no forman complejos estables con IPe en parte debido a que las propias protemas precipitan despues de la desnaturalizacion.
La dependencia del pH de la turbidez del complejo de IPe-lisozima se muestra adicionalmente en la Fig. 24. Como era de esperar, la turbidez fue alta (DO e00 de 1 a 1,2) en la region acida (pH de 3,5 a 5,5), y empezo a disminuir a aproximadamente pH neutro y se hizo constante en el nivel mas bajo entre pH 7,0 a 8,5, que corresponde a aproximadamente 30% del valor mas alto de la turbidez.
Tabla 7
Estabilidad del complejo de IPe-lisozima a diversos pH y temperaturas.
Temperatura 2,5 <pH <3,5 3,5 <pH <5,5 5,5 >pH
45°C 10 minutos > 50 min e -12 min
37°C 75 min 110 -170 min 10-70 min
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Estabilidad del complejo de IP6-lisozima a diversos pH y temperatures.
- Temperatura
- 2,5 <pH <3,5 3,5 <pH <5,5 5,5 >pH
- 30°C
- > 1,5 h Estable durante a0 minutos > 90 min
- Temperatura ambiente (20 - 25°C)
- 1a dfas 40 - 45 dfas 12 -13 dfas
- Refrigeracion (5 - 8°C)
- 84 dfas No hay cambios en 2 meses > 2 meses
El complejo de IP6-lisozima (0,3 mM:0,23 mM) se prepare en un volumen total de 120 |jl en glicina-HCl 50 mM (pH 2,5 a 3,5), acetato de sodio 50 mM (pH 3,5 a 55) y Tris-maleato 50 mM (pH 5,5 a 8,5) que contema IPa 0,3 mM y lisozima 0,23 mM. Los complejos de IPa- lisozima a diferentes valores de pH se incubaron a diferentes temperaturas y se siguio su turbidez. Los datos se presentan como la semivida (ti/2) de reduccion de la turbidez del complejo de IPa-lisozima.
A partir de la Fig. 24 se puede observar adicionalmente el efecto de algunas sales comunes, NaCl y CaCh, que pueden estar presentes en los tampones de analisis y los extractos de bio-materiales, sobre la turbidez del complejo de IPa-lisozima. Se puede observar que la turbidez del complejo de IPa-lisozima era bastante estable a concentraciones de NaCl por debajo de 15 mM en la region acida (pH 3-5,5) (Fig. 24a). El aumento de la concentracion de NaCl a 30 y 45 mM dio como resultado una disminucion significativa de la turbidez excepto a pH 3,5. La solucion de complejo de IPa-lisozima se volvio clara en presencia de NaCl 100 mM en todos los valores de pH en el intervalo de 3,5 a 8,5.
La investigacion del efecto de concentraciones crecientes de sal de calcio a diferentes pH mostro que la turbidez del complejo de IPa-lisozima era estable a pH 3-4 a CaCl2 <3 mM, pero se redujo drasticamente a mayor concentracion de CaCk especialmente a pH > 4,5 (Fig. 24b). Es bien sabido que iones metalicos divalentes y trivalentes tales como Zn2+, Ca2+, Fe3+ tienen fuertes interacciones con IPa [10]. La Figura 25 muestra que EDTA (en forma de sal de sodio), el quelante usado comunmente en tampones, no era capaz de restaurar la alta turbidez en presencia de Ca2+ y a concentraciones superiores a 10 mM, el propio EDTA tambien contribuyo a la reduccion de la turbidez de la solucion. Debido a la mayor afinidad con el calcio o el hierro, se ha utilizado IPa como un agente quelante alternativo en la terapia para la urolitiasis de calcio [37] y para la inhibicion de Vibrio vulnificus en ratones con septicemia inducida [38, 39].
El fosfato inorganico es el principal producto de la reaccion catalizada por fitasa, y potencialmente puede competir con fitato para unirse a la lisozima cargada positivamente. En el analisis cinetico convencional de fitasa que tiene fitato a una concentracion de 0,3 mM, el Pi final puede ser 1,5 mM cuando todas las moleculas de fitato se convierten en Pi y monofosfato de mio-inositol. Se encontro que a pH 3,5 en glicina-HCl 50 mM la turbidez del complejo de IPa-lisozima no se vio afectada a una concentracion de Pi de hasta 50 mM y la turbidez desaparecio a Pi 80 mM (Fig. 2a). A pH 3,5 a 8,5, el Pi hasta 5 mM no interfirio con la turbidez de los complejos de IPa-lisozima (datos no mostrados).
Los resultados anteriores sugieren que, a pesar de la variacion en la turbidez con diferentes condiciones de ensayo, el complejo de IPa-lisozima puede ser un sustrato ideal para determinar la actividad fitasa siguiendo la disminucion de la turbidez con la condicion de que los controles negativos (sin fitasa o con fitasa desnaturalizada) para cada reaccion enzimatica se ejecuten simultaneamente. Bajo las condiciones de analisis ni las fitasas bacterianas ni las propias fitasas fungicas en el intervalo de mezcla de reaccion de 0,1 a 2,8 UFT/ml causaron turbidez detectable con IPa.
Una comparacion de 5 fitasas microbianas para determina su actividad frente a IPa y diversos complejos de IPa- ligando
La Tabla 8 muestra que las cinco fitasas de origen bacteriano o fungico fueron capaces de hidrolizar el IPa en los complejos de IPa-protema, como se indica por la liberacion de Pi determinado mediante analisis Konelab. Se observa que las fitasas de E . Coli (variante 1 y 2 de fitasa de E. coli) hidrolizan IPa, asf como IPa-lisozima e IPa-protema de soja varias veces mas rapido que las dos fitasas fungicas (Tabla 8), lo que esta de acuerdo con los datos de la bibliograffa que muestran que la fitasa de E. coli tiene mayor actividad a pH 3 que sus homologos fungicos [40]. La actividad de una fitasa a pH a alrededor de 3 es un criterio importante para su eficacia como una enzima para piensos para la nutricion animal. Las fitasas de Peniophora lycii y Bacillus sp. MD2 mostraron la menor hidrolisis de los tres sustratos bajo estas condiciones de analisis. En contraste con la fitasa de A . Niger, las cuatro fitasas mostraron de 1,3 a 2,3 veces mayor actividad frente a IPa-lisozima e IPa-protema de soja que IPa basandose en el Pi liberado. La diferencia en la preferencia de sustrato de estas cinco fitasas podna no estar relacionada con los enlaces ester que se hidrolizan primero puesto que la fitasas de E. Coli y Peniophora lycii inician su reaccion de hidrolisis atacando el enlace ester de la aa posicion en la molecula de fitato [41, 42], mientras que la fitasa de A. niger hidroliza inicialmente en la posicion 3 [43]. La fitasa de Bacillus es un hfbrido 3/a-fitasa, que inicialmente ataca los grupos fosfato de la posicion 3a y/o aa [43] o cualquier posicion del fosfato [44] en las moleculas de fitato. Las observaciones con la fitasa de E. coli mostradas en la Tabla 8 fueron apoyadas adicionalmente por el analisis de los productos de reaccion mediante HPLC que separaron IPa y sus productos de degradacion IP5, IP4, IP3, y IP2 [22]. Se
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confirmo que las fitasas de E . Coli mostraban mayor actividad en la degradacion de IPa en el complejo de IPa- lisozima que IPa en forma de fitato de sodio (datos no mostrados). La razon exacta por la que IPa-protema puede ser un sustrato mucho mejor para las fitasas de E . Coli sigue siendo un enigma y necesita ser examinado mediante RMN 31P. Por otra parte, puesto que IPa puede estar unido a protemas de la semilla en semillas de plantas y a las protemas de alimentos y piensos en las partes superiores de los tractos digestivos de los animales monogastricos que tienen un entorno acido, la hidrolisis eficaz del PIa en el complejo de IPa-protema en condiciones proximas a las condiciones in vivo es un requisito previo para una buena fitasa de pienso.
Tabla 8
Actividad de diferentes fitasas comerciales sobre el complejo de IPa-lisozima e IPa-protema de soja en
comparacion con IPa como sustrato.
Fitasas Actividad relativa (%)
IPa-protema de soja IPa-lisozima IPa-Na
- Fitasa de Escherichia coli Phyzyme XP
- 1a4,3 229,0 100,0
- Fitasa de Escherichia coli OptiPhos
- 137,8 151,8 102,7
- Fitasa de Aspergillus niger Natuphos
- 31,8 23,1 37,0
- Fitasa de Peniophora Lycii Ronozyme P- (CT)
- 24,5 13,0 9,8
El analisis se llevo a cabo en un volumen total de 120 pl en glicina-HCl 50 mM de pH 3,0 a 37°C para las 5 fitasas diferentes anadido a una dosis de 0,1 UFT/ml. Las velocidades de reaccion en terminos de liberacion de Pi (pmol de Pi/ml/min) se midio al detener la reaccion a diferentes intervalos de tiempo y analizando el Pi en Konelab. La actividad de la variante 1 de la fitasa de E. coli (0,09a pmoles de Pi/ml/min) en IPa-Na se establecio como 100%. Actividades de las fitasas sobre los otros sustratos se presentan con respecto a la actividad de la variante 1 de la fitasa de E. Coli en IPa-Na.
La variante 1 de la fitasa de E. coli y la fitasa de A. niger como representativas de bacterias y hongos, fitasas a, y 3, respectivamente, fueron elegidas para examinar adicionalmente su actividad frente al complejo de IPa-lisina. La lisina como aminoacido cargado positivamente y aditivo para alimentos y piensos fue elegida puesto que puede potencialmente formar complejo con IPa in vivo en el tracto digestivo. El complejo de IPa-lisina, a diferencia del complejo de IPa-lisozima, no era turbio a todos los valores de pH entre 3,5 y 8,5. Por lo tanto, su papel como un complejo sustrato con IPa para la fitasa tuvo que ser evaluado mediante la liberacion de Pi. La Figura 27a muestra que mientras que la hidrolisis del complejo de IPa-lisozima por la variante 1 de la fitasa de E. coli fue mas rapida en comparacion con IPa, en lmea con los resultados mostrados en la Tabla 8, la hidrolisis del complejo de IPa-lisina fue mas lenta. En contraste, la fitasa de A. niger no mostro mucha diferencia en sus velocidades de reaccion iniciales con el complejo de IPa-lisina de dos sustratos e IPa (Fig. 27b). Cabe senalar en la Fig. 27a y la Fig. 27b que la fitasa de A. niger se aplicaron dosis 5 veces mas altas que las de la fitasa de E. coli teniendo en cuenta su menor actividad a pH 3,5.
Aparte de los complejos de IPa-protema, el complejo de IPa-Ca2+ tambien puede desarrollar turbidez y por lo tanto puede ser utilizado para el analisis de fitasas siguiendo la disminucion de la turbidez. Sin embargo, la turbidez del complejo de IPa-Ca2+ fue baja (DOa00 <0,2), especialmente a valores de pH inferiores a pH 5,5. El complejo de IPa- Ca2+ podna, sin embargo, ser utilizado como un sustrato alternativo a IPa-lisozima para el analisis de fitasas neutras y alcalinas.
Relaciones entre la disminucion de la turbidez y la liberacion de fosfato
Si el analisis de la actividad fitasa basado en la reduccion de la turbidez del complejo de IPa-lisozima catalizada por las fitasas 3 y a puede reflejar la hidrolisis de IPa, es esencial que sea validado por medio del metodo bien establecido que mide la liberacion de Pi. La Figura 28 muestra que la reduccion de la turbidez (DOa00) de IPa- lisozima en el analisis cinetico desarrollado aqrn se correlaciona bien con el Pi liberado de la misma reaccion enzimatica utilizando fitasas tanto de E. coli (Fig. 28a y Fig. 28b) como de A. niger (Fig. 28d y la Fig. 28e). La actividad de fitasa en estos analisis podna por lo tanto ser medida como mDO/min, que es igual a la pendiente de reduccion de la turbidez en el intervalo lineal (DOa00 = 0,1 a 0,9). La velocidad de reaccion en mDO/min se podna convertir en la unidad comun de la actividad fitasa (UFT/ml) mediante la correlacion con el Pi liberado (Fig. 28c y Fig. 28f). En la Fig. 28c y la Fig. 28f, se estima que cada 1 pmol de Pi liberado por min basandose en los resultados del analisis Konelab esta relacionado con un descenso de la unidad de DO de 3,03 ± 0,27 a a00 nm por min.
Efecto del sustrato y de la concentracion de fitasa
Se encontro que la concentracion optima de sustrato era IPa 0,3 mM y 0,23 mM de lisozima, que se utilizo en todos los analisis en este estudio. Con menor concentracion de sustrato, la turbidez era baja, lo que hizo el intervalo lineal
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de la reaccion mas corto, mientras que con una alta concentracion de sustrato, la disminucion de la turbidez no fue lineal con la concentracion de sustrato. Cabe senalar que el analisis cinetico de fitasa desarrollado aqu se basa en el seguimiento de la hidrolisis del sustrato en lugar de la formacion del producto como en la mayona de los analisis enzimaticos. Esta es tambien una de las razones por las que no se puede utilizar una alta concentracion de sustrato. Debido a esto se encontro que este metodo cinetico no era util para la estimacion de Km y Vmax de las fitasas al igual que el analisis de fitasas colorimetrico convencional. El metodo adecuado de estimacion de Km y Vmax es mediante HPLC [22-23].
En un analisis de pH de 3 a 3,5, temperatura de analisis de 30°C y tiempo de reaccion de 20 a 60 min, la concentracion de fitasa adecuada para las fitasas de E. coli y A. niger estaba en el intervalo de mezcla de reaccion de 0,1 a 0,8 UFT/ml. La actividad de fitasa de algunos cereales, tales como el centeno, triticale, trigo y cebada, esta en el intervalo de 500 a 5000 UFT/kg [45], mientras se informo que los microbios de Aspergilli, E. coli y Bacillus sp. teman una actividad fitasa de caldo de 0,1 a 1,8 UFT/ml [33, 41, 46]. En el estudio actual, se pudieron someter a ensayo muestras de pienso que conteman harina de mafz y de soja y variante 1 de fitasa de E. coli de 400 a 2300 UFT/kg mediante el metodo cinetico, mientras que con el nivel de fitasa a 200 UFT/kg o mas bajo en el pienso el metodo cinetico no era adecuado puesto que la incubacion durante la noche tema que ser larga.
Perfiles de pH de cinco fitasas microbianas utilizando complejo de acido fftico-lisozima como sustrato
Con el fin de evaluar la utilidad del metodo cinetica desarrollado, tambien es importante someter a ensayo este metodo a un amplio intervalo de pH que sea relevante para las fitasas. La Figura 29 muestra las actividades de las cinco fitasas microbianas diferentes como una funcion del pH en el intervalo de pH 2 a 8,5 utilizando complejo de IP6-lisozima como sustrato. En general, los perfiles de pH obtenidos por medio del metodo cinetico (Fig. 29a-29e) concuerdan bien con los referidos en la bibliograffa utilizando IPe como sustrato [31, 32, 37, 41, 42, 40, 47]. A partir de la Fig. 29a y la Fig. 29b, se puede observar que las dos fitasas de E. coli mostraron perfiles de pH similares con complejo de IPe-lisozima como con IPe solo [41, 47] excepto para un pH optimo extendida a la region acida (pH 25,5). Esto podna significar que el complejo de PIe-lisozima como sustrato vuelve a la fitasa mas estable y por lo tanto activo en la region acida. En la Fig. 29a y la Fig. 29b, se puede senalar que, incluso al mismo pH la actividad medida variaba mucho debido a los diferentes tampones utilizados que tienen diferentes fuerzas ionicas que a su vez afectan a la turbidez del sistema. Utilizando el complejo de IPe-lisozima como sustrato, se observo que la fitasa MD2 de Bacillus sp., una enzima dependiente de calcio [31, 32], mostro un cambio de 2 unidades de pH en su pH optimo hacia la region acida en presencia de CaCl21 mM (Fig. 29c). La fitasa de Aspergillus niger mostro dos picos optimos de actividad a pH 5,5 y pH 2 (Fig. 29d) como con IPe, excepto que el segundo pico de pH optimo se desplazo 0,5 unidades hacia la region acida (pH 2 en lugar de pH 2,5) en comparacion con IPe solo como sustrato [37]. El perfil de pH de la fitasa de Peniophora mostro un optimo alrededor de pH 4-5, que esta de acuerdo con el referido anteriormente para la enzima con IPe [42]. La ampliacion de pH optimo en el caso de las fitasas de E. Coli y la fitasa de A. niger, y tambien el cambio de pH optimo en el caso de la fitasa de Bacillus son obviamente ventajosos teniendo en cuenta el pH del tracto digestivo en los animales monogastricos que se encuentra generalmente en el intervalo de pH de 2,5 a e,0.
Conclusiones
El complejo de IPe y lisozima a una concentracion de 0,3 y 0,23 mM, respectivamente, forma una solucion turbia y se puede utilizar para el analisis de la cinetica de la actividad de las fitasas mediante el control de la disminucion de la absorbancia. El deceso de la turbidez se correlaciona bien con la liberacion de Pi. El metodo es util para someter a ensayo las fitasas acidas de histidina, representadas portodas las fitasas comerciales, y la fitasa de helice enrollada sometida a ensayo en este estudio. Tambien fueron investigados como sustratos otros complejos de IPe-ligando que inclrnan IPe-protema de soja, IPe-lisina e IPe-Ca2+, pero fueron menos adecuados que el complejo de IPe-lisozima. En comparacion con el metodo colorimetrico de punto final convencional basado en la medicion de Pi, el analisis cinetico descrito aqrn es sencillo, rapido, seguro, adaptable a escrutinio de alto rendimiento, y tambien mas cercano a las condiciones fisiologicas in vivo, haciendolo mas adecuado para su uso en la modificacion genetica de las protemas fitasas, en las fabricas de piensos y laboratorios de analisis industriales para estimar la actividad fitasa antes de su uso en aplicaciones alimentarias y de piensos.
La utilidad de este metodo se ha demostrado adicionalmente en el estudio de los perfiles de pH de cinco fitasas diferentes. La principal limitacion de este metodo es que la reaccion enzimatica debe ser mezclada bien antes de las mediciones para evitar la precipitacion del complejo de IPe-lisozima, que puede conducir a una mayor desviacion en la medicion. El intervalo lineal de la turbidez a DOe00 (0,1-0,9) es bastante estrecho en comparacion con el intervalo lineal para el analisis colorimetrico de liberacion de Pi. Puesto que este metodo cinetica se basa en la verificacion del consumo de sustrato en lugar de en la formacion del producto como en la mayona de los analisis enzimatico, este no es adecuado para la estimacion de Km y Vmax de los fitasas.
Resumen
Las fitasas acidas de histidina constituyen un importante grupo de enzimas para las industrias de procesamiento de pienso y granos debido a su alta actividad espedfica y amplio optimo de pH para la actividad [1]. La fitasa cataliza la hidrolisis secuencial de fitato (1,2,3,4,5,e-hexakisfosfato de mio-inositol; IPe), una forma principal de almacenamiento
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de fosforo en los cereales y las legumbres, a derivados de mio-inositol menos fosforilados con liberacion concomitante de fosfato inorganico (Pi) [1]. La hidrolisis de fitato supera varios de sus efectos negativos sobre la nutricion humana y animal [2-7] y sobre el medio ambiente [8, 9]. Esta bien establecido que el acido fftico une iones metalicos cargados positivamente [10] y biomoleculas [11] volviendolos no disponibles como nutrientes. En el procesamiento de grano es importante anadir fitasa con el fin de volver el Ca2+ disponible para la a-amilasa [12]. La interaccion con protemas de la dieta con carga positiva conduce a la formacion de agregados y precipitados de fitato-protema, lo que disminuye su accesibilidad a las proteasas, dando como resultado de este modo una digestion de protemas ineficaz [13-18]. La disminucion de la solubilidad de la protema resulta del enmascaramiento de cargas positivas en las moleculas de protema por el acido fftico, que cambia los puntos isoelectricos de las protemas [16, 11].
Se han realizado estudios in vitro con fitasa referidos en la bibliograffa con IP6 como el sustrato y, se han seguido o bien la degradacion de IP6 o bien la cantidad de Pi liberado. Este metodo para analizar la fitasa puede no proporcionar una imagen real de la actividad de la enzima ya que el acido fftico in vivo puede no existir en su forma de acido libre o de sal de sodio. Por otra parte, la determinacion cuantitativa de la degradacion de IP6 es tediosa y lenta [19-21]. Se requiere el uso de tecnicas cromatograficas con multiples dispositivos, ya que ni IP6, IP1-5 ni el Pi se pueden detectar directamente mediante la absorbancia o fluorescencia, lo que pone limitaciones al desarrollo de esta tecnica para un escrutinio de alto rendimiento [21-23]. La medicion del Pi liberado de IP6 por la fitasa es un analisis de punto final que proporciona el desarrollo de color proporcional a la cantidad de Pi liberado, pero requiere una eleccion adecuada de la dosis de enzima y el tiempo de analisis junto con el tedio y el cuidado en el manejo de los reactivos de vanadato y molibdato toxicos [24-27]. El desarrollo del color puede variar con las condiciones de reaccion tales como el pH. Se han hecho intentos para analizar cineticamente fitasa utilizando fosfato de p- nitrofenilo o pirofosfato de p-nitrofenilo como substrato. Sin embargo, es difmil diferenciar si el color amarillo producido tras la hidrolisis del sustrato se debe a la fitasa o la accion de fosfatasas que se producen ampliamente en los materiales biologicos [28-29]. Por otra parte, no todas las fitasas muestran una buena actividad frente a estos dos sustratos artificiales [30-32].
Debido a la importancia en la nutricion animal, la fitasa se convierte en una de las enzimas mas analizadas en la investigacion de piensos y en los laboratorios de analisis industriales de piensos, asf como en las fabricas de piensos. Los laboratorios de investigacion necesitan escrutar variantes de fitasa modificadas geneticamente a protemas con rendimientos mejorados, especialmente estabilidad termica y resistencia a pepsina, mientras que los criadores necesitan un analisis de fitasa con el fin de asegurarse de que la fitasa anadida a su pienso esta todavfa activo para que puedan salvar la adicion del fosfato de calcio. Sin embargo, debido a las sustancias qmmicas toxicas o los equipos espedficos necesarios para el analisis de fitasa, no se ha realizado un analisis de fitasa de rutina fuera de un laboratorio bien equipado. Por lo tanto resulta evidente que existe una necesidad de un metodo simple y alternativo mas rapido para el analisis de fitasas. Las pruebas preliminares de los autores de la presente invencion han demostrado que las fitasas catalizan la hidrolisis de los complejos de protema/peptido-fitato y, en menor medida, complejos con iones de calcio, liberando Pi y reduciendo simultaneamente la turbidez de la solucion de sustrato. En el presente estudio, se establecio el uso de complejo de IP6-lisozima como sustrato para determinar la actividad fitasa cineticamente mediante el control de la reduccion de la turbidez y se comparo con la del metodo tradicional. El metodo desarrollado se utilizo para la determinacion de las actividades de diferentes fitasas bacterianas y fungicas en un amplio intervalo de pH.
La fitasa (EC 3.1.3.) hidroliza el fitato (IP6) presente en los cereales y granos para liberar fosfato inorganico (Pi), volviendolo asf biodisponible. El metodo mas comunmente utilizado para analizar la fitasa, desarrollado hace casi un siglo, mide el Pi liberado a partir de IP6. Este analisis de punto final tradicional consume mucho tiempo y es bien conocido por su complicacion ademas de requerir precauciones especiales para el manejo de los reactivos toxicos utilizados. En este trabajo se informa sobre un metodo cinetico simple, rapido y no toxico adaptable a un alto rendimiento para el analisis de fitasa utilizando IP6-lisozima como sustrato. El analisis se basa en el principio de que IP6 forma complejos turbios estables con lisozima cargada positivamente en un amplio intervalo de pH y la hidrolisis de IP6 en el complejo esta acompanada de una disminucion en la turbidez verificada a 600 nm. La disminucion de la turbidez se correlaciona bien con el Pi liberado de IP6. Se encontro que este metodo cinetico era util en el analisis de fitasas acidas de histidina, incluyendo fitasas 3 y 6, una clase que representa todas las fitasas comerciales, y fitasa alcalina en helice enrollada de Bacillus sp. Se examinaron las influencias de la temperatura, el pH, el fosfato y otras sales en el analisis cinetico. Las sales incluyendo NaCl, CaCl2, y fosfato mostraron todas una interferencia dependiente de la concentracion.
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Claims (14)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Un metodo para la deteccion de una actividad fitasa o una actividad proteasa que comprende las etapas de:(a) proporcionar un medio que comprende una fase continua y una fase dispersa, en donde la fase dispersa comprende:i) un primer componente que es un fitato o un acido fticoii) un segundo componente que es una protemaen donde el primer componente y el segundo componente se mantienen juntos en un complejo por medio de una o mas interacciones intermoleculares; en donde la fase dispersa proporciona una propiedad detectable al medio;(b) proporcionar una muestra que comprende o se sospecha que comprende actividad fitasa y/o actividad proteasa, en donde la actividad fitasa y/o proteasa son capaces de afectar a la fase dispersa causando un cambio en la propiedad detectable del medio;(c) poner en contacto el medio con la muestra;(d) determinar si hay un cambio detectable en la propiedad detectable del medio.
- 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la propiedad detectable es laturbidez.
- 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde la protema se selecciona del grupo que consiste en: casemas, protemas de soja, protema de colza, protema de mostaza, hemoglobinas porcinas, casema N,N-dimetilada, beta-lactoglobulina bovina, albumina de suero bovina o de cerdo, lisozima, una protema modificada con un cromoforo, y cualquier combinacion de las mismas.
- 4. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la razon del acido ftico con respecto a la protema en el complejo esta en el intervalo de 1-100:1-100.
- 5. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medio esta entre pH 1,8 y pH 8,5.
- 6. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el metodo comprende la comparacion del cambio en la propiedad detectable del medio con respecto a un control.
- 7. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medio es un lfquido o un gel y esta turbio.
- 8. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra es una muestra biologica, y preferiblemente en donde la muestra biologica es una preparacion de enzima, un caldo de fermentacion, un alimento, un pienso, un ingrediente alimentario, un ingrediente de pienso, un producto alimentario procesado o un producto de pienso procesado o un extracto de uno cualquiera de los mismos.
- 9. El uso de un kit para la deteccion de la actividad proteasa y/o la actividad fitasa de acuerdo con el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho kit comprende un medio que comprende una fase continua y una fase dispersa, en donde la fase dispersa comprende:i) un primer componente que es un fitato o un acido fticoii) un segundo componente que es una protemaen donde el primer componente y el segundo componente se mantienen juntos en un complejo por una o mas interacciones intermoleculares en un lfquido o un gel; en donde la fase dispersa proporciona una propiedad detectable al medio.
- 10. El uso de un kit de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde dicho kit comprende una composicion lfquida turbia o una composicion en gel turbia, en donde a turbidez se puede reducir por la actividad fitasa y/o la actividad proteasa.
- 11. El uso de un kit de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde dicho kit comprende una composicion que se puede utilizar para detectar la actividad proteasa o la actividad fitasa.
- 12. El uso de un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el uso de un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para someter a ensayo la actividad enzimatica en una muestra biologica, preferiblemente para someter a ensayo la actividad fitasa y/o la actividad proteasa en una muestra biologica.
- 13. El uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde la muestra biologica es una preparacion de enzima, un caldo de fermentacion, un alimento, un pienso, un ingrediente alimentario, un ingrediente de pienso, un producto alimentario procesado o un producto de pienso procesado o un extracto de uno cualquiera de los mismos.
- 14. El uso de un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el uso de un kit de acuerdo 5 con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 para el escrutinio de actividades enzimaticas de nuevas moleculasde enzima.
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