CN102590167A - 一种测定酵母蛋白酶a活性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定酵母蛋白酶A活性的方法，属于发酵工程领域。本发明利用共振光散射技术建立起一种测定酵母蛋白酶A活性的新方法。根据三氯乙酸可以与微量蛋白质缔合形成缔合微粒，并且此微粒的浓度在一定条件下与共振散射光强度呈正比关系的原理，用三氯乙酸缔合酵母蛋白酶A与底物酪蛋白反应前后溶液中的蛋白质，用荧光分光光度计测定其光强，根据酪蛋白的降解量得到酵母蛋白酶A活性。此方法具有检测限低、灵敏度好、稳定性高、线性范围宽、受干扰物影响小，并且快速简便、检测成本低，可以满足测定发酵液和啤酒中微量蛋白酶A活性的要求，具有较大潜力，为酵母蛋白酶A的深入研究提供可靠基础。
Description
技术领域
一种测定酵母蛋白酶A活性的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
酵母蛋白酶A(EC3.4.23.6)是一种天冬氨酸族蛋白酶，由PEP4基因编码。被分泌到胞外的蛋白酶A可通过降解发酵液和成品啤酒中的泡沫活性蛋白，从而降低纯生啤酒的泡沫稳定性。如何准确测定纯生啤酒中极微量的蛋白酶A一直是研究者所关注的问题。
已有的蛋白酶A检测方法大致可分为两类：利用天然底物测定和利用合成底物测定。天然底物可使用酪蛋白、偶氮酪蛋白、变性血红蛋白、非折叠肌红蛋白、胰岛素A链及B链、核糖核酸酶等，一般使用紫外分光光度法、Lowry法或Bradford法检测。合成底物包括生色肽、荧光肽等，利用底物显色或释放出荧光素来反映蛋白酶A的活性。这些方法或多或少存在一些缺陷，利用天然底物检测灵敏度较低，利用合成底物可以提高检测的灵敏度，但是也存在操作繁琐，或者价格昂贵、底物不易获得等缺点。
近年来新兴的共振散射光谱法(RSS)因其具有灵敏度高、简捷、快速等优点而得到迅猛发展。1975年，Bauer等人通过对二苯基多烯分子吸收体系的光散射的研究，第一次发现了溶液中分子的共振增强瑞利光散射现象。1993年，Pasternack等人利用普通荧光分光光度计建立了共振光散射检测技术，开创了该技术在分析化学中应用的先河，此项技术不仅灵敏度高、选择性好，而且简便易行。在此基础上，1996年，Huang利用α，β，γ，δ-4-(4-三甲基氨苯基)卟啉首次将共振光散射技术应用于核酸浓度的检测。稍后，此项技术又在痕量蛋白质检测中得到应用。在之后的十多年中，共振光散射技术逐渐应用于生化分析、有机分析、环境分析和无机分析等领域。但是，共振光散射技术在酶催化中的应用报道不多，还未见有在测定蛋白酶A酶活方面的报道。由于蛋白酶A对啤酒泡沫的负面影响，严重制约了纯生啤酒的发展。建立一种高效、精确、低廉的酵母蛋白酶A检测方法是迫切需要解决的问题，这将为酵母蛋白酶A的深入研究提供可靠基础，进而推动整个纯生啤酒行业的发展。
本发明利用酪蛋白与三氯乙酸相互作用形成缔合微粒，在468nm处产生较强的共振散射峰，建立了测定酵母蛋白酶A活性的新方法。与现有技术相比，此方法具有快速便捷、检测成本低、检测限低、线性范围宽等优点，各种可能的共存物对测定结果影响不大，并且测定体系可在较长时间内保持稳定。
发明内容
本发明的目的是建立一种快速简便、成本低廉、稳定准确的酵母蛋白酶A活性检测方法，为啤酒厂纯生啤酒泡沫稳定性的预判提供可能，也为蛋白酶A的深入研究奠定基础。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：根据三氯乙酸可以与微量蛋白质缔合形成缔合微粒，并且此微粒的浓度在一定条件下与共振散射光强度呈正比关系的原理，用三氯乙酸缔合酵母蛋白酶A与底物酪蛋白反应前后溶液中的蛋白质，测定468nm下的光强，从而可以用酪蛋白的降解量来表示蛋白酶A活性的高低。
具体的操作步骤是：
a.试剂的制备
酪蛋白溶液：0.25g酪蛋白用60mL 6mol/LHCl加热、超声溶解，加Gly-HCl缓冲液，使其终浓度为0.1mol/L，用饱和NaOH溶液调节pH到3，定容到250mL，中速滤纸过滤。
三氯乙酸溶液(2.5mol/L)：408.48g三氯乙酸溶于蒸馏水，定容至1L，过滤。
b.酶液的制备
将150g酵母泥用300mLNa2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH6.5，离子强度1/15mol/L)室温下自溶24小时后，在冰浴中用石英砂研磨自溶液，过滤，离心，取上清液为粗酶液。
纯生啤酒100mL于4℃硫酸铵盐析(50％饱和度)2h，8000r/m离心20min，沉淀用水溶解并定容到50mL，离心取上清液即为粗酶液。
发酵液100mL于4℃硫酸铵盐析(50％饱和度)2h，8000r/m离心20min，沉淀用水溶解并定容到100mL，离心取上清液即为粗酶液。
c.催化反应
在10mL小试管中加入0.1mL粗酶液，再加入0.1％酪蛋白溶液(pH＝3)1mL，混匀，40℃反应20min，加入2mL 2.5mol/L三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，混匀，缔合20min。
空白为在酶液中先加2mL2.5mol/L的三氯乙酸中止20min后，再加入酪蛋白溶液，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，反应20min。
d.共振光强度测定
设定荧光分光光度计的发射光和激发光波长均为468nm，狭缝均为2nm，对上述反应液进行读数。
e.绘制标准曲线及酶活计算
在10支10mL小试管中分别加入0.1％酪蛋白溶液(pH＝3)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，再加入2mL 2.5mol/L三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，混合均匀，40℃反应20min。设定荧光分光光度计的发射光和激发光波长均为468nm，狭缝均为2nm，对上述反应液进行读数。以酪蛋白浓度为横坐标，以共振光光强度为纵坐标作图，得到标准曲线。
根据样品的共振光强度值，在标准曲线上可以读出对应降解的酪蛋白质量，然后将其换算成酶活。
酶活的定义：在40℃，pH为3的条件下，1min内降解1μg酪蛋白的酶量定义为一个酶活单位(U)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：实验证明此种测定方法检测限低、灵敏度好、稳定性高、线性范围宽、受干扰物影响小，并且快速简便、检测成本低，可以满足测定发酵液和啤酒中微量蛋白酶A酶活的要求，具有较大潜力。
附图说明
图1为共振光散射法测定蛋白酶A活性标准曲线。
具体实施方式
实施例1：测定酵母的蛋白酶A分泌量
将0.25g酪蛋白用60mL 6mol/LHCl加热、超声溶解，加Gly-HCl缓冲液，使其终浓度为0.1mol/L，用饱和NaOH溶液调节pH到3，定容到250mL，中速滤纸过滤，即为酪蛋白溶液。将408.48g三氯乙酸溶于蒸馏水，定容至1L，过滤，即为2.5mol/L三氯乙酸溶液。将150g酵母泥用300mLNa2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH6.5，离子强度1/15mol/L)室温下自溶24小时后，在冰浴中用石英砂研磨自溶液，过滤，离心，取上清液为粗酶液。
在10mL小试管中加入0.1mL粗酶液，再加入0.1％酪蛋白溶液(pH＝3)1mL，混匀，40℃反应20min，加入2mL 2.5mol/L三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，混匀，缔合20min。空白为在酶液中先加2mL2.5mol/L的三氯乙酸中止20min后，再加入酪蛋白溶液，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，反应20min。
设定荧光分光光度计的发射光和激发光波长均为468nm，狭缝均为2nm，对上述反应液进行读数。
在10支10mL小试管中分别加入0.1％酪蛋白溶液(pH＝3)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，再加入2mL 2.5mol/L三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，混合均匀，40℃反应20min。设定荧光分光光度计的发射光和激发光波长均为468nm，狭缝均为2nm，对上述反应液进行读数。以酪蛋白浓度为横坐标，以共振光光强度为纵坐标作图，得到标准曲线。根据样品的共振光强度值，在标准曲线上可以读出对应降解的酪蛋白质量，然后将其换算成酶活。
酶活的定义：在40℃，pH为3的条件下，1min内降解1μg酪蛋白的酶量定义为一个酶活单位(U)。
表1 同一酵母不同培养时间蛋白酶A分泌量检测结果
实施例2：测定纯生啤酒中蛋白酶A含量
将0.25g酪蛋白用60mL 6mol/LHCl加热、超声溶解，加Gly-HCl缓冲液，使其终浓度为0.1mol/L，用饱和NaOH溶液调节pH到3，定容到250mL，中速滤纸过滤，即为酪蛋白溶液。将408.48g三氯乙酸溶于蒸馏水，定容至1L，过滤，即为2.5mol/L三氯乙酸溶液。纯生啤酒100mL于4℃硫酸铵盐析(50％饱和度)2h，8000r/m离心20min，沉淀用水溶解并定容到50mL，离心取上清液即为粗酶液。
在10mL小试管中加入0.1mL粗酶液，再加入0.1％酪蛋白溶液(pH＝3)1mL，混匀，40℃反应20min，加入2mL 2.5mol/L三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，混匀，缔合20min。空白为在酶液中先加2mL2.5mol/L的三氯乙酸中止20min后，再加入酪蛋白溶液，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，反应20min。
设定荧光分光光度计的发射光和激发光波长均为468nm，狭缝均为2nm，对上述反应液进行读数。
在10支10mL小试管中分别加入0.1％酪蛋白溶液(pH＝3)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，再加入2mL 2.5mol/L三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，混合均匀，40℃反应20min。设定荧光分光光度计的发射光和激发光波长均为468nm，狭缝均为2nm，对上述反应液进行读数。以酪蛋白浓度为横坐标，以共振光光强度为纵坐标作图，得到标准曲线。根据样品的共振光强度值，在标准曲线上可以读出对应降解的酪蛋白质量，然后将其换算成酶活。
酶活的定义：在40℃，pH为3的条件下，1min内降解1μg酪蛋白的酶量定义为一个酶活单位(U)。
表2 不同纯生啤酒样品中蛋白酶A酶活检测结果
实施例3：测定发酵液中蛋白酶A含量
将0.25g酪蛋白用60mL 6mol/LHCl加热、超声溶解，加Gly-HCl缓冲液，使其终浓度为0.1mol/L，用饱和NaOH溶液调节pH到3，定容到250mL，中速滤纸过滤，即为酪蛋白溶液。将408.48g三氯乙酸溶于蒸馏水，定容至1L，过滤，即为2.5mol/L三氯乙酸溶液。发酵液100mL于4℃硫酸铵盐析(50％饱和度)2h，8000r/m离心20min，沉淀用水溶解并定容到100mL，离心取上清液即为粗酶液。
在10mL小试管中加入0.1mL粗酶液，再加入0.1％酪蛋白溶液(pH＝3)1mL，混匀，40℃反应20min，加入2mL 2.5mol/L三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，混匀，缔合20min。空白为在酶液中先加2mL2.5mol/L的三氯乙酸中止20min后，再加入酪蛋白溶液，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，反应20min。
设定荧光分光光度计的发射光和激发光波长均为468nm，狭缝均为2nm，对上述反应液进行读数。
在10支10mL小试管中分别加入0.1％酪蛋白溶液(pH＝3)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，再加入2mL 2.5mol/L三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐到5mL，混合均匀，40℃反应20min。设定荧光分光光度计的发射光和激发光波长均为468nm，狭缝均为2nm，对上述反应液进行读数。以酪蛋白浓度为横坐标，以共振光光强度为纵坐标作图，得到标准曲线。根据样品的共振光强度值，在标准曲线上可以读出对应降解的酪蛋白质量，然后将其换算成酶活。
酶活的定义：在40℃，pH为3的条件下，1min内降解1μg酪蛋白的酶量定义为一个酶活单位(U)。
表3 不同原麦汁浓度发酵液样品中蛋白酶A酶活检测结果
Claims (1)
1.一种测定酵母蛋白酶A活性的方法，其特征是：根据三氯乙酸可以与微量蛋白质缔合形成缔合微粒，并且此微粒的浓度在一定条件下与共振散射光强度呈正比关系的原理，用三氯乙酸缔合酵母蛋白酶A与底物酪蛋白反应前后溶液中的蛋白质，用荧光分光光度计测定其光强，根据反应前后测得的酪蛋白降解量得到酵母蛋白酶A的活性；该方法包括下列步骤：
a.试剂的制备
酪蛋白溶液：用酸性缓冲溶液配制一定浓度的酪蛋白溶液，为保证溶液澄清，可对溶液进行过滤处理；
三氯乙酸溶液：一定质量的三氯乙酸溶于蒸馏水，定容；
b.酶液的制备
将一定质量的酵母泥用缓冲液进行自溶，离心，取上清液为粗酶液；
一定体积纯生啤酒或发酵液用硫酸铵盐析，离心，沉淀用水溶解并定容，离心，取上清液即为粗酶液；
c.催化反应
在试管中加入粗酶液，再加入酪蛋白溶液，混匀，一定温度反应一定时间后，加入三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐，混匀，缔合一定时间；
空白为在酶液中先加入三氯乙酸中止一定时间后，再加入酪蛋白溶液，加蒸馏水将体系体积补齐；
d.共振光强度测定
设定荧光分光光度计的发射光波长、激发光波长以及狭缝，对上述反应液进行读数；
e.绘制标准曲线及酶活计算
在试管中分别加入不同浓度的酪蛋白溶液，再加入三氯乙酸，加蒸馏水将体系体积补齐，混合均匀，一定温度下反应一定时间。设定荧光分光光度计的发射光波长、激发光波长以及狭缝，对上述反应液进行读数，以酪蛋白浓度为横坐标，以共振散射光强度为纵坐标作图，得到标准曲线；
根据样品的共振散射光强度值，在标准曲线上可以读出对应降解的酪蛋白质量，然后将其换算成酶活；
酶活的定义：在一定温度和pH条件下，一定时间内降解一定质量的酪蛋白的酶量定义为一个酶活单位。
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